2024, Vol. 48
文章信息
- 王韫沛, 刘晨光. 2024.
- WANG Yunpei, LIU Chenguang. 2024.
- 壳聚糖基静电纺丝纳米纤维的制备及在组织工程中的应用
- Preparation of chitosan-based electrospinning nanofibers and their application in tissue engineering
- 海洋科学, 48(10): 62-75
- Marine Sciences, 48(10): 62-75.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20211031002
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文章历史
- 收稿日期：2021-10-31
- 修回日期：2022-03-02
组织工程是一个工程学和生命科学相结合的跨学科领域, 其旨在开发一种生物代替物来促进受损组织的修复和再生[1]。生物支架是组织工程中十分重要的一个部分[2], 其需要与天然细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的组成和结构相似, 为组织中的细胞提供支持, 以修复受损组织[3]。
静电纺丝是一种简易、经济、高效的一步制备连续性纳米级至微米级纤维的技术, 是获得聚合物纳米纤维的常用方法[4-5]。壳聚糖(chitosan, CS)是一种天然无毒、丰度高、成本低、生物学性能(抗菌性、止血性、促愈合性、生物相容性)优良的天然阳离子多糖[6]。目前已有诸多研究通过静电纺丝技术将CS制备成CS基纳米纤维, 包括单组分CS纳米纤维[7]、CS复合纳米纤维[8]、CS衍生物的纳米纤维[9]等。基于CS的静电纺丝纳米纤维同时结合了纳米纤维的结构优势和CS独特的生物学性能, 可作为组织再生支架, 有效地模拟ECM的组成、形态、结构和功能[10], 促进受损组织的修复与再生[2], 在组织工程领域具有广阔的应用前景。
1 静电纺丝概述如图 1所示, 静电纺丝的基本设备包括: 高压电源、注射泵、喷丝头和收集器[11-12]。聚合物溶液的静电纺丝是目前获得高分子聚合物纳米纤维的常用方法[13]。在聚合物溶液的静电纺丝过程中, 聚合物液体从喷丝头挤出后因表面张力作用而形成悬挂式球形液滴。在电场的作用下, 液滴表面相同电荷之间的静电斥力使液滴变形为圆锥形(泰勒锥)。当外加电压超过临界电压时, 液滴的静电斥力克服其表面张力, 带电射流从泰勒锥的尖端喷射出来。起初带电射流沿直线运动, 随后由于“鞭动不稳定性”, 射流弯曲、拉伸、延长、变细。伴随着溶剂的挥发, 射流迅速凝固, 最终沉积在收集器上形成纳米纤维[14-15]。泰勒锥的形成和“鞭动不稳定性”是静电纺丝技术的2个关键点, 其中泰勒锥的形成是静电纺丝成功的先决条件; 而“鞭动不稳定性”则是获得极细纳米纤维的必要条件, 同时“鞭动不稳定性”也会极大影响纤维的形态[10]。
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| 图 1 静电纺丝纳米纤维的制备工艺示意图 Fig. 1 Process for the preparation of electrospinning nanofibers |
聚合物溶液静电纺丝的影响因素具体可以分为3类[3, 6, 16]: (1)设备因素(外加电压强度、液体流量/流速、喷丝头与收集器之间的距离等); (2)溶液因素(聚合物的分子量、溶液的黏度和表面张力、溶液的浓度和导电性、溶剂的挥发性和介电常数等); (3)环境因素(相对湿度、环境温度)。这3类因素之间相互作用, 共同控制静电纺丝的过程, 决定了静电纺丝能否成功进行以及所得聚合物纳米纤维的直径、形态、结构和性能[10, 17]。
相对来说, 在3类影响因素中, 溶液因素对聚合物静电纺丝的影响更大。聚合物的分子量和浓度反应了聚合物的链缠结情况[18], 当分子量和浓度过低时, 聚合物分子链之间的缠结作用很弱, 射流将破碎成小液滴从而收集到细小的颗粒或微珠, 这一过程通常被称为静电喷雾[14, 16]。因此为了保证足够的链缠结并获得连续的纳米纤维, 聚合物需要具备足够的分子量并超过最小浓度[10, 14]。此外, 由于聚合物的静电力大于表面张力才能形成射流, 故降低溶液的表面张力(通常引入表面活性剂)和提高溶液的导电性(通常引入盐或无机酸)有助于提高纺丝效果[10, 16]。
2 壳聚糖基静电纺丝将CS制成纳米纤维可以进一步扩大其应用范围, 而静电纺丝是目前制备CS基纳米纤维最常用的方法之一[13, 19]。然而, CS溶液具有很高的黏度[20], 氨基的存在会增加溶液的表面张力[21], 这使得CS的静电纺丝变得困难。同时, 在静电纺丝的过程中, 高压电使CS链上带正电荷的基团之间形成巨大的静电斥力[22], 从而抑制连续纤维的形成。此外, 电场下CS分子内的强氢键作用会形成三维网络, 阻止聚合物链段的自由移动[5, 23]。基于上述3点, 纯CS溶液的静电纺丝十分具有挑战性。
2.1 单组分CS静电纺丝由于CS具有刚性分子链、高结晶度和强氢键作用[24], 只有极少数溶剂够能实现单组分CS的静电纺丝。Ohkawa等[7]发现三氟乙酸作为溶剂可以实现纯CS的静电纺丝, CS在三氟乙酸溶液中的浓度影响纳米纤维的形态, 8%浓度的CS形成的纤维几乎没有串珠, 直径为490 nm。向溶剂中加入二氯甲烷后能够进一步优化纤维形态, 得到平均直径更小(330 nm)的均匀纳米纤维。然而三氟乙酸和二氯甲烷等有机溶剂生物相容性较差[25], 会破坏天然CS的结构和性质[3], 考虑到它们的毒性和刺激性, 人们使用乙酸溶液来静电纺丝CS纳米纤维。Geng等[26]将浓度为90%的乙酸作为溶剂, 在4 kV/cm的电场下, 成功实现了纯CS(浓度为7%、中等分子量)的静电纺丝, 研究表明乙酸溶液浓度高于30%是形成CS纳米纤维的前提条件, 乙酸浓度显著影响着CS的表面张力, 浓度越高, CS溶液的表面张力越小, 越有利于形成纳米纤维。
2.2 CS复合静电纺丝合成/天然聚合物与CS混合静电纺丝是生产均匀CS基复合纳米纤维简易有效的方法。这些合成/天然聚合物可以充当助纺剂和纤维成型促进剂[12], 改善CS的可纺性并赋予CS基复合纳米纤维更优良的性能。
为了增强CS的链缠结和可纺性[27], 通常将CS与合成聚合物混合静电纺丝以获得均匀的CS基纳米纤维。常用的合成聚合物有: 聚氧化乙烯(polyethylene oxide, PEO)[28]、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)[29]、聚己内酯(polycaprolactone, PCL)[30]和聚乳酸(polylactic acid, PLA)[31]等等。将合成聚合物与CS结合能够同时发挥二者的优势, 其中CS能够赋予合成聚合物更好的生物学功能, 合成聚合物则能赋予CS更好的加工性和力学性能[32]。PEO和PVA是静电纺丝中广泛使用的水溶性聚合物, 具有良好的成纤维性、生物相容性、可降解性、环境友好性及化学稳定性[14, 33], 可以与CS之间形成氢键以破坏CS链的自缔合, 增强CS的链缠结, 从而显著提高CS的可纺性, 生产出连续的纳米纤维[19]。
同时也有大量研究将CS与天然聚合物共纺以获得综合性能更加优良的纳米纤维。常见的天然聚合物有: 海藻酸钠(sodium alginate, SA)[34]、透明质酸(hyaluronic acid, HA)[35]、普鲁兰多糖[36]、丝素蛋白(silk fibroin, SF)[37]、胶原[38]、玉米醇溶蛋白[39]等。有研究表明CS与蛋白质之间存在显著的亲和力[21], Chen等[40]将CS与胶原共混静电纺丝后发现二者存在分子间相互作用, 随着共混物中CS含量的增加, CS/胶原复合纳米纤维的直径减小[41]; 且CS与胶原的比例会影响复合纳米纤维的力学性能, 降低CS含量可以提高纳米纤维的极限拉伸强度[42]。
2.3 CS衍生物的静电纺丝CS的晶体结构较硬, 在水中的溶解度较差, 故其在静电纺丝中的利用受限。将CS化学修饰成其衍生物可以大大提高其可纺性, 获得亲水性能优良的静电纺丝纳米纤维并进一步拓展其应用范围[13, 43]。目前诸多CS衍生物如羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan, CMCS)[9, 43-44]、季铵化壳聚糖(quaternized chitosan, Qch)[45-47]、聚乙二醇化壳聚糖[48]、己酰化壳聚糖[49]、半乳糖化壳聚糖[50], 已被静电纺丝成相应的纳米纤维应用于不同领域。
其中CMCS和Qch是常用于制备静电纺丝纳米纤维的CS衍生物, 均具有良好的水溶性、抗菌性和生物相容性[44]。研究证明, 羧甲基的引入大大降低了壳聚糖的结晶度而提高了可纺性[43], 同时CMCS具有良好的血液相容性, 随着CMCS含量的升高, 所获纳米纤维中珠状物减少, 血小板在纳米纤维上的黏附和聚集减少, 纳米纤维的血液相容性增强[9]。CS经过季铵化后分子间的氢键作用削弱, 从而可纺性提高。ALIPOUR等[45]发现Qch含量的增加可以提高Qch/PVA共混物的可纺性、降低纳米纤维的直径。Qch除比CS拥有更高的抗菌活性外, 还拥有良好的抗肿瘤作用[46]和病毒清除率[47]。
3 壳聚糖基静电纺丝纳米纤维在组织工程中的应用天然组织的ECM是一种纳米纤维凝胶网络结构, 主要由蛋白和糖胺聚糖构成[4, 37], 细胞镶嵌在这些纳米纤维凝胶网络中构成组织。CS与糖胺聚糖化学结构相似[51-52], CS基静电纺丝纳米纤维能够模拟ECM的结构和功能[53], 优良的抗菌性、止血性、组织亲和性、血液相容性、促愈合性、免疫惰性、生物相容性、可生物降解性和力学性能使其成为一种理想的组织工程材料, 在组织工程领域表现出很高的应用前景[6]。诸多学者先后研究了CS基静电纺丝纳米纤维在骨、皮肤、血管和神经等组织工程中的应用。将CS与其他天然聚合物共混静电纺丝为复合纳米纤维, 或在CS基纳米纤维中引入天然生物活性物质、生物活性陶瓷、抗生素、纳米粒子等功能性成分可以赋予纳米纤维更多的优良性能以及更好的应用效果(图 2)。
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| 图 2 CS基静电纺丝纳米纤维在组织工程领域的代表性应用 Fig. 2 Representative applications of CS-based electrospinning nanofibers in tissue engineering 注: 每种功能性成分进行一个举例 |
骨组织工程的研究热点是开发一种具有合适的孔隙率和孔径大小、良好的生物力学稳定性和成骨能力的支架材料, 以促进骨的修复、愈合和再生[6, 39]。CS基静电纺丝复合纳米纤维因其高孔隙率、良好的机械强度以及优良的骨矿化诱导能力, 而被广泛的用作骨组织工程支架, 有效地模拟了天然骨基质的结构和功能, 促进了成骨和骨再生[37, 51](表 1)。
| 静电纺丝纳米纤维类型 | 静电纺丝原料 | 添加成分 | 细胞/动物模型 | 参考文献 |
| CS/生物活性陶瓷静电纺丝纳米纤维 | CS/PVA | 负载HAp纳米粒子和富血小板血浆 | 间充质干细胞 大鼠颅盖缺损 |
[56] |
| CS-g-PCL /PCL | 负载HAp纳米粒子 | 人骨肉瘤细胞 | [54] | |
| CS/聚酰胺-6 | 涂覆HAp | 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞 | [55] | |
| CS/ PEO | 负载BGs | 人成骨肉瘤细胞 | [57] | |
| CS/天然蛋白静电纺丝纳米纤维 | CS/胶原/PCL | 无 | 人牙周膜细胞 大鼠颅骨缺损 |
[30] |
| CS/胶原/PEO | 无 | 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞 大鼠颅骨缺损 |
[25] | |
| CS/SF | 无 | 人胎儿成骨细胞 | [37] | |
| CS/SF | 无 | 人骨髓间充质干细胞 | [61] | |
| CS/玉米醇溶蛋白/聚氨酯 | 多壁碳纳米管 | 小鼠胚胎成骨细胞前体细胞 | [39] | |
| 注: CS: 壳聚糖; PVA: 聚乙烯醇; HAp: 羟基磷灰石; PCL: 聚己内酯; CS-g-PCL: 壳聚糖/聚己内酯接枝共聚物; PEO: 聚氧化乙烯; SF: 丝素蛋白; BGs: 生物活性玻璃 | ||||
羟基磷灰石(hydroxyapatite, HAp)是天然骨骼中的重要无机成分, 具有优良的骨诱导能力。作为一种生物活性陶瓷, HAp可以与CS结合制备复合静电纺丝纳米支架用于骨组织工程[54-56]。Sani等[54]合成了一种PCL/CS接枝共聚物(CS-g-PCL), 并将其与HAp纳米粒子结合来制备静电纺丝纳米纤维, 研究表明CS-g-PCL含量显著影响纳米纤维的直径并且该支架具有良好的骨修复功能。负载HAp纳米粒子和富血小板血浆的CS/PVA静电纺丝纳米纤维具有高生物相容性、骨传导性和导电性, 接种于该支架的间充质干细胞表现出高碱性磷酸酶活性和钙含量; 将支架植入大鼠体内可以较好地修复颅骨缺损[56]。
生物活性玻璃(bioactive glasses, BGs)是另一类常用于骨组织工程的生物活性陶瓷[57]。Boschetto等[28]表明CS/PEO/BGs静电纺丝纳米纤维作为钛合金的涂层可以提高钛合金的抗菌性能和骨传导性能, 促进矿化组织的形成。
3.1.2 CS/天然蛋白静电纺丝纳米纤维用于骨组织工程天然骨ECM具有复杂的多层纳米级蛋白质纤维和钙沉积的微观结构[51]。在CS基静电纺丝中加入天然蛋白质能够更好地仿生骨ECM, 制备出的CS/天然蛋白纳米纤维支架在骨组织工程中可以发挥更好的效果。
1) 胶原蛋白
胶原蛋白是动物结缔组织(骨、软骨等)的主要成分[30], Arpornmaeklong等人[58]曾报道CS-胶原复合海绵能够集合2种成分的优势, 促进成骨细胞的体外生长和分化, 其中CS可以增加海绵的机械强度和基质的结构稳定性, 并降低胶原酶对胶原的降解率; 而胶原蛋白则可改善海绵的孔径、密度以及结构均匀性[59]。因此将胶原和CS结合制备电纺复合纳米纤维也是一种积极的策略。
高波等[25]研究表明, CS/胶原静电纺丝纳米纤维具有更强的成骨性能, 能够有效修复大鼠颅骨缺损。Guo等[30]通过静电纺丝法制备了纯胶原膜和CS/胶原复合膜, 发现CS/胶原复合膜具有更高的拉伸强度和更稳定的降解率, 规则和高度多孔的结构有利于人牙周膜细胞的黏附和增殖; 大鼠颅骨缺损体内实验证明, CS/胶原复合膜中骨碱性磷酸酶和骨钙素含量更高且新骨形成更为活跃(更高的骨体积、骨体积/总体积、骨小梁数量; 更低的骨小梁间距)。
2) 丝素蛋白
SF是蚕丝的主要成分, 含有丰富的氨基酸, 具有良好的生物相容性、生物降解性和极低的炎症反应[60]。Chen等[37]通过静电纺丝制备了平均直径为215~478 nm的CS/SF复合纳米纤维支架, 研究表明该支架在培养基中可保持原有结构长达54 d, 能够支持人胎儿成骨细胞(human fetal osteoblasts, hFOB)的生长和成骨分化, 其中SF促进hFOB增殖, CS促进hFOB分化。陈飞扬等[61]将人骨髓间充质干细胞分别接种于CS/SF支架和SF支架表面进行成骨诱导培养, 发现与单纯的SF支架相比, CS/SF支架的钙元素含量更高, 人骨髓间充质干细胞周围矿化颗粒更为密集且钙化结节明显增多, 说明CS对细胞成骨分化有更为积极的影响。
3) 玉米醇溶蛋白
玉米醇溶蛋白具有抗氧化性和抗菌性, 能够与HAp形成共价键和电价键[62], 可以作为天然骨生长蛋白的替代物以诱导成骨[63]。将CS、玉米醇溶蛋白和多壁碳纳米管结合静电纺丝能够发挥强大的协同作用, 得到高生物力学强度、亲水性和抗菌效果的支架, 创造类骨细胞的微环境, 促进小鼠胚胎成骨细胞前体细胞的生长、增殖、浸润和原位分化, 具有良好的骨整合行为[39]。
3.2 皮肤修复和再生皮肤是人体的最外层, 具有屏障保护和调节体温等功能, 皮肤与外界持续接触, 极易受到损伤[12]。伤口常伴有皮肤完整性破坏以及一定量正常组织的缺失, 容易造成皮肤正常结构和功能受损[53]。
皮肤组织工程是促进伤口愈合的重要手段[36], 使用CS静电纺丝纳米纤维修复皮肤创面, 以促进伤口愈合, 避免更多的急慢性感染和并发症, 是当前的研究热点[5]。在CS基静电纺丝纳米纤维中负载天然生物活性物质[29, 31, 35-36, 64-65]、生物玻璃[66]、抗生素[34, 67]、金属单质及其氧化物[68-69]等功能性成分可赋予纳米纤维更优良的功效, 实现药物在伤口部位的缓释, 为减少创面感染、加速皮肤修复再生提供更多有效的选择。
目前已经有许多学者研发出了多种CS基静电纺丝纳米纤维以针对性地治疗不同的伤口类型, 促进皮肤的修复和再生, 如表 2所示。
| 伤口类型 | 静电纺丝原料 | 功能性成分 | 细胞/动物模型 | 参考文献 |
| 全皮层伤口 | CS/PVA | 紫草素纳米晶 | 小鼠全皮层伤口模型 | [29] |
| CS/PEO | 万古霉素 | 人真皮成纤维细胞 大鼠全皮层缺损模型 |
[67] | |
| CS/胶原 | 无 | 大鼠全皮层伤口模型 | [71] | |
| CS+PEO为原料通过双喷头(2个喷头的物质分别为HA和Gel)静电纺丝得到CS-Gel/HA | HA或Gel | 正常人真皮成纤维细胞 大鼠全皮层伤口模型 |
[35] | |
| 烧伤伤口 | CS/普鲁兰多糖 | 糖胺聚糖(HA或硫酸软骨素) | 人脐静脉内皮细胞 成纤维细胞 小鼠烧伤/切除模型 |
[36] |
| CS/PEO | 菠萝蛋白酶 | 人皮肤成纤维细胞 大鼠烧伤创面 |
[65] | |
| CS/SA/PVA同轴静电纺丝 | 积雪草苷 | 大鼠深Ⅱ度烧伤创面 | [64] | |
| CS/SA | 庆大霉素 | 小鼠成纤维细胞 小鼠局部烧伤模型 |
[34] | |
| 糖尿病伤口 | CS/PVA、CS/PCL/PVA | 无 | 大鼠糖尿病背部皮肤伤口 大鼠糖尿病足伤口 |
[8] |
| CS/ PEO | 纳米银 | 小鼠成纤维细胞 | [68] | |
| CS/PVA | 氧化锌 | 家兔糖尿病伤口 | [69] | |
| CS/PLA | 鱼肝油 | 大鼠糖尿病伤口 | [31] | |
| CS/PVA/纳米生物玻璃的3层纳米纤维膜 底层: CS、中间层: CS/PVA、顶层: PVA/纳米生物玻璃 |
纳米生物玻璃 | 大鼠全皮层伤口模型 小鼠糖尿病慢性创面模型 |
[66] | |
| 注: CS: 壳聚糖; PVA: 聚乙烯醇; PCL: 聚己内酯; PEO: 聚氧化乙烯; PLA: 聚乳酸; Gel: 明胶; SA: 海藻酸钠; HA: 透明质酸 | ||||
全皮层创面由于真皮和皮下组织发生损伤而愈合时间更长(大于21 d)[70], 研究表明基于CS的静电纺丝纳米纤维对全皮层伤口的愈合具有积极的促进作用[35, 71], 而负载抗菌性和抗炎性功能成分(紫草素[29]、万古霉素[67])的CS纳米纤维, 相较于未负载的来说[71], 对全皮层伤口的治疗效果更为显著。左凌楠[29]提出载紫草素的CS/PVA纳米纤维膜能促进皮肤组织新生, 6 d内全皮层伤口的愈合率高达78.87%, 10 d伤口几乎完全愈合。紫草素作为一种抗菌、抗炎的天然产物[72], 其加入到纳米纤维中能够发挥和万古霉素近似的伤口愈合效应, 由此推测在CS纳米纤维中添加具有抗菌和抗炎作用的天然产物可能是替代抗生素发挥作用的良好方案。
3.2.2 CS基静电纺丝纳米纤维治疗烧伤伤口在各种皮肤伤口中, 烧伤创面容易发生感染和产生不正常的疤痕, 导致高发病率和死亡率。Bakhsheshi-Rad等[34]将庆大霉素与CS/SA静电纺丝纳米纤维结合, 在治疗烧伤创面上取得了良好的抗菌和促愈合效果。相比于抗生素, 天然生物活性物质的副作用更低、生物相容性更好, 因而在烧伤创面治疗方面受到了广泛的关注[36, 64-65]。
糖胺聚糖中的硫酸软骨素和HA在不同阶段的皮肤组织再生和成熟中起着至关重要的作用。Sandri等[36]以CS/普鲁兰多糖为基础, 成功实现了CS与相反电荷多糖的混纺(CS为阳离子; 硫酸软骨素、HA为阴离子)。该研究表明硫酸软骨素或HA的添加能够更好地促进皮肤修复, 其中CS/普鲁兰多糖/硫酸软骨素的支架性能最佳, 在体外拥有最佳的细胞黏附和增殖性能; 在体内(小鼠烧伤/切除模型)拥有最佳的促愈合能力。
菠萝蛋白酶是从菠萝中提取的一种粗提物, 在治疗烧伤和炎症方面具有显著疗效。Bayat等[65]使用负载菠萝蛋白酶的CS/PEO静电纺丝纳米纤维治疗大鼠的烧伤创面, 发现与单一的CS纳米纤维相比, 添加2%的菠萝蛋白酶能使烧伤创面在21 d内几乎完全愈合。
3.2.3 CS基静电纺丝纳米纤维治疗糖尿病伤口糖尿病伤口不遵循创面愈合的正常阶段顺序, 通常停滞在炎症反应阶段, 无法过渡至增殖期。长期反复的细菌感染、不受调控的炎症反应、免疫功能受损和血管生成不良极易导致糖尿病伤口的推迟愈合, 久治不愈[10, 70]。
Gholipour-Kanani等[8]表明CS基静电纺丝纳米纤维能够有效治疗糖尿病背部皮肤伤口和糖尿病足伤口。在CS纳米纤维中添加鱼肝油[31]、抗菌成分(纳米银[68]、氧化锌[69])则更有利于糖尿病伤口的愈合。
为了取得更好的糖尿病伤口治疗效果, Chen等[66]设计了一种具有空间结构的3层伤口敷料(底层为CS静电纺丝纳米纤维, 中层为CS/PVA纳米纤维, 顶层为纳米生物玻璃/PVA纳米纤维), 这种空间结构优化了各组分的功能, 为伤口愈合提供了更适宜的微环境。该敷料能够显著抑制铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌, 并通过上调血管内皮生长因子、转化生长因子β等生长因子和下调肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等炎症因子来发挥作用, 在12 d内能够显著促进糖尿病小鼠的创面愈合, 同时也能显著加速大鼠的全皮层创面闭合。
3.3 血管组织工程大口径(内径 > 6 mm)人工血管已经取得了深入研究和临床应用, 但是小口径人工血管则可能由于生物相容性差而容易引起血栓形成和再狭窄[73-74]。为了保证血管的长期稳定以及畅通, 小口径血管移植物需具备良好的抗凝血性、抗血栓性、血液相容性和足够的力学强度[73, 75-76]。目前主要有两种方法改善小口径人工血管的血液相容性: 表面修饰和药物递送(将抗凝物质或生长因子载入移植物中)[77]。将抗凝血物质与CS结合获得静电纺丝纳米纤维支架, 或对CS表面修饰后将其静电纺丝为纳米纤维支架, 可赋予支架优良的性能, 原位诱导血管再生, 保持良好的血液相容性和血流畅通性, 在血管组织工程中具有良好的应用效果(表 3)。
| 静电纺丝纳米纤维类型 | 静电纺丝原料 | 纳米纤维的性质功能 | 参考文献 |
| 抗凝血物质/CS静电纺丝纳米纤维 | 肝素/(CS/胶原/ PLCL)同轴静电纺丝 芯液: 肝素 壳液: CS/胶原/ PLCL |
抗凝血、抗血栓、抗血小板黏附 良好的血液相容性和生物相容性 高肝素包封率, 稳定持续缓释肝素 机械性能与天然血管匹配良好 |
[76] |
| 岩藻多糖/CS/PVA | 抗凝血、抗血栓、抗血小板黏附 良好的血液相容性和生物相容性 良好的药物释放性能和生物降解性 机械性能满足天然血管的需求 |
[81] | |
| 海带多糖/CS/PVA | 抗凝血、抗血栓、抗血小板黏附 良好的血液相容和生物相容性 良好的药物释放性能和生物降解性 力学性能与人体血管相近 |
[82] | |
| 表面修饰的CS静电纺丝纳米纤维 | PEG-CS/PLCL | 促进血管生成, 高度类似自体血管 良好的血液相容性和力学性能 良好的结构完整性 |
[48] |
| CS/PCL+ CMCS /PCL共静电纺丝 | 抗菌、抗血栓 促进人脐静脉内皮细胞的生长 良好的血液相容性 良好的力学性能、生物降解性能 |
[74] | |
| 注: CS: 壳聚糖; PVA: 聚乙烯醇; PCL: 聚己内酯; PEG-CS: 聚乙二醇化壳聚糖; PLCL: 聚L-乳酸-己内酯; CMCS: 羧甲基壳聚糖 | |||
肝素是一种经典的抗凝剂, 常用于预防或治疗血栓性疾病。肝素和抗凝血酶结合发挥抗凝血活性, 进而在凝血级联中抑制Xa和IIa因子的激活[78]。Yin等[76]通过同轴静电纺丝成功地制备了运载肝素的CS/胶原/聚L-乳酸-己内酯[Poly(L-lactic acid-co-epsilon-caprolactone), PLCL]纳米纤维移植体, 研究表明肝素可以很好地封装在纤维移植体中并缓释45 d以上, 移植体在肝素释放3周后仍表现出良好的抗血小板黏附性能, 且其良好的机械性能(抗拉强度、缝线保留强度、破裂压力和顺应性)与天然血管有很好的匹配度。
岩藻多糖具有良好的抗凝血和抗血栓效果, 与肝素在基底膜上的硫酸盐结构类似[79-80]。Zhang等[81]将岩藻多糖与CS/PVA共混得到静电纺丝纳米纤维支架, 发现该支架具有良好的吸水能力、充足的孔隙率、增强的药物释放性和低细胞毒性。与CS/PVA支架相比, 岩藻多糖的添加使支架的降解程度更高, 在含有0.15%溶菌酶的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中浸泡21 d的降解率为65.11%, 这可能与CS和岩藻多糖之间的静电相互作用以及弱离子键合力有关。同时岩藻多糖的添加显著延长了活化部分凝血活酶时间和凝血酶时间。
同样, 将海带多糖与CS/PVA混合静电纺丝也能获得具有优良抗凝血、抗血栓和血液相容性的纳米纤维支架, 支架的力学性能[(798±58) kPa的拉伸强度和37%±2.2%的断裂伸长率]接近天然血管, 在血管组织工程中应用潜力巨大[82]。
3.3.2 表面修饰的CS静电纺丝纳米纤维用于血管组织工程CS经表面修饰后形成水溶性的CS衍生物是另一种提高CS基小口径人工血管血液相容性和移植通畅率的方法。
聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)亲水性优良、毒性低、生物相容性好、生物降解性强, 是理想的接枝聚合物[14], 已被用于修饰材料表面的血液相容性[83]。用PEG对CS进行表面修饰可以提高CS的水溶性以及CS对有机溶剂的亲和力[84]。Yin等[48]利用PEG-CS和PLCL通过静电纺丝技术制备了双层小直径血管移植材料, 结果表明该材料的血液相容性和力学性能良好。犬股动脉模型证明PEG-CS移植物具有良好的结构完整性, 能实现内皮细胞、平滑肌细胞的快速生长和血管生成相关蛋白的高表达水平。
Wang等[74]将CS修饰成水溶性更好的CMCS, 采用PCL/CMCS(内层)和PCL/CS(外层)共静电纺丝法制备了不对称的双层血管移植物, 以赋予移植物更好的血液相容性和优于天然血管的力学性能。其中PCL/CMCS内层作为抗血栓成分, 能够延长凝血时间并明显促进内皮细胞的生长; PCL/CS外层作为抗菌成分, 能够显著抵抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(杀灭率分别为64%和73%)。
3.4 神经组织工程神经导管支架已成为自体神经移植物的替代材料, 对治疗周围神经损伤有着至关重要的作用。静电纺丝纳米纤维可以作为一种新型的神经导管支架, 具备良好的生物相容性、可控的生物降解性、合适的通透性与力学性能, 已被广泛应用于神经组织工程领域[22, 85-86]。除了提供结构支撑, 静电纺丝神经导管支架还可以作为功能靶向物质或生物活性物质的载体[21]。将功能性物质和CS静电纺丝纳米纤维结合得到的功能化纳米纤维, 能够更好地促进神经修复和再生(表 4)。
| 静电纺丝原料 | 功能性物质 | 纳米纤维的性质功能 | 参考文献 |
| CS/PCL | AuNPs | 导电性 促进雪旺细胞的增殖和黏附 促进周围神经再生 保护和控释神经营养因子 |
[86] |
| CS/PVA | NGF | 高比表面积和高互联的多孔结构 促进支架与细胞生存环境之间的营养物质和代谢废物的有效交换 促进NGF的局部持续释放 促进神经细胞的存活、生长和增殖 |
[21] |
| CS/PCL | SA水凝胶(含有NT-3和结膜间充质干细胞) | 促进结膜间充质干细胞的增殖和分化 持续释放NT-3 提高神经特异性基因的表达 降低炎症反应 促进神经元分化, 诱导神经损伤后的再生 合适的生物降解性、增强的生物相容性 |
[87] |
| 注: CS: 壳聚糖; PVA: 聚乙烯醇; PCL: 聚己内酯; SA: 海藻酸钠; NGF: 神经生长因子; AuNPs: 金纳米粒; NT-3: 神经营养因子-3 | |||
1) CS静电纺丝纳米纤维负载金纳米粒
金纳米粒(Au nanoparticles, AuNPs) 具有独特的光学电学特性以及良好的生物相容性, 能够增加支架的导电率进而增强神经细胞间的电信号传递。Saderi等[86]以CS为还原剂与稳定剂制备了球形的导电AuNPs, 并将其掺杂在CS/PCL的静电纺丝纳米纤维支架中。与单纯的CS/PCL支架相比, AuNPs的加入显著提高了支架的导电性和雪旺细胞的增殖率。此外, 支架能够支持雪旺细胞的附着和铺展, 并保留雪旺细胞特有的细胞形态和表型。
2) CS静电纺丝纳米纤维负载神经生长因子
神经生长因子(nerve growth factor, NGF)能够促进周围神经再生, 在交感和感觉神经元的生存和维持中起着关键作用。载NGF的CS/PVA静电纺丝支架, 为SKNMC人神经上皮瘤细胞系和U373人神经胶质瘤细胞系在孔隙率、分子结构和纤维直径方面提供了最佳的微环境。NGF作为一种生化信号, 在支架中能够实现长时间和高效的释放, 对两种细胞系的存活、生长和增殖起到了积极的促进作用[21]。
3) 含神经营养因子-3的SA水凝胶修饰CS静电纺丝纳米纤维
Habibizadeh等[87]将含有神经营养因子-3 (neurotrophic factor-3, NT-3)和结膜间充质干细胞的SA水凝胶微层与CS/PCL静电纺丝纳米纤维结合, 获得了同时具备纳米纤维和水凝胶优点的三维支架。动物实验发现, 该支架在大鼠体内能够持续且大量缓释NT-3, 促进了巢蛋白等基因的高度表达, 并且有效地促进了细胞分化以及神经修复再生。
3.4.2 定向CS纳米纤维用于神经再生静电纺丝技术可以通过控制工艺参数获取定向纳米纤维支架, 定向纳米纤维支架能够更好地接触、引导神经细胞和轴突的生长[4]。已有研究表明CS定向纳米纤维比CS随机取向纳米纤维更有利于神经的修复和再生[85, 88-89]。与随机CS纳米纤维相比, 定向CS纳米纤维降解速度更慢, 对神经细胞增殖存在更好的促进作用[85], 能够引导雪旺细胞和轴突沿着纤维方向定向生长[89]。Wang等[88]制备了随机、定向以及双层(随机+定向)CS静电纺丝纳米纤维网管, 研究发现在这3组网管中, 定向组的轴突数量、轴突直径、轴突面积和神经面积最大, 对大鼠坐骨神经缺损的修复效果最好。该研究再次印证了定向CS纳米纤维在神经修复再生中的重要作用。
4 结论与展望目前, 用于组织工程的CS基静电纺丝纳米纤维通常是将CS与功能性成分结合, 这些功能性成分包括天然活性物质、纳米颗粒、抗生素、生长因子等, 其中大多数的功能性成分为天然活性物质, 例如天然多糖、天然蛋白等, CS和这些成分均具有极佳的生物相容性、生物可降解性和生理活性, 因而在骨、皮肤、血管和神经组织工程中取得了较好的研究成果。根据目前CS基静电纺丝纳米纤维在组织工程中的研究来看, 尚且存在一些不足之处, 为了满足实际需求, 未来的研究工作还需要考虑和解决一些问题, 并进一步探索和完善, 以更好地开发CS基静电纺丝纳米纤维在组织工程领域的应用潜能, 具体体现在下述几个方面(图 3)。
1) 目前三氟乙酸、三氟乙酸-二氯甲烷的混合物仍是CS静电纺丝的常用溶剂, 这些溶剂的毒性、刺激性以及对环境的污染性不容忽视, 因此未来应当开发更有效、更环保的绿色溶剂来溶解CS, 以大批量生产毒性更低、生物安全性更佳的CS基静电纺丝纳米纤维。
2) 目前CS基静电纺丝纳米纤维在组织工程领域的研究仍停留在体外细胞实验和体内动物实验, 虽然已有大量研究证明CS基静电纺丝纳米纤维能够促进细胞黏附、迁移、增殖和分化, 并促进动物组织缺损的修复和再生。但这些材料的临床应用仍面临挑战, 还需要进一步的临床试验才能更可靠地应用于实际疾病的治疗。
3) 人们可以根据预期的临床应用来设计组织工程支架, 选择合适的材料与CS结合, 并优化静电纺丝纳米纤维的尺寸、形态、图案和取向, 以制备出具有特殊结构、物理和生物特性的纳米纤维。
4) 尽可能多地将天然ECM中的成分与CS纳米纤维结合, 包括糖胺聚糖(透明质酸、硫酸软骨素等)、结构蛋白(胶原蛋白、弹性蛋白)、黏附性糖蛋白(层黏蛋白、纤连蛋白)、生长因子、可溶性成分等, 以在组成、结构和功能方面最大地接近于原生ECM, 达到良好的组织治疗效果。
5) 将近场静电纺丝与3D打印技术结合, 生产三维结构的纳米纤维支架[90], 诱导更真实的细胞行为, 以更好地实现组织的修复和再生。
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