2023, Vol. 47
文章信息
- 程沁园, 马明, 严琳, 吴小瑜. 2023.
- CHENG Qin-yuan, MA Ming, YAN Lin, WU Xiao-yu. 2023.
- 壳寡糖延缓db/db小鼠自发性II型糖尿病发生发展的作用
- Chitooligosaccharides delay the course of type II diabetes mellitus in db/db mice
- 海洋科学, 47(1): 81-87
- Marina Sciences, 47(1): 81-87.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20210114001
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文章历史
- 收稿日期：2021-01-14
- 修回日期：2021-04-09
糖尿病(diabetes mellitus)是由于胰岛素生成缺陷或/和作用缺陷而引起的血糖水平超高[1], 其中90%以上均为II型糖尿病。目前尚未完全探明糖尿病的发病机理, 主要的影响因素包括遗传、生活方式、环境、免疫等[2]。db/db小鼠属遗传性肥胖II型糖尿病动物模型, 其发病与瘦素基因有关, 小鼠出现典型的“三多一少”症状, 可用于研究II型糖尿病血脂紊乱的研究和多种抗糖尿病物质的筛选[3]。从糖代谢正常发展成糖尿病之间有一过渡状态, 即糖尿病前期(prediabetes), 包括糖耐量受损(impaired glucose tolerance, IGT)和空腹血糖受损(impaired fasting glucose, IFG), 中国20岁以上人群中糖尿病前期比例高达15.5%[4]。糖尿病前期并不是疾病状态, 而是可发展为显性糖尿病、亦可维持原样、还可恢复正常的一种不稳定的过渡状态[5]。糖尿病前期是一个可逆的过程, 对该人群进行早期干预, 可使II型糖尿病发病危险降低58%[4], 因此选择合适化合物对其进行干预具有重要的研究意义。
壳寡糖(chitooligosaccharides, COS)是来源于甲壳类动物的壳聚糖(chitosan)的部分水解产物, 其化学结构如图 1所示。COS与壳聚糖具有类似的生物活性, 如抗菌、抗肿瘤、抗炎、降低胆固醇、抗氧化等[6-12]。然而, COS因水解后的分子量大为降低, 水溶性大幅提高, 亦无显著毒副作用, 已被美国食品药品管理局(FDA)、欧盟食品安全局(EFSA)批准可用于饮食补充或作为新食品添加剂加入食品中[9], 在中国COS亦于2014年被认定为新资源食品。COS曾被报道具有降血糖的作用[13-15], 临床实验表明, COS显著改善了血糖水平、糖化血红蛋白、促炎细胞因子及脂联素水平[16]。然而, 由于COS活性受分子量和脱乙酰度等性质的影响较大, 各研究结论并不一致。同时关于COS对糖尿病前期的影响研究较少, 一般都是出现血糖异常后才开始服用COS, 对于其是否能预防或延缓糖尿病前期向糖尿病发展的作用有待研究。本研究利用db/db小鼠可自发发展成II型糖尿病, 在其幼年血糖仍保持正常水平时即给予一定剂量COS, 通过与对照组对比此后小鼠糖尿病病程发展情况, 探索COS对糖尿病的潜在影响。
40只db/db小鼠[SPF标准, 许可证号: SCXK(苏) 2016-0010], 雄性, 4周龄, 体重(24±2) g, 购买于常州卡文斯实验动物有限公司, 稳定饲养1周以适应环境。
1.2 材料与仪器壳寡糖(Mw=1 000 Da, 脱乙酰度90%), 浙江金壳药业股份有限公司, 生产批号M-KG-1809001。
血糖测定仪: 江苏鱼跃医疗设备股份有限公司, 型号306悦准II型; 血糖试纸: 江苏鱼跃医疗设备股份有限公司, 生产批号380224。
1.3 实验方法 1.3.1 动物分组及受试物剂量40只db/db小鼠随机平均分为4组, 每日按体重灌胃给药, 对照组小鼠灌胃10 mL/kg生理盐水0.2 mL; 壳寡糖低、中、高剂量组(COS-L、COS-M、COS-H)的灌胃剂量分别为250、500、1 000 mg/kg体重。连续给药16周, 各组小鼠均自由进食饮水。
1.3.2 指标观察1) 一般状况观察: 仔细观察并记录每日给药后各组小鼠的生存情况、活跃程度、尿量(垫料潮湿情况)等, 摄食量及饮水量每周记录一次。
2) 空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)和餐后2 h血糖(2-hour postprandial blood glucose, 2 h PG)测定[17]: 每周测定一次各组小鼠FBG和2 h PG。取禁食8 h的小鼠尾尖血滴于血糖试纸上, 血糖仪读数得FBG; 给各组小鼠补充饲料, 任其自由摄食2 h后撤走全部饲料, 2 h后再取其尾尖血测得2 h PG。
3) 口服葡萄糖耐量实验(oral glucose tolenrance test, OGTT)[18]: 本实验每4周进行一次。小鼠禁食8 h灌胃250 mg/kg体重的葡萄糖溶液, 计时开始, 测定0 h、0.5 h、1 h、2 h的血糖值, 记录并计算曲线下面积a(area under curve, Auc)。
式中, a为OGTT实验曲线下面积; f0为0 h测得的血糖值, mmol/L; f0.5为0.5 h测得的血糖值, mmol/L; f1为1 h测得的血糖值, mmol/L; f2为2 h测得的血糖值, mmol/L。
4) 糖尿病病程判断: db/db小鼠可按表 1标准判断其病程阶段。
| 血糖指标/(mmol·L–1) | 病程阶段 |
| f0 < 5.6且f2 < 7.8 | 血糖正常阶段 |
| 6.1≤ f0 < 7.0且f2 < 7.8 | 空腹血糖受损阶段(impaired fasting glucose, IFG) |
| 7.8≤ f2 < 11.1且f0 < 7.0 | 糖耐量受损阶段(impaired glucose tolerance, IGT) |
| f0 ≥ 7.0或f2 ≥ 11.1 | 糖尿病阶段 |
| 注: f0为空腹血糖值; f2为OGTT实验中灌胃葡萄糖后2 h测得的血糖值 | |
用SPSS13.0软件对数据进行计算与分析, 所得结果用x ± s表示, 采用t检验来检测组间差异。
2 结果与分析 2.1 一般状态观察适应期1周内, 各组db/db小鼠均增重显著, 毛色光亮, 身体状况良好。给药期间, 各组小鼠体重稳步上升, 但各组垫料潮湿程度各不相同: 对照组自第4周起垫料潮湿明显加重, 至第14周时每日已有1/2以上垫料潮湿, 需要每日更换, 说明对照组db/db小鼠排尿量较大; COS-L组垫料潮湿略有增加, 至第14周时每日约有1/5左右垫料潮湿; COS-M组和COS-H组垫料潮湿较少, 至第16周实验结束时每日垫料潮湿面积少于1/10。由此可见, 对照组小鼠逐步出现典型的“多尿”症状, COS组对此均有一定改善, 其中中、高剂量COS效果尤佳。
实验周期内, 对照组、COS-L和COS-M组各有1只db/db小鼠死亡, 分别在第15周、第15周和第13周, 这些小鼠在死亡前3~5周均出现消瘦、萎靡不振、运动量急剧较少等症状, 尸检发现对照组死亡小鼠的腹部完全未见脂肪组织, COS两组的死亡小鼠腹部仅有少量脂肪, 其他组织未发现有肉眼可见异常。
2.2 db/db小鼠的体重变化摄入COS对各组db/db小鼠体重的影响如图 2所示: 实验初期(0~2周), 各组db/db小鼠的体重均有显著增加, 且各组间无显著差别; 但第3周起可见COS各组体重增长高于对照组, 至第4周时COS各组小鼠平均体重已显著高于对照组(P < 0.05), 第5周起两者差异为极显著(P < 0.01)。由图 2可见, 对照组db/db小鼠自第7周起体重逐步下降, 显示糖尿病典型的“体重减少”症状; 但COS各组db/db小鼠体重基本保持稳定, 未见显著消瘦, 至实验结束时, COS低中高各剂量组小鼠体重分别为对照组的122.73%、126.09%和128.77%。因此COS对糖尿病体重减少症状有一定的缓解作用。
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| 图 2 摄入COS对db/db小鼠体重的影响 Fig. 2 The effect of COS on body weight of db/db mice 注: **表示与对照组相比P < 0.01, COS-L表示壳寡糖低剂量组, COS-M表示壳寡糖中剂量组, COS-H表示壳寡糖高剂量组 |
如图 3所示, 实验周期内, 不同剂量COS对db/db小鼠每日摄食量影响不大, 不具统计学差异。但COS对db/db小鼠每日饮水量影响较大, 自第3周起COS各组db/db小鼠每日饮水量始终极显著低于对照组(P < 0.01), 但该影响不具剂量依赖性, 至实验结束时, COS低中高各剂量组小鼠饮水量分别为对照组的63.91%、61.34%和63.09%, 即高中低各剂量COS均可改善db/db小鼠的“多饮”症状(图 4)。
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| 图 3 db/db小鼠摄食量的变化 Fig. 3 The change of food intake in db/db mice 注: COS-L表示壳寡糖低剂量组, COS-M表示壳寡糖中剂量组, COS-H表示壳寡糖高剂量组 |
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| 图 4 db/db小鼠饮水量的变化 Fig. 4 The change of water consumption in db/db mice 注: **表示与对照组相比P < 0.01, COS-L表示壳寡糖低剂量组, COS-M表示壳寡糖中剂量组, COS-H表示壳寡糖高剂量组 |
由图 5可见, 对照组db/db小鼠FBG上升很快, 第1周即达到(6.1±0.4) mmol/L, 进入IFG阶段; 第3周达到(9.8±3.7) mmol/L, 进入糖尿病阶段, 病程发展较为迅速, 至第16周时已达(24.7±5.1) mmol/L。COS对FBG控制见效快, 摄入一周后即可显著降低FBG(P < 0.05), 至第3~4周时各剂量已可极显著降低FBG(P < 0.01); 至第16周时, COS-L、COS-M、COS-H各组FBG分别为(14.6±2.3) mmol/L、(15.0± 2.3) mmol/L、(12.1±3.6) mmol/L, 分别较对照组降低了40.9%、39.3%和51.0%。
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| 图 5 摄入COS对db/db小鼠空腹血糖的影响 Fig. 5 The effect of COS on FBG of db/db mice 注: **表示与对照组相比P < 0.01, COS-L表示壳寡糖低剂量组, COS-M表示壳寡糖中剂量组, COS-H表示壳寡糖高剂量组 |
由图 6可见, 各组db/db小鼠2 hBG随时间稳步升高, 但对照组升高程度高于COS各组, COS-L组和COS-M组自第13周起极显著低于对照组(P < 0.01), COS-H组自第6周起显著低于对照组(P < 0.05)、自第9周起极显著低于对照组(P < 0.01)。16周实验结束时, 对照组db/db小鼠2 h BG为(30.2±2.5) mmol/L COS-L、COS-M、COS-H各组分别为(20.8±6.5) mmol/L、(22.9±5.9) mmol/L、(18.8±3.7) mmol/L, 分别较对照组降低了31.1%、24.2%和37.7%。
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| 图 6 摄入COS对db/db小鼠餐后2 h血糖的影响 Fig. 6 The effect of COS on 2 hBG of db/db mice 注: **表示与对照组相比P < 0.01, COS-L表示壳寡糖低剂量组, COS-M表示壳寡糖中剂量组, COS-H表示壳寡糖高剂量组 |
OGTT实验中各组AUC计算结果如图 7所示: COS降低AUC的作用十分迅速且极显著, 自第4周起各COS组的AUC即极显著的低于对照组(P < 0.01); 至实验结束时, COS低中高各剂量组AUC分别较对照组降低了20.55%、19.53%和20.87%, 即该作用无剂量依赖性。
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| 图 7 摄入COS对db/db小鼠AUC的影响 Fig. 7 The effect of COS on AUC of db/db mice 注: **表示与对照组相比P < 0.01, AUC表示口服葡萄糖耐量实验曲线下面积, COS-L表示壳寡糖低剂量组, COS-M表示壳寡糖中剂量组, COS-H表示壳寡糖高剂量组 |
国际糖尿病联盟的研究报告表明, 几乎所有的II型糖尿病患者发病前都要经过糖尿病前期阶段(IGT或IFG), 每年进展为糖尿病的转化率随着病程的延长而逐年升高[19]。糖尿病前期阶段是一可逆阶段, 此阶段的人群体内糖代谢、脂代谢等已开始处于代偿性紊乱状态, 是由正常人群向糖尿病患者过渡的阶段。因此, 作为预防II型糖尿病的最后一道防线, 对糖尿病前期人群进行及时有效的干预和治疗, 通过改变饮食习惯和增加体育锻炼, 并辅以必要的药物干预, 对延缓糖尿病前期向II型糖尿病转变, 减少相关并发症等有着非常重要的作用[20]。
db/db小鼠自发性II型糖尿病发展进程较快, 其摄入COS后各组血糖指标变化周次如表 2所示: 对照组平均进入IFG阶段的时间是在实验第1周, 进入IGT阶段并发展为糖尿病的速度较快, 第3周已进入糖尿病阶段; COS各组进入糖尿病前期和糖尿病阶段的时间均有一定的延后, 但均在第2~3周进入IFG阶段, 在第5~6周时进入糖尿病阶段。COS对延长db/db小鼠IGT阶段的效果较好, 尤其是在COS-H组中db/db小鼠进入IGT阶段的时间被延长至第8周。总的说来, COS-L和COS-M组小鼠的糖尿病前期阶段延长了50%, COS-H组延长了100%, 糖尿病病程可被COS有效延缓。
| 血糖指标 | 实验周次/周 | |||
| 对照组 | COS-L组 | COS-M组 | COS-H组 | |
| f0≥6.1 mmol/L | 1 | 2 | 3 | 3 |
| f0≥7.0 mmol/L | 3 | 5 | 5 | 6 |
| f2≥7.8 mmol/L | 4 | 4 | 4 | 8 |
| f2≥11.1 mmol/L | 4 | 12 | 12 | 12 |
| 注: f0为空腹血糖值, mmol/L; f2为OGTT实验中灌胃葡萄糖后2 h测得的血糖值, mmol/L。COS-L表示壳寡糖低剂量组, COS-M表示壳寡糖中剂量组, COS-H表示壳寡糖高剂量组 | ||||
本研究结果显示, COS可有效维持db/db小鼠体重的平稳增长、控制饮水量, 改善尿量增多的情况, 缓解典型的“多饮、多尿、体重减少”症状, 但对摄食量的影响并不显著。COS降低了FBG、2 h PG, 改善OGTT实验结果, 有效延后db/db小鼠的糖尿病前期和糖尿病阶段的发生时间, 其中糖尿病前期阶段可延长50%~100%, 可在一定程度上阻滞糖尿病的病程发展。结合前人研究成果可知, COS对于各时期的糖代谢异常具有较好的调节作用, 可开发成为糖尿病前期人群调节血糖的干预手段之一。但目前COS调节血糖的作用机制还不完全清楚, 其对糖尿病前期所出现的脂代谢异常等其他现象的作用有待进一步研究。
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