2024, Vol. 48
文章信息
- 郑年昊, 孙铭, 姚琳琳, 荆圆圆, 张天文, 胡凡光, 王兴强, 刘广斌. 2024.
- ZHENG Nianhao, SUN Ming, YAO Linlin, JING Yuanyuan, ZHANG Tianwen, HU Fanguang, WANG Xingqiang, LIU Guangbin. 2024.
- 硒化物在文蛤响应镉胁迫过程中作用的转录组学分析
- Transcriptomics analysis of the role of selenide in the response to cadmium stress in Meretrix meretrix
- 海洋科学, 48(1): 25-35
- Marina Sciences, 48(1): 25-35.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20210415001
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文章历史
- 收稿日期：2021-04-15
- 修回日期：2021-05-06
2. 山东省海洋科学研究院, 山东 青岛 266104
2. Marine Sciences Research Institute on Shan Dong Province, Qingdao 266104, China
镉(Cd2+)是海洋污染的常见重金属, 也是极易在生物体内富集的重金属之一[1]。联合国环境规划署和国际劳动卫生委员会将其列入重点研究的环境污染物, 世界卫生组织将其作为优先研究的食物污染物[2]。近年来, 海水贝类中镉超标较为频发, 导致贝类产品质量安全受到影响[3]。因此, 如何加快贝类体内镉代谢、提高产品质量安全是目前产业亟待解决的问题。
硒(Se)是水生生物的必需元素之一, 具有抗氧化、维持细胞膜稳定、拮抗重金属等功能, 作为重金属解毒剂用途较为广泛[4]。研究表明, 使用60 mg/L的硒化卡拉胶对氯化镉胁迫的紫贻贝(Mytilus edulis)进行Cd2+脱除, 6 d后脱除率为37.9%, 12 d后脱除率达到43.6%[5]。酶活实验发现, 紫贻贝在镉富集之后加入硒化卡拉胶, 内脏团和血淋巴中的总超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶等酶的活性均明显提升, 提高紫贻贝在镉胁迫后的生理活力[6]。铜离子和海水酸化胁迫后的魁蚶(Scapharca broughtonii)的转录组分析表明, 胁迫后的功能基因多富集于DNA复制和错配修复, 且海水酸化能促进由铜离子胁迫产生的功能基因表达[7]。硒化物在贝类重金属代谢过程中作用的转录组学研究未见报道。研究分析硒化物等脱除剂在贝类重金属代谢相关机制和途径, 可为有效利用硒化物提高贝类脱除重金属的效率奠定基础。
文蛤(Meretrix meretrix)是中国重要经济滩涂贝类, 分布广泛、口味鲜美, 受到消费者的喜爱。本实验使文蛤暴露Cd2+ 72 h后, 分别设添加亚硒酸钠组、添加硒化卡拉胶组、自然海水组进行重金属排出实验, 将经过不同处理的文蛤进行高通量测序, 分析转录组数据, 以探求硒在文蛤抵御重金属毒害的生理防御机制, 为分子标记开发以及基因克隆提供参考。
1 材料与方法 1.1 文蛤暂养实验文蛤捕捞自东营市河口区近海, 于当地养殖场开展实验。选择壳长(30±2) mm、无破损、活力好的文蛤, 暂养7 d。暂养期间海水盐度32±2, 每日换水一次, 换水量为养殖水体的四分之三, 持续充氧, 及时挑选死亡或活力差的个体, 投喂浓度为5× 108 ind./mL的角毛藻浓缩液。暂养结束后, 随机取6粒文蛤, 每2粒为一个重复, 液氮保存, 作为空白对照组(C)。
1.2 重金属富集实验3个80 L的养殖桶, 每桶中放入100粒文蛤, 加入含0.1 mg/L氯化镉(CdCl2)的海水50 L, 持续充氧。富集3 d, 第2 d、3 d均换入含0.1 mg/L氯化镉的海水, 换水量为养殖水体的四分之三。富集结束后, 每桶随机选取2粒文蛤为一个重复, 各取3个重复, 液氮保存, 标记为Cd2+富集末期组(A)。
1.3 硒化物添加排出实验富集完成后, 随机向一个桶加入亚硒酸钠1 mL, 再向另一个桶加入硒化卡拉胶溶液100 mL, 使两只桶中海水硒含量均为7 μg/L, 第3个桶使用正常海水。排出实验持续4 d, 每天全量换水一次, 对应加入亚硒酸钠1 mL和硒化卡拉胶溶液100 mL。实验完成后, 分别从三个桶中随机挑选2粒文蛤作为一个重复, 各取3个重复, 液氮保存, 并标记为自然海水排出末期(D1)、加亚硒酸钠排出末期(SS)、加硒化卡拉胶排出末期(SC)。
1.4 文库构建文蛤冷冻样品研成粉末, Trizol提取法提取总RNA, 检测RNA降解程度、纯度和完整性并精确定量后, 使用Oligo (dT) 磁珠富集待测样品中含有polyA的mRNA, 再使用SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit将mRNA反转录为cDNA链。利用磁珠筛选片段进行大规模PCR, 再经损伤修复、末端修复、连接SMRT哑铃型接头, 构建全长转录组文库。运用PacBio Sequel平台进行测序。
1.5 转录组测序与分析下机数据通过SMRTlink软件进行处理, 先得到去除接头以及长度小于50 bp的Subreads序列, 再经过多次自我校正获得后获得环形一致性序列(CCS)。通过SMRTlink软件挑选两端同时含有3′引物和5′引物, 以及3′引物前含有polyA尾的全长序列, 经过进一步筛选去除嵌合序列, 得到全长非嵌合序列(FLNC)。使用同种类型类聚算法(ICE)将同一转录本的FLNC序列进行聚类去冗余得到Consensus序列, 经非全长序列校正, 获得高质量的Polished consensus序列进行后续分析。
在无参考基因组的情况下, 使用CD-HIT软件将得到的Polished consensus序列与二代Illumina测序数据对比校正去除冗余, 保留最长转录本。将得到的高质量转录基因, 利用Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、KEGG、GO七大公共数据库进行功能注释。利用animalTFDB 2.0进行动物转录因子鉴定, 将转录本注释到已知转录因子蛋白序列, 确定转录因子的家族。
2 结果 2.1 数据质控利用PacBio Sequel测序平台对每个实验组进行全长转录组测序, 共获得587 855条(49.13 GB)原始序列, 平均长度83 576 bp, N50为149 987 bp, 经过数据质控得到12 854 333条Subreads序列(48.18 GB)平均长度3 749bp, N50为4 411bp。
通过插入序列聚类分析得到环形一致性序列、全长非嵌合序列等序列, 数量信息见表 1。使用同种类型类聚算法将同一转录本全长非嵌合序列进行聚类后校正, 得到Polished consensus序列3 303条, 最小长度127 bp, 最大长度14 717 bp, 平均长度4 157 bp, N50长度为4 932 bp, N90长度为2 433 bp。将Polished consensus序列与二代Illumina测序数据对比校正后类聚, 将相似性95%的序列去冗余得到unigenes 20 798条, 最小长度127 bp, 最大长度14 715 bp, 平均长度4 354 bp, N50为5 258 bp, N90为2 550 bp, 长度分布见图 1。
| 环形一致性序列数量 | 非全长转录本数量 | 全长序列数量 | 全长非嵌合序列数量 | 全长嵌合序列数量 | 全长非嵌合序列均长 | 全长非嵌合序列占环形一致性序列的数量/% |
| 495 789 | 130 713 | 365 076 | 362 963 | 2 113 | 4 126 | 73.21 |
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| 图 1 序列长度分布 Fig. 1 Sequence length distribution |
通过七大数据库的对比分析, 对去冗余得到的20 798条unigenes进行基因功能注释, 有19 905条unigenes至少被一个数据库所注释, 有5 440条被所有数据库注释。NR数据库注释到19 288条unigenes, SwissProt注释到16 952条, KEGG注释到18 866条, KOG注释到14 137条, GO注释到15 380条, NT注释到7 283条, Pfam注释到15 380条。选取其中五大数据库注释到的结果绘制韦恩图, 如图 2所示。
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| 图 2 Unigenes功能注释韦恩图 Fig. 2 Wayne diagram of the functional annotation of genes |
KOG功能分类结果如图 3所示, 主要注释到信号传导机制、一般功能预测基因、复制、重组和修复、细胞骨架、转录后修饰、蛋白质转换等。在KOG注释分类中, 注释到含有钙结合EGF样结构域的纤维蛋白及相关蛋白(fibrillins and related proteins containingCa2+-binding EGF-like domains)的unigenes数量最多有207条, 其次为锌指结构(Zn-finger)有198条unigenes。说明了重金属镉在文蛤体内与相关机制特异性结合, 并能产生自身代谢调节作用来保护机体安全。
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| 图 3 Unigenes的KOG功能分类 Fig. 3 KOG function classification of unigenes |
KEGG功能分布统计显示共注释到18 866条unigenes。根据代谢途径可以分为细胞过程(cellular processes)、环境信息处理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)、人类疾病(human diseases)、代谢(metabolism)、有机系统(organismal systems)六个分组, 如图 4所示。在环境信息处理分组中注释最多, 其中信号传导(signal transduction)被注释1 900条。
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| 图 4 Unigenes的KEGG功能注释 Fig. 4 KEGG function annotation of unigenes |
转录因子(transcription factor, TF)是与DNA特异性结合的一系列蛋白, 结合在DNA上启动子以及增强子之类控制转录的区域, 促进或抑制DNA上的遗传信息向RNA转录的过程, 人类的基因组上已经推定出约1 800个基因控制转录因子的编码。将本实验得到的TF数据对比到动物转录因子数据库(animalTFDB 2.0)中, 再利用hmmsearch进行鉴定, 最终得到转录因子家族名称注释, 如图 5所示。共有780个转录因子被注释到29个家族中, 家族199个, ZBTB家族108个, TF_bZIP家族74个, 其他THR-like等家族均不足50个。
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| 图 5 转录因子分析图 Fig. 5 Analysis of transcription factors 注: 横坐标为转录因子家族名称; 纵坐标为该家族下转录因子数量 |
差异基因筛选情况如表 2所示。其中, 硒化卡拉胶投入组(SC)与重金属富集组(A)共有12条差异基因, 10条上调, 2条下调; 亚硒酸钠投入组(SS)与重金属富集组(A)共有16条差异基因, 14条上调, 2条下调; 硒化卡拉胶投入组(SC)与亚硒酸钠投入组(SS)共有7条差异基因, 3条上调, 4条下调。
| 处理组别 | 样品名称 | 上调的差异基因 | 下调的差异基因 |
| 空白对照组与重金属富集末期组 | C与A | 8 | 5 |
| 空白对照组与自然海水排出末期组 | C与D1 | 13 | 8 |
| 空白对照组与亚硒酸钠投入组 | C与SS | 14 | 12 |
| 空白对照组与硒化卡拉胶投入组 | C与SC | 13 | 7 |
| 自然海水排出末期组与重金属富集末期组 | D1与A | 55 | 10 |
| 自然海水排出末期组与硒化卡拉胶投入组 | D1与SC | 7 | 6 |
| 自然海水排出末期组与亚硒酸钠投入组 | D1与SS | 6 | 7 |
| 重金属富集末期组与亚硒酸钠投入组 | A与SS | 14 | 2 |
| 重金属富集末期组与硒化卡拉胶投入组 | A与SC | 10 | 2 |
| 亚硒酸钠投入组与硒化卡拉胶投入组 | SS与SC | 3 | 4 |
| 注: C为空白对照组样品; A为重金属富集末期组样品; D1为自然海水排出末期组样品; SS为亚硒酸钠投入组样品; SC为硒化卡拉胶投入组样品 | |||
差异基因通过GO数据库进行注释, 结果见图 6。硒化卡拉胶投入组(SC)与空白对照组(C)的差异基因主要集中于分子功能, 注释为离子通道抑制活性(ion channel inhibitor activity)、通道调节活动(channel regulator activity)、通道抑制活性剂(channel inhibitor activity), 皆为下调基因, 在细胞代谢中有调节代谢的功能。重金属富集末期组(A)与自然海水排出末期组(D1)的差异基因主要集中于生物学过程, 注释为蛋白质三聚修饰(protein trimerization)、蛋白低聚特性(protein oilgomerization), 基因功能为参与胞吐作用和调节跨膜钙通量作用。亚硒酸钠投入组(SS)与重金属富集末期组(A)的差异基因主要集中于细胞组分中的细胞表面活性(cell surface)。结果表明硒化卡拉胶和亚硒酸钠都参与了文蛤对Cd2+代谢排出, 但作用机制不同。可推测Cd2+进入文蛤体内阻滞了乙酰胆碱受体离子通道, 硒化卡拉胶的有机硒可以对其有缓解作用; 而亚硒酸钠中的无机硒可使文蛤细胞表面活性增强, 能降低Cd2+浓度从而保护机体不受损伤。
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| 图 6 基因本体分析分类注释 Fig. 6 GO classification notes |
统计实验组与对照组显著富集的8个节点, 结果见表 3。细胞表面、钙离子结合、蛋白质结合、离子通道抑制剂活性、钠依赖性磷酸盐转运等差异基因显著富集, 其中细胞表面包含的基因注释为调控细胞凋亡。
| 节点编号 | 节点名称 | 总基因数 | DEG基因数 | 分类 | p值 |
| GO: 0009986 | 细胞表面 | 53/15 380 | 3/11 | 细胞成分 | 6.16×10-6 |
| GO: 0005509 | 钙离子结合 | 616/15 380 | 5/11 | 分子功能 | 3.55×10-5 |
| GO: 0005515 | 蛋白质结合 | 5233/15 380 | 10/11 | 分子功能 | 1.41×10-4 |
| GO: 0008200 | 离子通道抑制剂活性 | 14/15 380 | 2/17 | 分子功能 | 8.25×10-9 |
| GO: 0010941 | 细胞死亡的调控 | 148/15 380 | 3/12 | 生物学过程 | 1.8×10-4 |
| GO: 0015114 | 磷酸离子跨膜转运蛋白活性 | 31/15 380 | 2/12 | 分子功能 | 2.6×10-4 |
| GO: 0044341 | 钠依赖性磷酸盐转运 | 111/15 380 | 6/12 | 生物学过程 | 9.45×10-6 |
| GO: 0022857 | 底物特异性转运体活性 | 850/15 380 | 4/12 | 分子功能 | 0.003 207 |
经筛选, 各实验组的差异基因主要包括, 真核生物核糖体的生物合成、嘌呤代谢、ECM受体相互作用、蛋白质消化吸收、吞噬体、硒化合物代谢等代谢通路, 如图 7。显著富集通路的详细信息见表 4至表 7。
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| 图 7 KEGG通路富集 Fig. 7 KEGG pathway enrichment |
| 通路编号 | 通路名称 | 背景基因数 | DEG基因数 | p值 | 校正后p值 |
| ko03008 | 真核生物核糖体的生物合成 | 98 | 1 | 0.017 683 8 | 0.055 91 |
| ko00230 | 嘌呤代谢 | 201 | 1 | 0.035 815 7 | 0.055 91 |
| ko05164 | 甲型流感 | 207 | 1 | 0.036 863 6 | 0.055 91 |
| ko05205 | 癌症中的蛋白多糖 | 283 | 1 | 0.050 058 5 | 0.055 91 |
| ko04142 | 溶酶体 | 317 | 1 | 0.055 914 4 | 0.055 91 |
| 通路编号 | 通路名称 | 背景基因数 | DEG基因数 | p值 | 校正后p值 |
| ko04512 | ECM受体相互作用 | 109 | 1 | 0.019 633 1 | 0.055 27 |
| ko04974 | 蛋白质消化吸收 | 123 | 1 | 0.022 109 6 | 0.055 27 |
| ko04068 | FoxO信号通路 | 244 | 1 | 0.043 305 6 | 0.068 05 |
| ko04510 | 粘合斑 | 343 | 1 | 0.060 373 0 | 0.068 05 |
| ko04151 | 磷脂酰肌醇3酶 | 388 | 1 | 0.068 049 9 | 0.068 05 |
| 通路编号 | 通路名称 | 背景基因数 | DEG基因数 | p值 | 校正后p值 |
| ko04145 | 吞噬体 | 290 | 5 | 0.000 509 | 0.025 96 |
| ko05152 | 肺结核 | 217 | 4 | 0.001 501 | 0.038 28 |
| 通路编号 | 通路名称 | 背景基因数 | DEG基因数 | p值 | 校正后p值 |
| ko05206 | 癌症中的编码RNA | 160 | 2 | 0.001 793 | 0.017 93 |
| ko00450 | 硒化合物代谢 | 37 | 1 | 0.014 936 | 0.065 49 |
| ko04330 | Notch信号通路 | 66 | 1 | 0.026 197 | 0.065 49 |
| ko04320 | 背腹轴形成 | 66 | 1 | 0.026 197 | 0.065 49 |
| ko00240 | 嘧啶代谢 | 129 | 1 | 0.050 258 | 0.100 52 |
| ko04919 | 甲状腺激素信号通路 | 168 | 1 | 0.064 884 | 0.108 14 |
在硒化卡拉胶实验组和亚硒酸钠实验组对比得到的差异基因主要富集于ECM受体相作用(ECM-receptor interaction)通路, 在细胞间的功能主要是细胞黏连以及信号传导, 当细胞发生癌变时ECM受体相作用也会增强。该通路下注释到Col6a3基因家族, 通过BLAST到NCBI上得到的相关基因注解为Ⅵ型胶原蛋白, 主要作用为通过控制信号传导从而提高细胞内物质交换能力。Cd2+富集末期和自然海水排出组差异基因KEGG主要富集到吞噬体(phagosome)以及肺结核(tuberculosis)信号通路, 其中tuberculosis富集较为显著共有三条差异基因显著富集, 分别为MRC, CD206, CD280显著上调, 定义为甘露糖受体(mannose receptor, MR), 主要功能是通过胞外区识别和结合特定的糖类分子, 在识别病原体、递呈抗原和保持内环境稳定中发挥作用[8]。
3 讨论通过对转录因子家族分类注解可以更深入地了解蛋白家族调控的主要功能。本实验得到的转录组数据共有780个TF被注释到29个家族中, 其中C2H2型锌指(zf-C2H2)家族最多有199个, zf-C2H2具有识别与结合特异性DNA片段的功能, 参与基因表达与调控。项孙寰等对已开发的辣椒炭疽(Pepper anthrax)基因查找19个zf-C2H2家族成员并对其分析, 并根据进化关系分为7个亚族, 同时对其二级结构进行排序后发现辣椒炭疽zf-C2H2蛋白序列存在8个保守基因, 为后续进一步分析提供科学依据[9]。
差异基因通过KEGG数据库注释, 可以获取胁迫后贝类产生的相关代谢途径等信息。张晶晶等通过KEGG数据库比对, 发现镉胁迫后中国蛤蜊(Mactra chinensis)的差异基因多集中在溶酶体、Wnt信号通路、核糖体、泛素调节蛋白等[10]。张钰昆等对美洲牡蛎(Crassostrea virginica)进行纳米氧化镍的胁迫, 经过差异基因筛选注释获得在Toll样受体介导、TNF介导、色素细胞P450、谷胱甘肽硫转移酶、金属硫蛋白和多药耐药蛋白上显著表达[11]。本实验利用KEGG数据库对差异基因进行注释, Cd2+富集末期组和自然海水排出组的差异基因主要富集于吞噬体通路, 该通路中甘露糖受体基因显著上调。叶晟等通过转录组数据, 筛选出不同浓度下氯化镉胁迫后文蛤的功能基因, 主要富集到色素细胞P450、谷胱甘肽过氧化酶、谷胱甘肽硫转移酶、过氧化氢酶、热休克蛋白70以及铜/锌超氧化物歧化酶这6个功能基因[12]。本实验发现在Cd2+代谢过程中文蛤甘露糖受体功能基因显著富集, 甘露糖受体主要通过胞外区识别和结合特定的糖类分子, 在识别病原体、递呈抗原和保持内环境稳定中发挥作用[13]。所以根据测序信息推测Cd2+进入文蛤体内后, 激活甘露糖受体产生免疫应答。张辉等对镉污染后栉孔扇贝(Chlamys farreri)的消化盲囊进行转录组分析, 通过对功能基因的筛选注释, 发现显著富集的功能蛋白为结合蛋白、催化活性蛋白和转运蛋白[14]。本实验发现, 文蛤在镉富集后差异基因显著富集于蛋白质三聚修饰和蛋白低聚特性功能, 可推测镉进入贝类体内后, 对其自身蛋白合成与代谢造成直接影响, 从而导致免疫功能紊乱。
目前有关硒化物对贝类代谢重金属影响的报道较少, 仅有采用抗氧化酶测定的方式来鉴定硒化物能否在贝类体内与重金属发生拮抗作用。陈琳琳等对汞和硒暴露后的紫贻贝(Mytilus edulis)体内抗氧化酶进行测定, 发现硒暴露组的各项指标均超过汞暴露组和硒汞联合组, 而硒汞联合组的各项指标均高于汞暴露组, 说明硒在一定程度上与重金属进行拮抗作用, 增强紫贻贝的抗氧化酶活性[15]。本实验选取文蛤作为实验对象, 通过对比亚硒酸钠组和Cd2+富集末期组差异基因富集结果, 发现差异基因在癌症中的编码RNA信号通路富集明显, 筛选出Notch家族基因下调以及RDX(Radixin)蛋白上调。在卵巢多药耐药性的研究中, RDX蛋白激活抑癌基因P53活性、PI3K/Akt通路、Ras/Raf/MEK/ERK信号通路, 从而增加耐药细胞对顺铂(Platinum, PT)的敏感性[16]。RDX蛋白在癌变细胞中显著表达, 而Notch家族基因控制细胞分化、凋亡、增殖以及边界的形成[17-18]。徐行等通过研究Notch1和Notch2缺失的斑马鱼(Brachydanio rerio), 结果发现缺失相关基因的斑马鱼比正常斑马鱼致畸性更高、更易引发突变造成鱼鳔发育缺陷, 同时Notch1和Notch2影响斑马鱼的免疫功能[19]。杨童等发现Notch家族基因可以控制日本三角涡虫(Dugesia japonica)的细胞分化和自我修复功能, 在经过基因功能干扰后的日本三角涡虫中, 出现多眼点畸形、歪尾和黑斑等现象[20]。这说明Cd2+入侵文蛤细胞后通过抑制Notch信号通路降低细胞修复能力从而引发细胞死亡和癌变。硒化卡拉胶实验组和亚硒酸钠实验组对比得到的差异基因主要富集于ECM受体(ECM receptorinteraction)通路, 在细胞间的功能主要是细胞黏连以及信号传导[21]。在人类皮肤病的研究中, 原发性皮肤淀粉样变(Primary cutaneous amyloidosis)患者体内的差异基因, 显著富集于ECM受体介导和黏着斑等信号通路[21]。该通路下注释到Col6a3基因家族(Collagen typeⅥα3 chain, COL6A3), 通过BLAST到NCBI上得到的相关基因注解为Ⅵ型胶原蛋白, 主要作用为通过控制信号传导从而提高细胞内物质交换能力, 同时也可以作为多种疾病检测的指标之一[22]。在肿瘤的研究中通过抑制Col6a3基因家族的Ⅳ型胶原α3、α6链, 可以有效抑制肿瘤新生血管生成, 从而控制肿瘤扩散和生长[23]。证明有机硒与无机硒在文蛤重金属代谢过程中的作用机制以及途径不同, 亚硒酸钠更利于促进细胞分化等方式恢复文蛤受损细胞活性, 硒化卡拉胶则在细胞交换能力以及维护细胞膜稳定的方式上缓解文蛤的重金属损伤。
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