软体动物贝壳形成是一个重要的发育事件, 具有重要的发育和演化生物学意义^[1-3]。在软体动物的诸多类群中, 贝壳数目不同, 形态也十分多样, 如腹足类一般1片贝壳, 双壳类一般有2片贝壳^{[2, 4]}。贝壳本身可有螺旋状、帽状乃至管状等多种形态。然而, 对腹足类和双壳类等在内的有壳亚门(Conchifera)软体动物, 其贝壳虽然表面上差异很大, 但均是由幼虫时期的单片贝壳发育而来, 早期贝壳发育模式比较相似^[6]。在软体动物的另一个亚门——有刺亚门(Aculifera), 情况则明显不同。其成员或者缺乏贝壳(无板纲), 或者具备8片贝壳(多板纲)。对生有贝壳的有刺亚门动物, 其贝壳在形成之初也不是1片, 而是7片, 与有壳亚门动物有明显的区别, 这种差别对贝壳发育机制研究可能有重要启发。化石记录也表明, 有刺亚门软体动物的贝壳似乎与其身体表面的钙质骨刺(或称棘刺)有密切联系^[6]。由于有壳亚门动物缺乏骨刺, 研究有刺亚门动物的贝壳发育或许可以揭示更多贝壳起源的信息, 对于理解软体动物贝壳的起源和演化有重要意义。

多板纲软体动物俗称石鳖, 是有刺亚门的一大分支^[7], 其背部具有8片贝壳, 呈覆瓦状排列^[8]。目前, 对石鳖贝壳发育的研究还比较少, 对其早期贝壳发育的认识还主要局限在显微观察的层面。研究表明, 石鳖贝壳的形成过程主要包括以下两个方面。首先, 在担轮幼虫时期, 背部逐步形成贝壳发育区, 但无贝壳出现; 随后幼虫经历变态过程, 在贝壳发育区发育出贝壳结构^[9-10]。石鳖幼虫的贝壳发育区由各7个重复排列的壳板发育区(plate field)和脊(ridge)两个部分组成, 在其外部边缘区域还分布有分泌骨刺的细胞。壳板发育区是将来分泌贝壳的部位, 脊部组织则将7片初生贝壳隔开。幼虫组织电子显微镜结构显示, 幼虫背部重复排列的贝壳发育组织共包含四种类型细胞, 其中壳板发育区由3型和4型细胞构成, 脊区域由1型和2型细胞构成^[11]。然而, 对于这些细胞功能、排布和结构的研究尚无报道。

随着贝壳发育研究进入分子水平, 一些在贝壳发育细胞中特异性表达的基因得到鉴定。第一个已知的石鳖贝壳发育基因是engrailed, 这也是研究最广泛的软体动物贝壳发育基因, 普遍表达于软体动物幼虫贝壳发育相关组织中^[12-14]。在石鳖幼虫中, engrailed表达于贝壳发育区中央部位重复排列的7个条纹状区域, 同时也表达在外部边缘的环状区域^[12]。进一步的分析结果表明, 中央区域表达engrailed的细胞为脊部的1型和2型细胞。对这些细胞的起源及其在发育中的动态变化开展分析, 对于理解石鳖贝壳发育机制有重要意义。然而, 由于贝壳发育发生在贝类个体发育的早期阶段, 此时的幼虫细胞缺乏形态上的区别, 传统研究中仅能靠电子显微镜等工具来对相关细胞开展研究^[11]。贝壳发育基因的鉴定为识别不同的贝壳发育相关细胞提供了关键工具。现有的研究经验也表明, 将贝壳发育相关的基因/分子和细胞开展联合分析, 对于揭示贝壳发育机制有重要作用^{[3, 15-20]}。

本文研究对象为红条毛肤石鳖(Acanthochitona rubrolineata), 广泛分布于青岛沿海^[21]。前期课题组对红条毛肤石鳖早期贝壳发育区开展了研究^[22-23], 利用整装原位杂交技术揭示了贝壳形成相关基因engrailed的表达部位, 确认engrailed基因在贝壳发育区的脊区域表达^[22]。进一步分析发现, 红条毛肤石鳖幼虫表达engrailed的区域呈高柱状, 而前人报道的另一种石鳖(Lepidochitona caverna)中, 相应区域则十分扁平^[12], 提示二者组织结构存在差异。这种差异可能对我们理解贝壳发育机制有重要提示。要揭示这种差异的成因, 需要对相关细胞结构开展深入分析。然而对整装原位杂交后的幼虫进行直接观察时, 发现分辨率十分有限, 无法识别细胞轮廓, 可能是由于相关细胞排列欠规则^[23], 这限制了对相关细胞结构的深入观察, 必须采取其他策略提升对细胞的分辨率, 才能解决这一问题。

在生物组织和细胞研究中, 半薄切片是一种常用的生物制样手段, 其切片厚度为0.5~3 μm, 介于超薄切片和石蜡切片之间^[24]。在此厚度下, 细胞极少互相交叠, 内部结构清晰, 半薄切片也由此成为研究组织结构、尤其是细胞排列不规则组织的高效手段。半薄切片还可通过染色可实现不同细胞的区分, 目前常用的染色方法有甲苯胺蓝染色^[25]、HE染色^[26]和天青-亚甲蓝染色等。为了对红条毛肤石鳖幼虫贝壳发育相关细胞开展深入观察, 本研究将原位杂交处理后的幼虫进行半薄切片, 提高了对相关细胞识别的分辨率, 为研究石鳖贝壳发育提供了支持。

1 材料与方法 1.1 石鳖采集及幼虫培养

成体石鳖采集自青岛沿海。在实验室环境下, 性成熟的石鳖数小时内即可产卵排精。将精子和卵细胞悬液混合进行人工受精后, 筛绢过滤去除杂组织, 将过滤后的受精卵置于25 ℃海水中恒温培养。收集受精后48 h(48 hpf)的担轮幼虫, 用氯化镁溶液麻醉。用于制备半薄切片的样品使用2.5%戊二醛固定24 h后, 用梯度乙醇进行溶液置换到70%乙醇, 4 ℃冰箱保存。用于原位杂交检测的样品使用4%多聚甲醛固定过夜, 梯度置换至100%甲醇, −20 ℃保存备用。

1.2 整装原位杂交

提取石鳖幼虫总RNA后合成cDNA, 利用engrailed基因的特异性引物(F: AAGTTCTCTGGCAT CATTCGTAG, R: GTCTATCTCCTCATCGTCCCTTC)扩增其基因片段, 将胶回收后产物利用微型分光光度计(NanoDrop^® ND-1000)测定DNA浓度后作为模板, 体外转录为RNA探针, 用于下一步的杂交。

整装原位杂交步骤简述如下:

1) 将保存在甲醇中的样品梯度复水, 经过蛋白酶K消化、乙酰化处理后, 加入杂交液, 65 ℃下预杂交2 h。

2) 预杂交后, 加入含变性后探针的杂交液, 65 ℃杂交过夜。

3) 次日多次洗涤以去除未结合的探针, 加入封闭液常温孵育2 h后, 加入地高辛抗体, 4 ℃孵育过夜。

4) 用PBST缓冲液洗去多余抗体, 加入NBT/ NCIP底物, 避光显色。

5) 显色完成后, 加入90%甘油, 于显微镜(Nikon 80i)下观察。

1.3 半薄切片

由于半薄切片的切片厚度可以在一个范围内浮动, 为了检测切片厚度对观察的影响, 在半薄切片中选择了不同的厚度, 比较了不同厚度下对细胞形态的分辨程度, 以及原位杂交信号的识别准确度及信号丢失情况。此外, 为减少个体差异对实验的影响, 在进行切片时选择对同一个幼虫开展不同厚度的切片。切片及染色步骤简述如下。

1.3.1 切片制备

1) 溶液置换: 70%乙醇→ 80%乙醇→90%乙醇→ 100%乙醇(洗涤3次) → 100%乙醇: 100%丙酮(体积比为1∶1) → 100%丙酮(洗涤3次), 每次洗涤时间为10 min。

2) 树脂渗透: 100%丙酮∶树脂(体积比为3∶1), 室温(20~25 ℃)4 h → 100%丙酮∶树脂(体积比为1∶1), 室温, 过夜→ 100%丙酮∶树脂(体积比为1∶3), 室温4 h →树脂2 h。

3) 树脂包埋和固化: 在模具中将包含幼虫的树脂进行固化(37 ℃-45 ℃-60 ℃, 每个温度均固化24 h)。

4) 制样和切片: 将包含幼虫的树脂研磨到适宜大小后, 用超薄切片机(LEICA EM UC7)切片。切片置于载玻片上进行后续染色和观察。

1.3.2 半薄切片染色

利用天青Ⅱ染料(Solarbio, A9650)和1%亚甲蓝染色液(Solarbio, G1303)的混合溶液对切片进行染色, 具体步骤如下:

1) 混合染液的配制: 将1%天青Ⅱ溶液和1%亚甲蓝溶液按体积比1∶1等量混匀, 过滤后使用。

2) 将带有切片的载玻片置于杂交炉中烘干(60 ℃, 20 min)。

3) 将混合染液滴加在每个切片上, 60 ℃染色1 h, 染色后用纯水冲洗玻片上的染料, 直至洗净。

4) 将载玻片放置纯水中分色2 min, 取出后自然晾干, 然后显微镜观察。

2 结果 2.1 红条毛肤石鳖engrailed基因在贝壳发育区的表达

在担轮幼虫阶段(48 hpf), 石鳖的贝壳发育区已经基本发育完全, 能够清晰观察到壳板发育区和脊交替排列(图 1)。engrailed是目前研究最广泛的贝壳形成基因^[12], 课题组先前研究已证实engrailed基因在红条毛肤石鳖背部的表达与贝壳的发育有关^{[22, 27]}。与前述报道相同, 整装原位杂交结果表明engrailed基因在贝壳发育区中央区域的表达呈重复条带模式, 并且这些条带均位于脊的位置(图 1b)。脊部细胞突出于背部体表, 与位于脊部之间、内陷的壳板发育区明显不同, 第1个脊显著小于后部的6个(图 1b, 黑色三角)。从侧面看, 脊部的engrailed杂交信号呈明显的长柱状。除上述区域外, engrailed还表达在贝壳发育区边缘部位。如图 1所示中, 在担轮环前后的末端位置均检测到engrailed的表达(黑色箭头), 这些表达形成了一个环形区域, 包围了整个贝壳发育区(图 1a)。这与在其他石鳖种类中的结果基本类似^[10]。然而, 上述结果确定了engrailed基因表达在脊上, 但相关细胞的分布及细胞特征无法辨别, 限制了对结果的进一步解读。

2.2 红条毛肤石鳖幼虫的半薄切片观察

为了解析贝壳发育相关细胞的特征和分布情况, 对48 hpf石鳖幼虫进行了常规的冷冻及石蜡切片。结果发现, 由于石鳖背部的贝壳发育细胞排列欠规则, 且横截面很小^[23], 当进行常规纵向切片时(8~ 20 μm), 不同细胞仍交叠在一起, 无法区分单个的细胞(结果未展示)。考虑到这种困难主要是细胞横截面过小及排列不规则导致的, 推测进一步减小切片厚度可能可以解决该问题, 因此进一步开展了半薄切片实验。

半薄切片结果表明, 随着切片厚度的减小, 对细胞结构的识别程度有了明显提高。如图 2所示, 半薄切片下不同区域的幼虫细胞展示清晰, 不同细胞的分布和形态特征存在较大差别。担轮环前区域的细胞排列规整, 半薄切片后经天青-亚甲蓝染色能够清晰地观察到细胞核, 并区分不同细胞(图 2, 黑色框)。担轮环后区域则不同, 壳板发育区和脊细胞的重叠现象明显。该区域虽然也能够勉强分辨细胞核, 但细胞分界模糊, 细胞分属仍然不清楚, 无法准确定位不同细胞群体的范围(如engrailed基因表达的区域)(图 2, 白色框)。考虑到两部分组织的细胞横截面类似, 担轮环后部组织的这种模糊形态可能是由于细胞排布不够规则导致的。如果要进一步识别具体的细胞类型(如表达engrailed基因的细胞), 有必要同时结合原位杂交和半薄切片两种方法。

2.3 原位杂交与半薄切片结合观察

通过上述结果可以看出, 单独的整装原位杂交或半薄切片均无法辨析石鳖幼虫背部的贝壳发育相关细胞, 因此将二者结合可能为一种有效的策略。故先将48 hpf的石鳖幼虫进行整装原位杂交实验, 再对显色后的幼虫进行半薄切片。结果表明, 半薄切片进行天青-亚甲蓝染色后, 原位杂交信号与后期染色分别呈现为深蓝及浅蓝色, 差别明显, 可以准确区分(图 3)。

图 3展示的是同一石鳖幼虫分别进行1 μm和3 μm半薄切片的结果。1 μm的切片细胞分辨率最高, 可以更好地避免细胞重叠。从图 3a中可以清晰地识别engrailed阳性细胞的位置和轮廓, 然而由于切片过薄, 丢失了一部分信号区域。例如靠近担轮环部位的阳性信号区域显著小于幼虫后部, 第一个脊部的信号甚至已经完全丢失(图 3a, 空心三角)。相较而言, 3 μm的切片中细胞的分辨率略有降低(图 3b), 但并未干扰对细胞的识别, 同时此厚度下的切面保留了全部的表达位置。二者相比, 3 μm厚度的切片更适合对石鳖贝壳发育相关细胞的观察。

如图 3a所示, 可以发现表达engrailed细胞的核质比很大, 细胞质仅占细胞体积的很少部分。从图 3b中能够观察到更多特征, 主要包括: (1)每处表达engrailed基因的细胞分布在脊的突起部位; (2)每个脊部的engrailed阳性细胞呈V形排列。此外, 除了脊部的表达, 还观察到在贝壳发育区边缘的engrailed阳性细胞形态和位置明显不同于脊部细胞(图 3b, 白色虚线外部)。这些细胞基本不呈单层排列, 并深入幼虫身体内部。这些差异表明, 尽管贝壳发育区中央和边缘的细胞均表达engrailed, 但二者的发育模式存在差异, 可能有不同的生理功能。

3 讨论

对贝类贝壳发育机制的解析离不开对相关细胞结构的深入观察和解读^{[3, 17, 19]}。本研究结合整装原位杂交和半薄切片技术, 实现了对石鳖幼虫背部贝壳发育区中表达engrailed细胞的准确识别和观察, 显著提升了对细胞结构观察的分辨率, 为后续的贝壳发育机制解析提供了支持。

为了提升观察分辨率, 首先对石鳖幼虫开展了半薄切片。虽然能够清晰识别出不同区域细胞的分布和形态, 但受位置、个体以及切片厚度等影响无法精准定位到所需要的单个细胞(如表达engrailed基因的细胞)。此外, 石鳖幼虫呈椭圆形, 包埋时无法保证幼虫身体完全水平, 导致切片的角度无法一致。尽管采用相同的操作进行纵向切片, 但实验中发现, 切片角度的微小偏差都会导致幼虫组织呈现不同的形态, 给比较不同的切片结果带来了困难。此外, 石鳖早期发育的同步率虽然较高, 但个体之间仍存在发育阶段上细小的差别, 导致幼虫的形态如体长、体宽和厚度等都有可能存在差异, 进一步增加了制片和观察的难度。本研究发现, 48 hpf的幼虫贝壳发育区发育完全, 壳板发育区与脊的位置分界清楚, 发育不同步造成的个体差异可以忽略, 因此选择了该阶段的幼虫作为研究对象。同时, 利用原位杂交信号辅助识别细胞群体, 大大增加了观察的分辨率和结果的可信程度。

本研究表明, 原位杂交后的半薄切片清晰展示了贝壳发育细胞的形态。两种切片厚度呈现出的效果存在一定的差异, 各有优劣。1 μm切片下可以实现最高程度的分辨率, 但由于切片过薄丢失了部分表达位置。此外, 石鳖的细胞存在一定厚度, 过薄的切片也会导致无法全面展示组织的结构。相比而言, 3 μm的切片能够全面展示出不同位置的阳性细胞, 并且勾勒出engrailed表达区域的整体分布模式。虽然部分细胞的清晰度有所下降, 但整体上达到了对相关结构的最佳识别和解读效果。

对相关细胞结构的观察表明, 红条毛肤石鳖48 hpf幼虫中表达engrailed基因的细胞分布在同一水平线上, 没有明显的凹陷现象(图 3b)。整体的V形排列模式以及不同细胞的重叠效应, 可能是整装原位杂交时呈现高柱状信号的原因。此外, 还清晰地发现engrailed mRNA在整个脊细胞中均有分布。而在L. caverna等种类的石鳖中, engrailed阳性细胞具有不同的特征和排列方式^[12]。该研究发现, L. caverna中表达engrailed的细胞位置深浅不一, 该部位表现出明显的凹陷, 且engrailed mRNA仅在脊细胞的基部分布^[12], 与红条毛肤石鳖差别明显。目前尚无法确定这些不同的观察结果是由于物种本身的差别还是发育阶段的不同导致的。根据现有的贝壳形成理论, 贝壳相关组织的内陷对贝壳物质的分泌和贝壳形成可能有重大的影响(如可能对于形成密封的钙化腔室有关键作用)^{[1, 11]}。因此, 后续研究中有必要继续关注不同石鳖种类贝壳发育细胞的差异。

多板纲在软体动物演化历史中占据重要的地位, 探索其贝壳发育过程有重要的发育和演化生物学意义。目前对于多板纲贝壳发育的相关研究较少, 且大部分重点关注成体贝壳^[28], 对于早期贝壳发育这一复杂发育事件的研究还比较薄弱。与腹足类和双壳类不同^{[3, 17, 19-20]}, 石鳖背部细胞呈细长柱状^[27], 且排列欠规则, 对其开展观察存在较大难度。本研究通过调整实验策略, 结合整装原位杂交和半薄切片实验方法, 实现标记基因及观察细胞结构的目的。借助基因的标记作用, 可以精准定位相关细胞, 实现对细胞结构和排列模式的深入观察, 有望在对石鳖贝壳早期发育机制的研究中发挥重要的支持作用。