2024, Vol. 48
文章信息
- 许金慧, 赵新宇, 曲同飞, 孙白雪, 唐学玺, 王影. 2024.
- XU Jinhui, ZHAO Xinyu, QU Tongfei, SUN Baixue, TANG Xuexi, WANG Ying. 2024.
- 浒苔交替氧化酶(alternative oxidase)基因克隆与环境应答
- Cloning and environmental response of the alternative oxidase gene in Ulva prolifera
- 海洋科学, 48(10): 1-12
- Marine Sciences, 48(10): 1-12.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20230410001
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文章历史
- 收稿日期：2023-04-10
- 修回日期：2024-10-10
2. 崂山实验室, 山东 青岛 266237;
3. 青岛海洋科技中心, 山东 青岛 266237
2. Laoshan Laboratory, Qingdao 266237, China;
3. Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China
浒苔(Ulva prolifera)是绿藻门、石莼目、石莼科、石莼属的大型海藻, 藻体是由单层细胞组成的中空管状体, 易于漂浮, 长度可达1~2 m[1]。自2007年以来, 浒苔绿潮在我国黄海海域连年发生, 具有长时间长距离漂浮迁移的特点。在黄海绿潮暴发期间, 浒苔是黄海绿潮的优势种, 浒苔藻体漂浮在海水表层, 直接面临温度、光照、盐度、干出/浸没等复杂的环境变化[2-3]。已有研究表明, 浒苔藻体具有极强的光合适应能力, 环式电子传递、非光化学猝灭(non-photochemical quenching, NPQ)均在藻体光合适应过程中发挥重要作用[4-5]; 在逆境条件下藻体内会产生过量的ROS, 抗氧化系统有助于清除藻体内过量ROS以实现藻体的保护作用[6]。
交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)基因广泛存在于高等植物、真菌以及原生动物门中[7], 直接从泛醌获得电子传递给分子氧, 不受质子梯度势能的调控, 是一种非能量守恒的末端氧化酶[8]。Rhoads和Mcintosh在Sauromatum venosum中首次成功克隆出AOX基因[9], AOX基因是由一个小的核基因家族编码的, 通常分为两个亚家族, 分别为AOX1基因和AOX2基因[10]。因AOX基因的功能和特性, 导致AOX基因家族成员具有组织表达的特异性[11]。已有围绕高等植物和模式微藻的研究表明, AOX基因在植物逆境应答过程中扮演重要角色, 主要表现在逆境条件下通过快速消耗叶绿体中过量还原当量实现光合作用优化和维持活性氧(reactive oxygen species, ROS)稳态的能力[12-16], 然而截至目前有关浒苔AOX基因(UpAOX)序列、结构及其环境应答能力相关信息尚不清楚。
为探索浒苔AOX蛋白的结构、功能与环境应答特征, 本研究通过对UpAOX基因进行克隆, 并对其进化地位、理化性质、二级结构、顺式作用元件、保守结构域、三级结构等生物学信息进行预测, 同时探索不同温度、UVB强度、盐度、干出条件下UpAOX基因转录表达差异。该研究有助于挖掘UpAOX基因的潜在功能以及探索其潜在逆境响应策略。
1 材料与方法 1.1 实验材料本实验所用浒苔藻体是在黄海绿潮暴发期从青岛近岸采集, 将采集藻体带回实验室后用刷子轻轻地清洗藻体, 用无菌海水去除附着的杂质、小食草动物和附生植物。在智能照明培养箱(GXZ280C, 宁波江南)中, 培养温度设置为20 ℃, 光合有效辐射设置为72 µmol·m−2·s−1, 光照∶黑暗周期为12∶12 h, 盐度为30, 藻体在无菌海水中培养同时施加f/2营养盐。为了抑制硅藻的生长, 使用质量浓度为0.5 mg/L的二氧化锗(GeO2)。无菌海水2 d更新一次[6]。
1.2 RNA的提取根据RNA提取试剂盒(KJ007, 四川科劲)说明书, 将适量的样品加入液氮在研钵中研磨, 待样本研碎后严格按照说明书的操作步骤进行RNA的提取。提取完成后, 使用超微量核酸蛋白测定仪(scandrop100, 德国耶拿)检测RNA的纯度(A260/A280)和浓度, 然后将提取的RNA放于–80 ℃冰箱进行保存。
1.3 AOX基因克隆 1.3.1 cDNA第一条链的合成取5 μL RNA与1 μL随机引物和1 μL双蒸水加入PCR管, 然后在70 ℃温浴5 min。冰浴2 min后向PCR管中加入2.0 μL 5X First-Strand Buffer、0.5 μL 10 mM dNTP、0.25 μL Rnase inhibitor、0.25 μL Reverse Transcriptase, 然后依次在42 ℃温浴60 min, 72 ℃温浴10 min。按照此实验体系在PCR反应扩增仪(VeritiPro 9, 美国ABI)进行cDNA第一条链的合成。
1.3.2 3′RACE以3′ adaptor为反转引物(表 1)的cDNA为模板, 然后进行巢氏PCR。PCR结束后在电泳仪(DYY-8, 上海琪特)进行1%琼脂糖凝胶电泳以观察PCR结果, 然后进行测序。
| Gene | Nucleotide sequence |
| 5′adaptor | GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGGGIIGGGIIGGGIIG |
| 3′adaptor | GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT |
| 5.3′outer | GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC |
| 5.3′nner | GCTACGTAACGGCATGACAGTG |
| 3′RACE特异性引物-F1 | CATATTTAGACCAGCATCGCTTGTCGTCAT |
| 3′RACE特异性引物-F2 | CGTCTGACACACATCAGCCCCTGC |
| 5′RACE反转录引物-RT2 | AGCGCCAACAGTAACACTATGAG |
| 5′RACE反转录引物-RT1 | GACGGCCTACTGCTCAATCA |
| 5′RACE特异性引物-R2 | AGTCCTCCTGGTGGCCACATGCA |
| 5′RACE特异性引物-R1 | GGAGTGAATATATACATGATGTGGATGCCTGA |
| AOX-F | TGAGACATTCAGGCATCCA |
| AOX-R | AAGGTCAGGCGTGTACTT |
| 18S-F | CAACCATAAACGATGCCGA |
| 18S-R | AGCCTTGCGACCATACTCC |
以特异性引物R1(表 1)进行反转录得到cDNA, 经RNase H和TdT处理后, 进行巢氏PCR。PCR结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳以观察PCR结果, 然后进行测序。
1.3.4 克隆测序连接产物转化: 制备感受态细胞(SK2301)。转化步骤为: 1) 将100 μL感受态细胞, 置于冰上, 完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮; 2) 加入10 μL连接液, 轻轻混匀。冰上放置30 min; 3) 42 ℃水浴热激60 s。冰上放置10~15 min; 4) 加400 μL LB培养基, 37 ℃ 200~ 250 r/min振荡培养1 h; 5) 室温下4 000 r/min离心5 min, 用枪头吸掉400 μL上清液, 用剩余的培养基将细胞悬浮; 6) 将细菌涂布在预先用20 μL100 mmol/L的IPTG和100 μL质量浓度为20 mg/mL X-gal涂布的氨苄青霉素平板上, 倒置培养过夜。
菌落PCR及测序: 以pMD18-T载上的通用引物进行PCR, 然后将纯化后的PCR产物进行测序仪(3730XL, 美国ABI)测序。
1.4 环境条件处理与实时荧光定量PCR分析探索UpAOX基因的环境响应特征, 对藻体进行不同的温度、干出时间、UVB强度、盐度的条件处理, 研究UpAOX基因转录水平表达变化。依据前人对浒苔环境因子的观察研究[17-19], 按照以下方法处理藻体: (1)称取0.5 g生长状态良好的浒苔分别放置在5、10、20、30 ℃的光照培养箱中处理4 h, 光照以及营养盐等条件均不变。实验结束后, 擦干藻体, 放入液氮中速冻, 然后放入–80 ℃冰箱保存, 以待后续实验。(2)称取0.5 g生长状态良好的浒苔放在培养皿中干出0、2、4 h, 实验期间培养箱中光照以及温度等条件均不变, 实验结束后按照上述步骤保存, 以供后续实验。(3)称取0.5 g生长状态良好的浒苔分别放置在含有0、15、30、60盐度的海水中处理4 h, 使用盐度计(LH-Y100, 浙江陆恒)进行实验期间培养箱中的光照以及温度等条件均不变, 实验结束后按照上述步骤保存, 以供后续实验。(4)称取0.5 g生长状态良好的浒苔放置在UVB强度为0、1、5 W/m2条件下处理4 h, UVB辐射系统由提供UVB辐射源的UVB宽带灯(Philips TL 40 W/12RS, 德国Philips)组成, 该灯覆盖有醋酸纤维素膜(0.12 mm)以过滤消除UVC辐射。通过改变藻体和灯之间的距离来改变辐射强度。使用UVB紫外线辐照器(UVB 297, 北京师范大学)测量UVB强度。样品处理期间, 温度、盐度等条件均不变, 样品处理结束后按照上述步骤保存, 以供后续实验。以上实验均设置3个平行处理。
根据UpAOX基因的全长序列, 使用Beacon Designer(8.0, 美国)设计特异性引物(表 1)。使用18s基因作为管家基因, 进行实时荧光定量PCR实验(变性: 95 ℃, 3 min; 退火: 95 ℃, 10 s; 延伸: 60 ℃, 30 s), 每个样品设置三个平行, 最终使用-ΔΔ Ct计算目的基因的相对表达量。
1.5 生物信息学分析通过DNAMAN (DNAMAN 6.0, 美国)软件对RACE实验结果与已知中间片段进行拼接得UpAOX基因全长cDNA序列。分别使用Evolview (Evolview 2.0, 中国)、MEGA(MEGA 5.0, 新西兰)、TMHMM Server(TMHMM Server 2.0, 丹麦)等生物信息学在线工具(表 2)进一步预测分析AOX蛋白的性质与结构。
| 功能 | 软件 | 网址 |
| 系统发育进化树 | Evolview | https://evolgenius.info//evolview-v2 |
| 蛋白质序列比对 | MEGA | |
| 顺式作用元件 | Plant Care | http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ |
| 理化性质 | ProtParam | http://web.expasy.org/protparam/ |
| 亲/疏水性 | ProtScale | http://web.expasy.org/protscale/ |
| 跨膜螺旋结构 | TMHMM Server v.2.0 | http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ |
| 信号肽 | SignalP 4.1 Server | http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ |
| 亚细胞定位 | WoLF PSORT | http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ |
| 结构域 | NCBI Conserved Domain | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi |
| SMART | http://smart.emblheidelberg.de/smart/job_status.pl?jobid=144123466774021665468569XbKNjcCPOS | |
| Motif分析 | MEME | https://meme-suite.org/meme/doc/meme.html |
| Motif Scan | https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan | |
| 二级结构 | SOPMA | http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html |
| 三级结构 | Alphafold2 | https://www.bkunyun.com/v2/novice-tutorial?active=AlphaFold2 |
使用单因素方差分析(One-way ANOVA)(SPSS 25, 美国)和LSD分析对UpAOX基因的相对表达量进行分析, 并进行方差齐性检验, 显著性水平设定为P < 0.05。用Origin(Origin2022, 美国)软件进行柱形图的绘制。使用MEGA(MEGA 5.0, 新西兰)(选择Neighbor-Joining Tree)和Evolview(Evolview 2.0, 中国)在线工具进行系统发育树的绘制。使用MEME在线工具(MEME 5.5.1, 美国) (Select the number of motifs参数设置为8)和PowerPoint (PowerPoint2019, 美国)进行Motif的绘制。Alphafold2, 基于北鲲云平台进行三级结构的绘制; 同时使用TMHMM Server对AOX蛋白的跨膜螺旋位置进行预测, 通过Pymol(DeLano Scientific LLC, 美国)将对应跨膜螺旋位点进行标注。选取UpAOX基因起始密码子上游序列(901 bp), 使用Plant Care(比利时)在线工具进行顺式作用元件的预测。
2 结果 2.1 浒苔AOX基因测序结果及顺式作用元件分析UpAOX基因全长为2 441 bp(GenBank登录号为: OQ780975), 编码的氨基酸残基总数为236个。
分析UpAOX基因启动子顺式作用元件得知(表 3), 其中与光响应相关的元件有Box II、GATA-motif、Sp1。与光照、紫外线、干旱、低温非生物胁迫相关的元件G-Box、GC-motif、MBS也存在AOX基因中。此外, 还存在参与激素调节相关的元件, 如ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif。
| 顺式作用元件 | 基序序列 | 功能 |
| ABRE | ACGTG | ABA响应元件 |
| Box II | ACACGTTGT | 光响应元件 |
| CGTCA-motif | CGTCA | MeJA响应元件 |
| G-Box | TCCACATGGCA | 光照、紫外线、伤害响应元件 |
| GATA-motif | GATAGGG | 光响应元件 |
| GC-motif | CCCCCG | 厌氧诱导顺式元件 |
| MBS | CAACTG | 干旱诱导元件 |
| Sp1 | GGGCGG | 光响应元件 |
| TGACG-motif | TGACG | MeJA调控元件 |
| W-box | TTGACC | 生物胁迫响应元件 |
| CAAT-box | CAAT | 启动子和增强子常见顺式元件 |
| CAT-box | GCCACT | 分生组织表达相关的顺式调控元件 |
| MYB | CAACAG | 花青素合成响应元件 |
| TATA-box | TATA | 转录起点-30附近的核心启动子元件 |
| WRE3 | CCACCT | 创伤反应元件 |
从序列比对结果中看出AOX蛋白保守氨基酸序列主要位于C端, N端氨基酸序列差异性明显。在浒苔中具有保守的铁离子结合区域—EXXH和EEE-Y。
AOX蛋白的总原子数为3773, 分子式为C1219H1864N340O336S14, 分子量为27 107.13, 理论等电点为6.42。此蛋白中有20种氨基酸, 其中含量最多的是占总氨基酸11%的亮氨酸(Leu), 而半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)同为含量最少的氨基酸, 占总氨基酸的1.7%, N末端为蛋氨酸(Met)。AOX蛋白中带有负电荷残基(Asp + Glu)的总数为27, 带有正电荷残基(Arg + Lys)的总数为23。该蛋白的不稳定指数为36.94(< 40), 所以此蛋白归为稳定类。亲水性平均指数为–0.181, 为负值, AOX蛋白属亲水性蛋白。
氨基酸的亲水性、疏水性进行分析, 氨基酸若为疏水性则score为正值, 若为亲水性则score为负值。AOX蛋白氨基酸中大多数区段为负值。因此可以说明, AOX蛋白氨基酸中的亲水氨基酸数目较多, 也就是说AOX蛋白为亲水性蛋白。并且上述AOX蛋白理化性质分析中亲水性平均指数也指示AOX蛋白为亲水性蛋白。
AOX蛋白的亚细胞定位预测值为: 细胞质基质(cyto): 12, 线粒体(mito): 2。
分析信号肽的标准是根据S-score(Signal peptide score, 信号肽分值)进行判断。若S-score > 0.5, 则被判断为分泌蛋白。AOX蛋白的S-score < 0.5, 所以AOX蛋白不是分泌蛋白。
将AOX蛋白的氨基酸进行跨膜螺旋预测分析, 结果表明AOX蛋白的氨基酸有2个跨膜螺旋结构。
对AOX蛋白的二级结构进行预测分析(表 4), 其中α螺旋(Alpha helix, Hh)占55.51%、延伸链(Extended strand, Ee)占7.2%、β转角(Beta turn, Tt)占7.2%、不规则卷曲(Random coil, Cc)占30.08%。
| 类型 | 百分比 |
| Alpha helix (Hh) | 55.51% |
| Pi helix (Ii) | 0.00% |
| Beta bridge (Bb) | 0.00% |
| Extended strand (Ee) | 7.20% |
| Beta turn (Tt) | 7.20% |
| Bend region (Ss) | 0.00% |
| Random coil (Cc) | 30.08% |
| Ambiguous state | 0.00% |
| Other state | 0.00% |
浒苔AOX蛋白具有典型的AOX蛋白保守结构域(Pfam01786), 其位于AOX蛋白氨基酸序列第5-218位, 属于二铁羧基蛋白超家族。
对不同物种AOX蛋白和浒苔AOX蛋白的Motif序列进行分析, 共得到8个Motif元件, 其中浒苔有4个Motif元件, 分别为Motif 1、2、5、3(图 1)。其中Motif 1、2、3、4、5、6在所比对的高等植物中都有存在。
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| 图 1 浒苔AOX蛋白Motif序列分析 Fig. 1 Motif sequence analysis of AOX protein motifs from Ulva prolifera |
预测浒苔AOX蛋白的Motif结构得知, 浒苔AOX蛋白具有2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个N端豆蔻酰基化位点、4个蛋白激C磷酸化位点和1个N端糖基化位点。
AOX蛋白3D结构预测如图 2所示, 其中红色区域为跨膜螺旋。
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| 图 2 浒苔AOX蛋白的三级结构分析 Fig. 2 Analysis of tertiary structure of AOX protein of Ulva prolifera 注: 红色标示跨膜螺旋结构 |
用邻接法对25个物种中43个AOX蛋白序列进行系统发育树的构建得知, AOX蛋白被分为7个亚家族(A、B、C、D、E、F、G), 主要分布于A和B亚家族(图 3)。浒苔AOX蛋白分布在F亚家族, 与小球藻(Chlorella sorokiniana)、黄丝藻(Tribonema minus)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、壳缝藻(Monoraphidium neglectum)、团藻(Volvox carteri)有较近的亲缘关系(表 5)。
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| 图 3 浒苔AOX蛋白进化树分析结果 Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of AOX protein in Ulva prolifera |
| 物种 | 各物种AOX蛋白缩写 | NCBI蛋白序列号 |
| 拟南芥(Arabidopsis thaliana) | AtAOX1A | NP_188876.1 |
| AtAOX1B | NP_188875.1 | |
| AtAOX1C | NP_189399.1 | |
| AtAOX2 | NP_201226.2 | |
| 水稻(Oryza sativa, O.glaberrima) | OgAOX1a | BAA28773.1 |
| OgAOX1b | BAA28774.1 | |
| OgAOX1c | BAB71945.1 | |
| 胡萝卜(Daucus carota) | DcAOX1 | ALI57378.1 |
| DcAOX2a | ABZ81229.2 | |
| DcAOX2b | ABZ81230.2 | |
| 葡萄(Vitis vinifera) | VvAOX1a | ACI28876.1 |
| VvAOX2 | NP_001268001.1 | |
| 番茄(Solanum lycopersicum) | SlAOX1a | NP_001234117.2 |
| SlAOX1b | NP_001234120.1 | |
| SlAOX2 | NP_001309890.1 | |
| 旋蒴苣苔(Dorcoceras hygrometricum) | DhAOX1B | KZV31497.1 |
| 野大豆(Glycine soja) | GsAOX1 | KHN42869.1 |
| GsAOX2 | KHN39226.1 | |
| 西瓜(Citrullus lanatus) | ClAOX2 | ADD84880.1 |
| 鹰嘴豆(Cicer arietinum) | CaAOX1 | XP_004512369.1 |
| 黄瓜(Cucumis sativus) | CsAOX | XP_004137164.1 |
| 糜子(Panicum miliaceum) | PmAOX | AST12960.1 |
| 大豆(Glycine max) | GmAOX1 | NP_001236166.2 |
| 甘薯(Volvox carteri) | IbAOX1a | UHK02567.1 |
| IbAOX1b | UHK02568.1 | |
| IbAOX2 | AZZ09412.1 | |
| 鹅掌楸(Liriodendron chinense) | LcAOX1a | QHQ71440.1 |
| LcAOX1b | QHQ71442.1 | |
| LcAOX2 | QHQ71441.1 | |
| 小麦(Riticum aestivum) | TaAOX | BAB88646.1 |
| 甘蔗(Saccharum officinarum) | SoAOX1 | AAU11467.1 |
| SoAOX1d | AAU11470.1 | |
| SoAOX1c | AAU11469.1 | |
| 欧李(Prunus humilis) | PhAOX | AIK01830.1 |
| 豇豆(Vigna unguiculata) | VuAOX | AAZ09197.1 |
| 烟草(Nicotiana tabacum) | NtAOX1 | Q40578.2 |
| NtAOX2 | Q41224.1 | |
| 小球藻(Chlorella sorokiniana) | CsAOX | PRW58530.1 |
| 黄丝藻(Tribonema minus) | TmAOX | KAG5184451.1 |
| 江蓠(Gracilaria domingensis) | GdAOX | KAI0565114.1 |
| 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) | CrAOX | XP_001694605.1 |
| 壳缝藻(Monoraphidium neglectum) | MnAOX | XP_013896606.1 |
| 团藻(Volvox carteri) | VcAOX | XP_002955181.1 |
检测样品的RNA的质量浓度范围为35~71 ng/μL, 纯度(A260/A280)范围为1.7~2, 均符合实验要求。
如图 4(a)所示, UpAOX基因在10、20 ℃条件下没有显著性差异, 在低温5 ℃以及高温30 ℃条件下UpAOX相对表达量较高, 显著高于在10、20 ℃条件下的相对表达量。
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| 图 4 浒苔AOX基因响应不同环境条件的相对表达量分析 Fig. 4 Relative expression level of AOX in Ulva prolifera in response to different environmental conditions 注：不同字母代表经单因素方差分析不同处理间有显著差异；字母相同则无显著差异 |
如图 4(b)所示, UpAOX基因在干出2 h时, UpAOX基因的相对表达量与实验开始时相比未发生显著变化, 在干出4 h时, UpAOX相对表达量显著高于在干出2 h时的相对表达量。
如图 4(c)所示, UpAOX基因的相对表达量随着UVB辐照强度的增加而显著上升。
如图 4(d)所示, UpAOX基因的相对表达量在盐度为15与盐度在30条件下相比未发生显著变化。UpAOX基因的相对表达量在盐度为0和60时比盐度在30条件下显著升高。
3 讨论自2007年以来, 浒苔绿潮在我国黄海海域连年发生, 具有长时间、长距离漂浮迁移的特点, 浒苔藻体自身具备极强的环境适应能力以支撑其最终成灾。在逆境条件下, 植物通过AOX蛋白活性上升或基因表达量上调以提升其环境适应能力, AOX蛋白在植物逆境应答过程中扮演重要角色[20-21]。截至目前AOX基因已经在高等植物、模式藻类、真菌、细菌以及少数动物中被研究, 而在大型海藻中相关研究则较少[7]。
浒苔AOX蛋白具有较强的保守性并且保守区主要位于C端, 浒苔AOX蛋白具有典型的AOX蛋白保守结构域Pfam01786, 这与甘薯AOX蛋白的研究一致[22]。浒苔AOX蛋白属于二铁羧基蛋白超家族, 毛竹AOX蛋白也同属此家族[23]。AOX蛋白中非保守的N端与AOX蛋白的底物选择和功能的多样性有关[24]。在浒苔AOX蛋白中发现具有保守的铁离子结合区域EXXH和EEE-Y。这与拟南芥、甘薯(Volvox carteri)、番茄(Solanum lycopersicum)、鹅掌楸(Liriodendron chinense)等高等植物AOX蛋白的铁离子结合区域为EXXH、EEE-Y、FXHR有所不同, 这表明浒苔与高等植物AOX蛋白的进化地位与功能有所差异[22]。
将浒苔与不同物种AOX蛋白进行系统发育树构建, 发现浒苔AOX蛋白与莱茵衣藻、团藻、壳缝藻、黄丝藻、小球藻AOX蛋白的进化关系较近(图 1)。并且发现浒苔AOX蛋白中的4个motif序列与莱茵衣藻、团藻、小球藻的motif序列近似(图 2)。综上, 与高等植物相比, 浒苔AOX蛋白无论从进化地位上还是从motif功能预测上, 均与藻类有更近的关系[25]。
顺式作用元件可调控基因正常表达。环境响应启动子中的顺式作用元件可以与转录因子特异性结合, 使目的基因转录表达, 进而使植物具备环境适应能力, 以维持正常的生命活动[26]。本研究通过分析顺式作用元件得知, UpAOX基因除含有基本的顺式作用元件CAAT-box、CAT-box、TATA-box外, 还包括与紫外线、干旱等非生物胁迫、生物胁迫、分生组织表达、激素合成、光响应相关的顺式作用元件(表 3), 表明UpAOX基因在环境响应、生长发育、信号转导过程中扮演重要作用, 这与拟南芥、玉米、高粱、水稻等物种AOX蛋白功能的研究结果一致[25]。光响应元件通常存在光合作用有关的光调控基因中, 并且对光调控基因的转录激活是必需的[27]。我们的研究结果发现, UpAOX基因中存在Box Ⅱ、GATA-motif、Sp1、G-Box光响应顺式作用元件(表 3), 推测AOX蛋白有较强的光合作用优化潜力[28]。此外, UpAOX基因中存在与花青素合成以及茉莉酸甲酯(MeJA)响应元件(表 3)。花青素是类黄酮物质, 具有自由基清除和抗氧化的能力。MeJA是与损伤相关的植物激素和信号分子, 可通过影响桃果实中的SOD、CAT等抗氧化酶的活性进而影响ROS的代谢[29]。综上, UpAOX基因具有ROS稳态维持的潜力, 这与AOX蛋白可以调节ROS的含量结果一致[30]。
有关植物AOX蛋白逆境响应过程中的研究表明, 较高或较低温度均可以诱导绿豆AOX基因的表达, 且对较低温度相对敏感[31]; 低温条件下, 拟南芥AOX基因表达量增加[16]; 干旱条件下, 观察到大豆[32]、烟草[14, 33]、小麦(Triticum aestivum)[34] AOX蛋白活性显著上调; 红芸豆(Phaelous vulgaris)叶片在UVB增强条件下, 过氧化氢含量的升高诱导了AOX基因表达量显著升高, 最大程度地保护植物免遭氧化应激的损伤[35]; 拟南芥、豌豆、烟草以及胡杨(Populus euphratica)AOX基因均响应盐胁迫, 均表现为AOX基因显著上调[36-39], 通过减轻对光合作用的损伤以及氧化损伤进而提高植物对逆境的抗性。在黄海绿潮发生期间, 浒苔面临海水表层复杂的环境变化, 包括高温、强光、干出等。已有研究表明浒苔具备极强的逆境适应能力, 表现在环式电子传递[4]、非光化学猝灭[5]、极强的抗氧化能力等方面[6]。本研究荧光定量PCR研究结果表明, UpAOX基因在低温、高温、干出、高强度UVB、高盐、低盐的逆境条件下表达量均显著上调(图 4), 结合顺式作用元件的分析表明, UpAOX基因具有极强的逆境应答潜力, 本研究结果可充分反映浒苔AOX蛋白的结构和功能、遗传距离及逆境响应潜力, 为后续在分子水平深入挖掘浒苔UpAOX基因的生物学功能以及逆境响应策略提供理论基础。
4 结论本研究通过RACE技术成功克隆了UpAOX基因的全长序列。UpAOX基因cDNA全长为2441bp, 编码236个氨基酸, 具有典型的“EXXH”“EEE-Y”铁离子结合保守motif; AOX蛋白在进化过程中具有较强的保守性, 尤其是C端; 在所有参加比对的植物中, 浒苔AOX蛋白与小球藻、黄丝藻、莱茵衣藻、壳缝藻、团藻有较近的亲缘关系; UpAOX基因中具备环境应激响应、生长发育、信号转导相关的顺式作用元件; 荧光定量PCR实验结果表明, 温度、干出、盐度、UVB逆境均与UpAOX基因转录表达量有显著关联。
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