2023, Vol. 47
文章信息
- 张梦琳, 马宏姝, 祝清松, 李珂, 王文琪, 陈师勇. 2023.
- ZHANG Meng-lin, MA Hong-shu, ZHU Qing-song, LI Ke, WANG Wen-qi, CHEN Shi-yong. 2023.
- 创伤弧菌内膜脂蛋白MFP4的克隆、表达及细胞定位研究
- Cloning, expression, and cellular localization of lipoprotein MFP4 in Vibrio vulnificus
- 海洋科学, 47(1): 45-53
- Marina Sciences, 47(1): 45-53.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20220406002
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文章历史
- 收稿日期：2022-04-06
- 修回日期：2022-05-21
2. 青岛农业大学实验室管理中心, 山东 青岛 266109
2. Laboratory Management Center, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种分布极广的生存于海洋与河口环境中的嗜盐、杆状、运动活泼、弯曲、部分菌株具有荚膜的革兰氏阴性海洋致病菌[1]。水产动物感染创伤弧菌后可导致严重减产, 造成较大的经济损失[1-2]。沿海地区常有报道因为生食海鲜, 或者伤口接触了带菌的海水, 或海洋动物被创伤弧菌感染的病例, 临床症状主要表现为胃肠炎、伤口感染和败血症, 其致死率超过50%, 但其感染和致病机制目前还没有明确的研究结果[3-5]。
细菌脂蛋白是一类典型的膜锚定蛋白, 包含脂质部分和蛋白部分[6]。细菌脂蛋白参与了细菌的细胞膜合成、细胞分裂, 信号转导、黏附、抗生素耐药性、物质转运和蛋白质折叠以及病原菌入侵宿主、逃避宿主防御等生理功能, 是病原菌在复杂环境中生存和致病过程不可或缺的毒力因子, 对细菌生存和致病具有极其重要意义[6-8]。成熟的脂蛋白通常通过N-末端半胱氨酸上修饰的脂基团定位在细胞质膜或者外膜上, 其生理功能的正常发挥与在细胞膜上的正确定位密切相关。
革兰氏阴性菌中负责细胞内成熟脂蛋白转运的是Lol系统[9-10], 该蛋白转运系统由LolA-E 5个部分组成[11]。在以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌中, N-末端第二位的天冬氨酸Asp是脂蛋白的内膜滞留信号[12]。当成熟脂蛋白N-末端第二位残基为Asp时, 脂蛋白不被Lol系统转运子识别, 其最终定位在细胞内膜上, 这称为“+2规则”。如一个外膜特异性脂蛋白在+2位上用Asp取代原有的氨基酸时, 该脂蛋白则在内膜积累[13]。
本课题组在之前的研究中, 建立了细菌外膜小体分析法研究创伤弧菌脂蛋白在生物合成后的细胞定位[14]。我们发现创伤弧菌致病因子MFP4脂蛋白的+2位的氨基酸为甘氨酸, 与保守的革兰氏阴性菌外膜脂多糖转运蛋白LptE的+2位氨基酸相同, 但是其生理功能的正常发挥却要求其具有细胞内膜定位。为实验验证创伤弧菌脂蛋白的分泌规律, 本文对脂蛋白MPF4进行了基因克隆、创伤弧菌内过表达及细胞定位研究。为确定该脂蛋白的细胞定位信息是否包含在成熟蛋白N端的短序列内, 我们利用MFP4基因N端序列、与MFP4有相同+2位氨基酸的LptE的N端序列, 分别与红色荧光蛋白合成了重组融合脂蛋白, 经创伤弧菌表达后研究其细胞定位。本研究为揭示海洋环境来源的创伤弧菌中细菌脂蛋白的特殊分泌定位规律打下基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料创伤弧菌MO6-24/O菌株、大肠杆菌DH5α菌株及SM10菌株的培养根据实验要求分别采用SOC培养基、LB液体培养基及固体培养基进行培养。重组质粒载体pSCT32、pSCT53由本实验室制备及保存[14-15], 其他常规PCR及电泳等试剂除特别指出均从上海生工采购。
1.2 实验方法 1.2.1 重组质粒的构建将创伤弧菌MO6-24/O过夜培养物用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA, 利用引物MFP4 tether-fwd(CACACAGGAAACAGA CCATATGAATAAATGGATTGGTTTAACC)及MFP4-rev(GCTCCTGAACCCCCGGGCTCATTGTTCGCCTCCTGAG)扩增MFP4基因。扩增的PCR反应程序为: 95 ℃, 2 min; 95 ℃, 20 s; 60 ℃, 20 s 31次循环; 72 ℃1 min; 72 ℃, 5 min。MFP4或LptE的N端片段与红色荧光蛋白RFP的融合脂蛋白基因(MFP4 tether-RFP/LptE tether-RFP)片段则是先用以基因组DNA为模板, 用TransStart FastPfu DNA Polymerase扩增得到MFP4或LptE蛋白N端基因片段, 再从pSCT32质粒[15]上克隆RFP基因片段, 利用两个基因片段上设计的同源区域进行PCR融合获得融合基因。扩增的PCR反应程序同上, 使用引物为MFP4 tether-rev(GAACTCCTTGATGACGTCCAAAGCGGCTGGCTGATT)、LptEtether-fwd(CACACAGGAAACAGACC ATATGCGTTTTACGTCCGTG)、LptE tether-rev(GAA CTCCTTGATGACGTCGGAGTACTCACCACGTAAAT)、RFP-fwd(GACGTCATCAAGGAGTTC)及RFPBglII-rev(TGGTACCAGATCTTAGTGATGGTGATGATGATG)。MFP4基因片段、MFP4 tether-RFP或LptE tether-RFP融合基因产物进行琼脂糖凝胶电泳检测后, 利用质粒载体及PCR产物携带的NdeI及BglII酶切位点, 将二者分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接, 最终将融合基因片段克隆至pSCT32质粒的trc启动子及下游阅读框C末端Histag多肽序列之间。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后, 在含有终浓度为34 μg/mL的氯霉素平板培养12~16 h。挑取转化平板上长出的单菌落进行PCR鉴定, 挑选阳性克隆送测序公司测序确认。
基因定点突变使用全式金公司基因定点突变试剂盒, 设计LptE基因+2为氨基酸Gly→Asp突变引物(LptEG2D-fwd, GTCTGCATGTGATTTTCATTTACGT GGTGAGTACTC; LptE G2D-rev, ATGAAAATCACA TGCAGACAACATGGC), 利用引物以LptE thether-RFP的表达质粒为模板, 按照试剂盒说明进行操作, 通过PCR引入点突变, 筛选得到的重组大肠杆菌提取质粒后送测序公司进行序列验证。
1.2.2 通过细菌接合获得重组创伤弧菌将测序验证正确的重组质粒转化到大肠杆菌SM10作为供体菌, 过夜培养供体大肠杆菌SM10及受体创伤弧菌进行接合反应, 涂布在含有终浓度为34 μg/mL的氯霉素和终浓度为12.5 μg/mL的黏菌素的双抗LB固体平板上30 ℃培养箱中过夜培养; 第二天挑取单菌落, 接种到含有氯霉素和黏菌素的LB液体培养基中, 放置摇床培养至浑浊。取菌液进行显微镜检测观察细菌形态, 进一步利用一对质粒上特有的引物(TrcLacO-fwd, TGCGCCGACATCATAACG; pTrcHis-rev, GATTTAATC TGTATCAGG)做菌液PCR确认质粒的存在, 最终确定质粒接合成功的重组创伤弧菌。
1.2.3 创伤弧菌中重组蛋白的诱导表达及检测重组创伤弧菌从保种管中接种到含有氯霉素和粘菌素的5 mL的LB液体培养基中, 30 ℃摇床过夜活化。次日将菌液按照1%接种量加入到含有双抗的10 mL LB培养基中, 至OD600=0.5时, 在菌液中加入IPTG, 使终浓度为0.1 mmol/L, 分别在2、5、8 h取出1 mL菌液到离心管中, 离心沉淀菌体。菌体沉淀制备电泳样品进行SDS-PAGE电泳, 结束后一块蛋白胶进行考马斯亮蓝染色, 另一块用于免疫蛋白印迹法(Western Blotting)实验。
免疫蛋白印迹法步骤简要如下: 使用伯乐(Trans-Blot SD Cell)蛋白半干电转仪, 以每平方厘米1.5 mA的电量将蛋白转到PVDF膜上; 用25 mg/mL的牛血清白蛋白溶液(以TBST为溶剂)封闭PVDF膜一个小时; 用TBST溶液洗膜后, HisProbe-HRP探针(Thermo公司)溶液覆盖膜1 h; TBST溶液洗膜后, 将ECL底物覆膜5 min, 放置于化学发光成像仪(Fluor Chem FC3, Protein Simple公司)中曝光成像。
1.2.4 创伤弧菌中重组蛋白的亚细胞定位创伤弧菌中重组蛋白的亚细胞定位采用实验室建立的外膜小体(OMV)分离鉴定法[14], 将诱导完成后的菌液进行离心, 上清装入处理好的透析袋中, 利用PEG20000浓缩透析袋中液体, 浓缩后的液体过滤除菌后4 ℃ 15 000 g离心2 h, 即获得OMV外膜小体沉淀。获得细菌外膜小体后, 加入适量的2×SDS蛋白上样缓冲液(loading buffer), 在沸水中煮沸5 min, 制备电泳样品进行SDS-PAGE检测。根据电泳考马斯亮蓝染色结果调整菌体及OMV样品中外膜蛋白OmpU上样量处于同一水平, 进行免疫蛋白印迹法检测, 如重组蛋白在OMVs样品中存在则表明目的蛋白定位于细菌外膜。
2 实验结果与分析 2.1 MFP4基因的序列分析及基因克隆本课题组在之前利用外膜小体分析法研究创伤弧菌脂蛋白生物合成后细胞定位时, 发现创伤弧菌外膜脂蛋白IlpA的N端+2位氨基酸突变为天冬氨酸(D)后, 其突变的脂蛋白IlpA(G2D)仍然能够分泌到细胞外膜OM上(见图 1序列分析)[14]。该现象表明, 海洋环境中的创伤弧菌中的脂蛋白致病因子分泌有其特殊规律, 部分脂蛋白的分泌不符合革兰氏阴性菌脂蛋白分泌的“+2规则”。
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| 图 1 创伤弧菌成熟脂蛋白N端序列的对比及其细胞定位 Fig. 1 Comparison of the N-terminal sequences and cellular localization of V. vulnificus mature lipoproteins |
为进一步研究创伤弧菌中特殊的脂蛋白分泌规律, 我们分析基因组中预测的脂蛋白序列, 发现了其中一个+2位的氨基酸为甘氨酸的疑似内膜脂蛋白MFP4(基因编号VVMO6_01820)。从图 2可以看出, 该蛋白在N端第19位是半胱氨酸(C), 1—18位则是典型的细菌脂蛋白信号肽。其中, 1—3位氨基酸是带正电荷的N区; 1—15位氨基酸是疏水性H区; 而16—19位的LAGC是典型的“lipobox”区域[6]。蛋白同源比较发现MPF4蛋白33—354位氨基酸(带虚下划线区域)为保守的RND(Resistance-Nodulation-Division)结构。RND家族的大多数成员都来自于革兰氏阴性菌, 蛋白参与的功能包括结瘤、吖啶黄抗药性、重金属外流和多药耐药蛋白等[16-17]。该类蛋白通常通过锚定在细胞内膜而实现其生理功能, 它们能够连接内外膜将底物分子运输到细胞外膜的外侧。然而, MFP4脂蛋白的N端序列+2位为甘氨酸(G), 与之前本实验室已经验证的内膜脂蛋白MFP+2位的天冬氨酸(D)不同(见图 1)[14]。因此, MFP4蛋白N端序列决定的细胞内膜定位不遵循革兰氏阴性菌的“+2规则”, 需要进一步通过实验检验其细胞定位, 明确其N端序列是否真正携带细胞内膜滞留信号。
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| 图 2 MFP4蛋白序列分析 Fig. 2 Sequence analysis of the MFP4 lipoprotein sequence |
我们利用设计的引物对MFP4基因进行PCR扩增, 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测, 结果如图 3所示, MFP4的大小1 083 bp, 符合理论值。进一步将扩增出来的基因克隆至实验室构建的质粒pSCT32[15]的trc启动子后, 获得了诱导型的MFP4基因过表达(trc-mfp4-histag)载体, 命名为pSCT123。质粒进行单酶切(NdeI)和双酶切(NdeI + BglII)后电泳, 各条带大小正确。将质粒送公司进行测序, 测序结果与基因组数据进行比对, 序列一致, 确认基因克隆成功。
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| 图 3 MFP4基因PCR产物及pSCT123重组质粒酶切验证电泳图 Fig. 3 Electrophoresis of the MFP4 gene PCR product and the pSCT123 plasmid |
将质粒pSCT123转化到接合大肠杆菌SM10中后, 与创伤弧菌进行细菌接合将质粒导入创伤弧菌中。从抗性平板上挑选的重组创伤弧菌单菌落进行液体培养, 显微镜下观察确定为创伤弧菌。并用质粒上特有的引物做菌液PCR, 结果如图 4a所示。3株挑选的菌株均为PCR阳性, 表明细菌接合实验成功。将创伤弧菌重组菌株液体培养并进行IPTG诱导表达后, 收获菌体进行SDS-PAGE及以抗Histag的Hisprobe-HRP螯合物为一抗进行免疫蛋白印迹法实验, 结果如图 4所示。重组蛋白诱导后SDS-PAGE没有能看到明显的诱导蛋白条带, 但是免疫蛋白印迹法结果显示表达的目的蛋白随时间增长而增加, 8 h能检测到明显的信号, 其大小约为39.5 kD, 与预计分子量相符。
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| 图 4 MFP4融合蛋白在创伤弧菌中的表达 Fig. 4 Expression of the MFP4 fusion protein in Vibrio vulnificus |
实验采用脂蛋白定位外膜小体鉴定法确定创伤弧菌中重组蛋白的亚细胞定位[14], 细胞外膜定位的蛋白能够在分离的外膜小体OMV样品检测到信号, 而由于OMV极少包含细胞内膜成份, 定位于细胞内膜的脂蛋白则在免疫蛋白印迹法中无信号。按实验方法培养重组创伤弧菌及诱导重组脂蛋白8 h, 离心菌体, 从上清中分离纯化创伤弧菌外膜小体。制备蛋白电泳样品, 根据蛋白电泳中的外膜蛋白OmpU含量来调整各重组菌株及外膜小体上样量处于同一水平, 进行免疫蛋白印迹法检测, 通过蛋白信号分析外膜小体的定位。结果如图 5所示。
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| 图 5 免疫蛋白印迹法验证分离蛋白的细胞定位 Fig. 5 Verification of cell localization of the lipoproteins by western blotting |
细胞定位实验选取了定位已知的保守脂蛋白MFP为内膜定位阳性对照, 脂蛋白BamD为外膜定位阳性对照[14](序列比较见图 1)。从图 5结果可以看出, 3个表达重组脂蛋白MFP、BamD及MFP4的重组菌株诱导后的全菌样品免疫蛋白印迹法信号正常。内膜定位对照重组表达MFP创伤弧菌分离的外膜小体OMV样品无信号, 而表达BamD创伤弧菌分离的外膜小体OMV样品信号明显, 证明了利用OMV进行脂蛋白定位的可靠性。待鉴定的重组脂蛋白MFP4表达菌株的外膜小体样品与全菌样品及内外膜脂蛋白对照相比, 免疫蛋白印迹没有信号, 可以确定该重组MFP4脂蛋白在细胞合成后被转运定位于细胞内膜。
细菌脂蛋白的细胞定位多由其成熟蛋白N端的短肽(tether)来决定的, 但部分膜蛋白的膜定位却由其蛋白质三级结构形成疏水区域决定的。因此, 为确认MFP4的细胞定位是否由其成熟蛋白N端带脂基团的短肽决定, 我们制备由MFP4脂蛋白N端与红色荧光标签蛋白(RFP)融合的重组脂蛋白MFP4 tether-RFP并确定其细胞定位。
2.3 MFP4 tether-RFP融合基因的合成及在创伤弧菌中的表达和定位研究利用设计的引物分别克隆MFP4脂蛋白N端包含信号肽的26个氨基酸短肽及RFP蛋白的基因序列, 然后通过片段融合PCR合成了MFP4 tether-RFP融合基因(见图 1), 将该基因片段克隆至质粒载体pSCT32上, 获得新重组质粒命名为pSCT52。测序验证重组质粒构建成功后, 将质粒pSCT52转化大肠杆菌SM10, 与创伤弧菌进行细菌接合将质粒导入创伤弧菌中。筛选重组创伤弧菌菌株, 进行液体培养及蛋白诱导表达。收获菌体进行SDS-PAGE及以抗Histag的Hisprobe-HRP螯合物为一抗进行Western Bloting实验, 结果如图 6所示。
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| 图 6 MFP4 tether-RFP融合基因在创伤弧菌中表达 Fig. 6 Expression of the MFP4 tether-RFP fusion gene in Vibrio vulnificus |
免疫蛋白印迹法结果显示, 与未诱导作为对照, 诱导2 h、5 h、8 h均有信号, 信号逐渐增强, 重组融合脂蛋白在创伤弧菌中成功表达。将融合脂蛋白MFP4 tether-RFP表达菌株与另一个已知外膜定位的融合脂蛋白IlpA tether-RFP(见图 1序列)的创伤弧菌表达菌株[15]同时培养及进行外膜小体OMV分离, 获取全菌诱导样品、外膜小体OMV样品进行蛋白胶电泳, 然后进行免疫蛋白印迹法检测, 结果如图 7所示。
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| 图 7 免疫蛋白印迹法验证重组融合蛋白在创伤弧菌中定位情况 Fig. 7 Verification of cell localization of the fusion lipoprotein by Western blotting |
结果显示已知外膜定位的IlpA tether-RFP融合脂蛋白在分离的OMV样品中有明显信号, 其准确定位于创伤弧菌细胞外膜上, 而重组创伤弧菌(MFP4 tether-RFP)的外膜小体OMV与菌体样品相比几乎不含有该重组脂蛋白的信号。因此, MFP4 tether-RFP重组融合脂蛋白在成熟脂蛋白合成后滞留于细胞内膜, 说明MFP4脂蛋白的N端序列携带信息决定了该脂蛋白的细胞内膜定位信息, 即使N端后的蛋白主体发生较大改变仍然不改变其细胞定位。
2.4 具有+2位Gly的LptE tether-RFP融合脂蛋白定位研究我们可以看到, 虽然MFP4成熟脂蛋白的N端+2位氨基酸是甘氨酸Gly, 而不是同MFP那样具有革兰氏阴性菌内膜脂蛋白典型内膜信号+2的天冬氨酸D(见图 1), 但其仍然定位在细胞内膜。那么, +2位的Gly是否对脂蛋白的内膜定位有决定性作用呢？为回答该问题, 我们需要更多的实验证据。已知保守的脂多糖转运蛋白LptE脂蛋白定位于外膜, 其N端+2位也是Gly[14]。因此, 本实验制备LptE tether-RFP融合脂蛋白基因, 该成熟蛋白与MFP4 tether-RFP将仅有+2位后8个氨基酸的差异(见图 1序列), 并且我们将制备该融合蛋白+2位突变为Asp的突变体LptE(G2D) tether-RFP, 考察两个融合蛋白的细胞定位。
获得LptE tether-RFP融合脂蛋白及突变体LptE(G2D) tether-RFP的表达质粒后, 通过细菌接合获得含表达质粒的创伤弧菌, 进行重组脂蛋白的诱导表达。从图 8看出, 两个重组融合脂蛋白的表达随时间增加信号逐渐增强, 8 h检测到较强信号。分离两重组融合脂蛋白表达菌株的外膜小体OMV、诱导后全菌样品进行免疫蛋白印迹法检测, 结果如图 9所示。
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| 图 8 LptE tether-RFP融合基因在创伤弧菌中的表达 Fig. 8 Expression of the LptE tether-RFP protein in Vibrio vulnificus |
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| 图 9 免疫蛋白印迹法验证重组融合蛋白在创伤弧菌中定位情况 Fig. 9 Verification of the cell localization of the fusion lipoprotein by Western blotting |
结果显示, 利用已知外膜定位LptE的N端序列合成的LptE tether-RFP融合脂蛋白在分离的OMV样品中有明显信号, 而突变体LptE(G2D) tether-RFP表达菌株的外膜小体OMV中几乎不含有该重组脂蛋白的信号。因此, 外膜脂蛋白LptE的N端序列携带外膜定位信息, 它与RFP合成的LptE tether-RFP融合脂蛋白可以准确定位于创伤弧菌细胞外膜上。LptE tether-RFP与MFP4 tether-RFP的成熟脂蛋白仅有+2位Gly之后的8个氨基酸的差异(见图 1序列), LptE tether-RFP具有+2位Gly却不像MFP4 tether-RFP那样停留在细胞内膜, 其突变为Asp后却滞留于细胞内膜, 说明+2位的Gly不能决定脂蛋白的内膜定位, 而LptE tether-RFP突变为经典内膜滞留信号Asp后效果等同于将其+2位Gly之后8个氨基酸短肽改变为MFP4 tether-RFP中的对应氨基酸序列(见图 1序列)。由此可以得出结论, MFP4脂蛋白的内膜定位应当由其+2位以后的其他氨基酸序列来决定。
3 讨论在大肠杆菌中, 细菌脂蛋白前体经过磷脂酰甘油转移酶(Lgt)、脂蛋白信号肽酶II(LspA)和脂蛋白酰基转移酶(Lnt)3种酶最终加工合成为成熟三酰化脂蛋白[11]。细菌脂蛋白N末端第二氨基酸(+2)对于脂蛋白的转运及膜定位十分重要。当+2位氨基酸为天冬氨酸Asp时, 该脂蛋白则滞留在细胞内膜上, 而当天冬氨酸突变为其他氨基酸时, 该脂蛋白将被分泌到细胞外膜, 这个规则被称为脂蛋白转运的“+2规则”[6, 12-13]。
最近有研究指出, 脂蛋白N端序列残基形成一个扭结, 紧密贴合在脂蛋白内膜转运子LolCDE形成的带有前开口的疏水口袋中, 表明脂蛋白N端肽必须采用一种与口袋互补的结构。因此, LolCDE是否捕获或排斥脂蛋白, 即脂蛋白分泌到外膜或是内膜, 将取决于脂蛋白N端肽的序列和折叠的组合效应, 以及转运蛋白LolCDE中肽调节袋的形状和表面性质[18]。
我们在分析创伤弧菌脂蛋白组序列时发现, MFP4蛋白的成熟脂蛋白N端序列为CGQQNQPA-, 其中的+2位是甘氨酸Gly, 按已知革兰氏阴性菌“+2规则”它应当分泌到细胞外膜, 但是该类膜定位蛋白却是需要定位于细胞内膜而实现其生理功能的。因此, 我们推测创伤弧菌中部分脂蛋白分泌规则不完全符合大肠杆菌中的“+2规则”。我们在之前的研究中发现, 表面展示脂蛋白IlpA+2位氨基酸突变为天冬氨酸后没有停留在细胞内膜上, 也说明创伤弧菌中脂蛋白的分泌有其特殊规律, 这个规律与创伤弧菌的脂蛋白转运子LolCDE的特异性结构应当有关。
为验证MFP4蛋白的细胞定位, 我们克隆了创伤弧菌MFP4基因, 构建了重组脂蛋白表达质粒pSCT123, 并在创伤弧菌中表达了重组蛋白MFP4。利用分离外膜小体样品的方法, 对重组表达的MFP4进行细胞定位检测, 发现在创伤弧菌中MFP4蛋白定位于细胞内膜。革兰氏阴性菌的脂蛋白分泌研究发现, 脂蛋白的细胞定位都由N端起始的一段短的无序肽段(tether)来决定[12]。因此我们需要研究, MFP4脂蛋白的细胞定位规律是否与其他细菌中的分泌脂蛋白一样, 都由其N端的短无序肽段决定。本研究合成了新的脂蛋白基因MFP4 tether-RFP, 该融合蛋白即相当于将脂蛋白MFP4的C端蛋白主体换为红色荧光蛋白, 消除了蛋白主体对蛋白膜定位的影响。在创伤弧菌成功表达后, 我们定位该融合脂蛋白于细胞内膜。因此, 我们可以得出结论, MFP4蛋白N端短肽包含了创伤弧菌内膜定位的信号, 该信号与大肠杆菌的内膜滞留信号不同。同时, LptE tether-RFP融合脂蛋白及其突变体LptE(G2D) tether-RFP的实验数据说明, +2位的Gly不能决定脂蛋白的内膜定位, MFP4的内膜定位应当由其+2位以后的其他序列来决定的。
文献报道[19], 铜绿假单胞菌的MexA也是一种参与多药外排的内膜特异性脂蛋白, 其成熟脂蛋白位置+2位为甘氨酸。通过构建包含MexA不同区域和外膜脂蛋白OprM的嵌合脂蛋白, 并分析它们的膜定位, 发现位置3和4处的Lys和Ser对MexA在铜绿假单胞菌中的内膜定位至关重要。与广泛接受的大肠杆菌脂蛋白的“+2规则”相反, 实验表明铜绿假单胞菌部分脂蛋白有一个不同的“+3, + 4法则”, 即脂蛋白的最终目的地由位置3和4处的残基决定。细菌的蛋白质分泌是复杂的, 不是简单地通过一种Lol信号系统对所有脂蛋白进行识别和分泌[20]。我们通过实验证明了创伤弧菌中部分脂蛋白分泌不完全符合大肠杆菌中的“+2规则”, 是一种新的细菌脂蛋白定位机制, 需要进一步构建更多重组脂蛋白突变体进行研究。
研究人员发现, 细菌脂蛋白除了是重要的致病因子外, 还可以通过TLR2信号通路高效刺激宿主免疫反应, 是良好的疫苗开发对象[21-22]。而对于多种细菌脂蛋白分泌机制的进一步阐明, 不但有助于了解细菌基本的膜生物合成机制, 针对重要致病因子分泌过程进行新型药物筛选[23], 也是对抗和解决多重耐药菌的一种有效手段。
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