2024, Vol. 48
文章信息
- 赵启宇, 陈振帆, 刘超, 孙璐, 甄毓, 张清春. 2024.
- ZHAO Qiyu, CHEN Zhenfan, LIU Chao, SUN Lu, ZHEN Yu, ZHANG Qingchun. 2024.
- 四种核酸快提法提取藻华微藻核酸效果的对比研究
- Comparative study on the effects of four rapid extraction methods on extracting harmful microalgal nucleic acids
- 海洋科学, 48(11): 32-45
- Marine Sciences, 48(11): 32-45.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240321001
-
文章历史
- 收稿日期：2024-03-21
- 修回日期：2024-05-05
2. 青岛海洋科技中心海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 中国科学院大学, 北京 100049;
4. 中国科学院海洋大科学研究中心, 山东 青岛 266071;
5. 中国海洋大学环境科学与工程学院 海洋环境与生态教育部重点实验室, 山东 青岛 266100
2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China;
5. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China
有害藻华(harmful algal blooms, HABs)是指水体中的部分有毒有害微藻、大型藻类或者蓝细菌等生物量出现暴发性增长或集聚, 给水生生态系统平衡以及人类健康和福祉造成危害的现象[1]。随着全球变化和人类活动影响加剧, 近海有害藻华暴发规模、频率和危害呈现上升趋势, 藻华物种呈现多样化的演变趋势[2]。面对这一现状, 对有害藻华藻种进行鉴定和丰度检测, 特别是现场、原位快速检测显得尤为重要, 将有助于及时识别藻华类型, 监测藻华动态, 防控藻华危害。藻华藻种多为微藻, 个体微小或形态特征相似, 难以用肉眼或显微镜准确鉴别; 再者, 传统的形态学检测方法耗时费力, 难以实现藻华微藻现场、原位快速精准的检测需求[3]。分子生物学技术具备特异性强等优点, 克服传统方法的局限性, 为藻华微藻的准确鉴定检测提供了新技术手段[3]。分子生物学技术主要是以目标生物基因序列为靶区, 设计特异性的引物或探针, 通过扩增或杂交等反应, 再通过荧光或化学发光等方式进行信号检测, 从而实现目标生物的鉴定或定量检测[4]。
目标生物核酸的提取是大多数分子检测的基础和前提。自1869年Friedrich Miescher首次成功提取核酸以来[5], 多种核酸提取方法被发展和应用, 包括密度梯度离心法、胍盐裂解法、碱裂解法、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)裂解法、酚抽提法、离心柱纯化法和磁珠提取法等[6]。这些方法已被广泛应用于各种生物核酸物质的提取, 但它们多操作繁琐, 或高度依赖仪器设备, 难于快速、简便提取核酸物质, 无法满足藻华微藻现场、原位快速检测所需[7-8]。近年来, 已有一些商品化核酸快速提取试剂盒被用于不同生物核酸物质的提取, 但这些试剂盒中的大多数使用过程均需要借助于高速离心机的离心作用收集核酸分子, 不具备在野外进行藻华微藻核酸现场、原位提取的潜力。为此, 在前期研究的基础上, 本研究研制了两种核酸快速提取液, 并选取了2种无需离心的一步法核酸快速提取的商品化试剂盒, 同时以CTAB核酸提取液为对照, 对比分析不同核酸快提法提取藻华微藻核酸的效果。旨在于研发或筛选合适的核酸快速提取方法, 建立简单便捷的操作流程, 实现对藻华微藻核酸的有效提取, 为藻华微藻现场、原位快速分子检测方法研发和应用奠定基础。
本研究以太平洋亚历山大藻(Alexandrium pacificum)为主要测试目标藻种。该藻为一种产麻痹性毒素(paralytic shellfish toxin)的海洋甲藻, 是中国东海、南海海域常见的典型藻华微藻; 同时, 辅以多种中国近海海域常见其他不同门类的藻华微藻, 如: 东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)、抑食金球藻(Aureococcus anophageffferens)、圆海链藻(Thalassiosira rotula), 以期更全面地对比分析不同核酸快提试剂对藻华微藻核酸的提取效果。本研究
采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, RPA)和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)两种分子生物学技术作为检测方法。RPA是一种核酸等温扩增技术, 其简便操作、反应条件温和, 特别是对DNA模板纯度和浓度要求低[9]; 而PCR技术是一种经典的核酸扩增方法, 通过多轮变温循环实现目标序列的扩增, 其对DNA模板纯度和浓度等要求较RPA高[10]。本研究以这2种核酸扩增技术为检测手段, 以期更全面地对比分析不同核酸快提试剂提取的DNA质量。
1 材料与方法 1.1 实验藻株及培养条件实验中所用藻华微藻及其分离地如表 1所示。所有微藻培养于100 mL锥形瓶中, 瓶中装有50 mL的L1或L1-Si培养基。L1或L1-Si培养基是根据Guillard (1975年)提出的方案[11], 由自然海水过滤并经高温灭菌后添加对应营养盐制备得到的。微藻培养条件如下: 温度为18 ℃ ± 2 ℃, 光照强度为100 μE/(m2·s), 光暗周期为14 h∶10 h, 盐度为30±1, pH为8.0±0.1。
| 门类 | 藻种名称(中文) | 藻种名称(拉丁文) | 株系 | 分离地 |
| 甲藻 | 太平洋亚历山大藻 | Alexandrium pacificum | MEL1 | 东海 |
| 甲藻 | 东海原甲藻 | Prorocentrum donghaiense | MEL12 | 东海 |
| 甲藻 | 米氏凯伦藻 | Karenia mikimotoi | MEL83 | 东海 |
| 硅藻 | 圆海链藻 | Thalassiosira rotula | MEL110 | 南海 |
| 针胞藻 | 赤潮异弯藻 | Heterosigma akashiwo | MEL41 | 黄海 |
| 定鞭藻 | 球形棕囊藻 | Phaeocystis globosa | MEL42 | 南海 |
| 海金藻 | 抑食金球藻 | Aureococcus anophageffferens | MEL51 | 渤海 |
RPA反应的引物参考Piepenburg等人[12]提出的RPA引物设计原则, 结合GenBank中已知亚历山大藻的ITS rDNA序列信息(登录号分别为KF908811、KF908812、KF908818、KF670134、KF670136、AM238651、JX524269、EF030055、KY783640、AB538447), 以Primer Premier 6.0软件辅助设计, 并手工对比优化, 基于核糖体ITS区序列设计太平洋亚历山大藻特异性引物对, 正向引物F-AP: 5′-TGGGCAACTGTAAGCATGTATTGCAATGGA-3′, 反向引物R-AP: 5′-GCTGCATTCTTCATCATTTATTGAGCTAAG-3′, 目标片段长度为182 bp。经分子信息学分析和RPA实验验证该RPA引物对可特异性扩增太平洋亚历山大藻(结果未发表)。选择核糖体18S rDNA V4区为PCR反应的靶区, PCR反应采用真核生物18S rDNA V4区扩增通用引物对, 正向引物F-18S V4: 5′-TCCAGCTCCAATAGCGTA-3′, 反向引物R-18S V4: 5′-AATCCRAGAATTTCACCTCT-3′[13]。实验中所使用的引物均由上海生工生物公司合成。
1.3 核酸提取液筛选和配制选取擎科快速核酸提取试剂盒(后文简称为快提试剂盒A)、先达NR201快速核酸提取液(后文简称为快提试剂盒B)两种商品化核酸快提试剂盒。本研究研制的十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)-甲酰胺(formamide)核酸快提液(后文简称为SDS-formamide快提液)组成: 50 mmol/L Tris、100 mmol/L EDTA、50 mmol/L氯化钠、1% SDS、50% formamide, 调节pH 8.0左右, 室温保存。二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)-曲拉通(Triton X100)核酸快提液(后文简称为DMSO-Triton X100快提液)组成: 40% DMSO、20% Triton X-100、50 mmol/L氯化钠、10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA, 调节pH 8.0左右, 室温保存。十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)核酸提取液(后文简称为CTAB法)组成: 2% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L EDTA、1.4 mol/L氯化钠、0.2% β-巯基乙醇, 调节pH 8.0左右, 室温保存[14]。核酸模板稀释液组成: 10 mol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA, 调节pH 8.0左右, 4 ℃保存。
1.4 微藻样品采集室内培养微藻样品采集。将培养至指数生长期的太平洋亚历山大藻经显微镜计数后, 用灭菌海水稀释至50 cells/mL, 取1 mL稀释藻液在低负压40 kPa下经0.4 μm聚碳酸酯滤膜(HTTP04700, Millipore公司, 美国)过滤收集, 于−80 ℃冰箱中保存用于后期核酸的提取。分别取培养至指数生长期的东海原甲藻、米氏凯伦藻、赤潮异弯藻、球形棕囊藻和圆海链藻(藻细胞密度104 cells/mL), 以及抑食金球藻(藻细胞密度106 cells/mL)各1 mL在低负压40 kPa下分别经0.4 μm聚碳酸酯滤膜(HTTP04700, Millipore公司, 美国)过滤收集, 于−80 ℃冰箱中保存用于后期核酸的提取。
模拟野外微藻样品采集。取青岛汇泉湾自然海水, 经200 μm筛绢滤去除浮游动物与大型浮游植物, 取1 mL在低负压40 kPa下经0.4 μm聚碳酸酯滤膜(HTTP04700, Millipore公司, 美国)过滤收集, 作为自然海水背景对照。然后, 用该过滤海水将室内培养的太平洋亚历山大藻依次稀释至5、50、500、5 000 cells/mL, 各取1 mL在低负压40 kPa下分别经0.4 μm聚碳酸酯滤膜(HTTP04700, Millipore公司, 美国)过滤收集, 作为模拟野外微藻样品。同时, 用灭菌海水将室内培养的太平洋亚历山大藻也依次稀释至5、50、500、5 000 cells/mL, 也取1 mL在低负压40 kPa下经0.4 μm聚碳酸酯过滤膜(HTTP04700, Millipore公司, 美国)过滤收集, 作为实验室对照微藻样品。所有滤膜均保存至−80 ℃用于后续核酸提取。
1.5 微藻核酸提取将收集的室内培养的太平洋亚历山大藻滤膜4份从−80 ℃条件中取出, 分别放至1.5 mL离心管中, 分别加入4种不同核酸快提液500 μL, 轻微摇晃, 95 ℃高温裂解10 min, 然后各吸取5 μL核酸提取液, 使用核酸模板稀释液依次稀释101、102、103至104倍作为RPA和PCR反应实验组的核酸模板。同时, 采用CTAB法提取收集的室内培养收集的太平洋亚历山大藻的核酸, 作为RPA和PCR反应对照组的核酸模板。具体步骤如下: 将收集的室内培养太平洋亚历山大藻的滤膜从−80 ℃条件中取出, 放至1.5 mL离心管中, 加入500 μL CTAB裂解液, 在65 ℃中温浴60 min, 期间轻微摇晃振荡数次; 加入500 μL酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混合液, 室温振荡后, 经离心将上清液转至干净的1.5 mL离心管中, 重复该操作2次; 加入预冷的异丙醇溶液于−20 ℃沉淀2 h; 经离心后用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次, 干燥并溶于500 μL TE缓冲液[14]。
将收集的室内培养东海原甲藻、米氏凯伦藻、赤潮异弯藻、球形棕囊藻、抑食金球藻和圆海链藻的滤膜从−80 ℃条件中取出, 放至1.5 mL离心管中, 加入500 μL DMSO-Triton X100快提液(该快提液为经过2.7和2.8核酸快提液和提取DNA模板对扩增反应的抑制效应和抑制程度分析后筛选的最佳核酸快提液), 轻微摇晃后, 于37 ℃(该温度为2.3不同裂解温度和时长的核酸提取效果分析后筛选的裂解温度)中快速裂解10 min得到6种微藻的核酸提取液, 作为PCR反应实验组的核酸模板。同时, 也采用CTAB法提取6种微藻核酸溶液, 作为PCR反应对照组的核酸模板。
将收集的模拟野外微藻样品和实验室对照微藻样品滤膜从−80 ℃条件中取出, 分别放至1.5 mL离心管中, 加入500 μL DMSO-Triton X100快提液, 轻微摇晃后37 ℃裂解10 min, 然后吸取5 μL核酸裂解液, 使用核酸模板稀释液依次稀释101、102、103至104倍作为RPA和PCR反应的DNA模板。
以上提取的核酸溶液均保存在−20 ℃直至使用。
1.6 RPA和PCR反应体系和产物分析RPA反应使用基础型核酸RPA扩增试剂盒(KS101, 苏州先达生物公司, 中国)。RPA反应体系为10 μL, 体系组成为: RPA试剂干粉(10 μL量)一份、溶解剂4 μL、纯化水3.6 μL、10 μmol/L正反向引物各0.5 μL、DNA模板1 μL、激活剂0.4 μL。扩增条件为: 37 ℃扩增30 min, 65 ℃持续6 min以终止反应。RPA反应进行4 min时, 将反应管取出轻微振荡, 快速离心后放回仪器继续反应。RPA反应结束后, 在反应管中加入等体积(10 μL)的苯酚-氯仿溶液(苯酚∶氯仿=25∶24, 北京索莱宝科技有限公司, 中国), 快速离心5 min, 取上清液2 μL用于2%琼脂糖凝胶电泳分析。
PCR反应体系为20 μL, 体系组成为: PCR Super Mix 10 μL(AS221, 北京全式金生物公司, 中国)、纯化水8.2 μL、10 μmol/L正反向引物各0.4 μL、DNA模板1 μL。PCR程序设置为: 98 ℃预变性1 min; 98 ℃变性10 s, 50 ℃退火5 s, 72 ℃延伸10 s, 进行34个循环; 72 ℃完全延伸1 min。得到的PCR扩增产物取2 μL用于2%琼脂糖凝胶电泳分析。
RPA和PCR反应均在NOVO-G100 PCR仪(北京诺禾致源生物技术公司, 中国)中进行。
1.7 不同核酸快提液对扩增反应影响的对比分析将CTAB法提取太平洋亚历山大藻对照组核酸溶液作为RPA和PCR反应的DNA模板, 同时分别将4种快提液原液与101、102、103至104倍梯度稀释液各1 μL作为添加剂, 加入RPA和PCR反应体系中进行扩增反应, 以分析各核酸快提液成分对2种扩增反应是否有影响以及影响程度。
1.8 不同核酸快提液提取的DNA模板扩增反应效果的对比分析分别将4种核酸快提液和CTAB法提取的太平洋亚历山大藻核酸溶液与101、102、103至104倍梯度稀释液作为实验组和对照组DNA模板, 分别进行RPA和PCR扩增反应, 以对比分析不同核酸快提液提取的DNA模板的扩增反应效果。
1.9 不同裂解温度和时长的核酸提取效果对比分析通过对4种不同核酸快提液及其提取的DNA模板对扩增反应的影响的对比分析, 从中筛选出了最佳核酸快提液(DMSO-Triton X100快提液)进行不同裂解温度和时长提取藻华微藻核酸物质, 进行RPA和PCR扩增反应, 以对比分析不同条件下提取DNA模板的扩增效果, 筛选出合适的裂解温度和时长。取收集的室内培养的太平洋亚历山大藻滤膜加入500 μL DMSO-Triton X100快提液, 轻微摇晃, 分别在37 ℃、65 ℃和95 ℃下进行裂解, 每个温度条件设置10 min、30 min和60 min裂解时长, 取各条件下提取得到核酸溶液以及101、102、103至104倍梯度稀释液各1 μL作为DNA模板分别进行RPA和PCR扩增反应。以CTAB法在65 ℃裂解60 min提取太平洋亚历山大藻核酸溶液及其梯度稀释液模板作为对照组DNA模板, 进行RPA和PCR扩增反应。
1.10 六种藻华微藻核酸的提取效果分析取由筛选的最佳核酸快提液(DMSO-Triton X100快提液)和CTAB法提取的室内培养的其他6种藻华微藻核酸溶液各1 μL分别作为实验组和对照组DNA模板, 分别进行PCR扩增反应, 分析筛选的最佳核酸快提液对不同种类藻华微藻核酸的提取效果。
1.11 模拟野外样品核酸的提取效果分析将经DMSO-Triton X100快提液提取的模拟野外微藻样品和对应的实验室对照微藻核酸溶液, 以及101、102、103至104倍梯度稀释液各1 μL作为DNA模板, 分别进行RPA和PCR扩增反应, 分析模拟野外样品核酸溶液的扩增效果。
2 结果 2.1 不同核酸快提液对扩增反应影响的对比在RPA和PCR反应中, 以CTAB法提取的太平洋亚历山大藻核酸溶液为DNA模板的阳性对照组均产生明亮的目标扩增条带, 空白对照组无任何扩增条带, 说明RPA和PCR反应体系正常反应。
通过对比分析, 发现在添加快提试剂盒A快提液原液、10倍稀释液的RPA反应无扩增产物或目标扩增条带不清晰, 说明快提试剂盒A快提液原液、10倍稀释液抑制RPA扩增反应, 而102、103和104倍稀释液的RPA反应均产生明亮目标扩增条带, 抑制效应消除(图 1a)。快提试剂盒B与SDS-formamide快提液原液抑制RPA反应, 无目标扩增条带(图 1b、c)。DMSO-Triton X100快提液原液和各梯度稀释液的RPA反应产物均有目标扩增条带, 无抑制效应(图 1d)。
 |
| 图 1 添加不同核酸快提液的RPA扩增产物电泳图 Fig. 1 Electrophoretic images of amplified products of RPA reactions by adding different nucleic acid rapid extraction solutions 注: 1-5依次为快提液原液、101、102、103、104倍稀释液, PC为阳性对照, BC为空白对照 |
在PCR反应中, 快提试剂盒A与SDS-formamide快提液原液对PCR反应产生抑制效应, 无目标扩增产物, 而101、102、103和104倍稀释液的PCR反应产生明亮的目标扩增条带, 抑制效应消除(图 2a、c)。快提试剂盒B快提液原液和10倍稀释液对PCR反应产生抑制效应, 而102、103和104倍稀释液无抑制效应(图 2b)。DMSO-Triton X100快提液原液和各梯度稀释液的PCR反应产生目标扩增条带, 无抑制效应(图 2d)。
 |
| 图 2 添加核酸快提液的PCR扩增产物电泳图 Fig. 2 Electrophoretic images of amplified products of PCR reactions by adding different nucleic acid rapid extraction solutions 注: 1-5依次为快提液原液、101、102、103、104倍稀释液, PC为阳性对照, BC为空白对照 |
在RPA反应中, 以CTAB法提取的太平洋亚历山大藻DNA溶液原液、101、102、103和104倍稀释液为模板的阳性对照组都产生了目标扩增条带, 条带明亮度随着稀释倍数增加逐渐降低(图 3a); 在PCR反应中, 太平洋亚历山大藻DNA溶液原液为模板的阳性对照组产生明亮的目标扩增条带, 10倍稀释液也产生明亮度微弱的目标扩增条带, 更高稀释倍数组的目标扩增条带肉眼不可见(图 4a); 两者的空白对照均无任何目标扩增条带。结果说明RPA和PCR反应正常, RPA反应较PCR反应灵敏, 可扩增更低浓度的DNA模板。
 |
| 图 3 不同核酸快提液提取太平洋亚历山大藻核酸溶液作为DNA模板的RPA扩增产物电泳图 Fig. 3 Electrophoretic images of RPA amplified products with nucleic acid templates of Alexandrium pacificum extracted using different nucleic acid rapid extraction solutions 注: 1-5依次为核酸溶液原液、101、102、103、104倍稀释液; BC为空白对照 |
 |
| 图 4 四种核酸快提液提取太平洋亚历山大藻核酸溶液的PCR扩增产物电泳图 Fig. 4 Electrophoretic images of PCR amplified products with nucleic acid templates of Alexandrium pacificum extracted using different nucleic acid rapid extraction solutions 注: 1-5依次为核酸溶液原液、101、102、103、104倍稀释液; BC为空白对照 |
在RPA反应中, 快提试剂盒A与SDS-formamide快提液提取的核酸溶液原液无法进行RPA反应, 在稀释10倍后才能正常反应, 产生目标扩增条带(图 3b、d)。快提试剂盒B提取的核酸溶液原液和10倍稀释液均无法扩增, 100倍以及更高倍数稀释的核酸溶液才能正常扩增, 产生目标扩增条带(图 3c)。DMSO-Triton X100快提液提取的核酸溶液原液和各梯度稀释液均正常扩增, 产生目标扩增条带(图 3e)。
在PCR反应中, 快提试剂盒A与SDS-formamide快提液提取的核酸溶液原液无法进行PCR反应, 10倍和100倍稀释液反应正常, 产生目标扩增条带(图 4b、d)。快提试剂盒B提取的核酸溶液原液以及各梯度稀释液均无法反应, 未产生扩增条带(图 4c); DMSO-Triton X100快提液提取的核酸溶液原液、10和100倍均能正常反应, 产生目标扩增条带(图 4e)。对比阳性对照组的RPA和PCR反应效果(图 3a、4a), 可知快提试剂盒A、SDS-formamide快提液和DMSO-Triton X100快提液提取的核酸溶液在1 000倍稀释后无明显扩增条带产生是由于PCR反应的检测限高于RPA反应造成的。
综合2.1与2.2的实验结果分析, 发现DMSO-Triton X100快提液对RPA和PCR反应均无抑制效应, 其提取的太平洋亚历山大藻核酸溶液原液和稀释液对RPA和PCR反应无不利影响; 而其他3种核酸快提液对RPA和PCR反应均有不同程度的抑制效应, 其提取的太平洋亚历山大藻核酸溶液原液和稀释液也会不同程度影响RPA和PCR反应。因此, 本研究选择DMSO-Triton X100快提液作为最佳核酸快提液进行后续实验。
2.3 DMSO-Triton X100核酸快提液在不同裂解温度和时长下的核酸提取效果实验结果表明, 在加入DMSO-Triton X100快提液后, 裂解温度分别设置为37 ℃、65 ℃和95 ℃的RPA和PCR反应实验组中, 不同裂解时长的太平洋亚历山大藻样品产生的目标扩增条带明亮度相似, 说明随着裂解时间从10 min增加至60 min提取的核酸量无明显增加(图 5、图 6)。从另一角度看, 在裂解时长为分别10 min、30 min和60 min的RPA和PCR反应实验组中, 不同裂解温度的太平洋亚历山大藻样品产生的目标扩增条带明亮度也相似, 说明随着裂解温度从37 ℃增加至95 ℃提取的核酸量也无明显增加(图 5、图 6)。与CTAB法(该方法裂解温度始终保持为65 ℃)提取的核酸溶液对照组(图 5、图 6对照组)相比, DMSO-Triton X100快提液提取太平洋亚历山大藻核酸, 在37 ℃裂解10 min时已表现出良好的提取效果, 作为后续实验的提取条件。
 |
| 图 5 DMSO-Triton X100快提液在不同温度和时长条件下提取太平洋亚历山大藻核酸溶液的RPA扩增产物电泳图 Fig. 5 Electrophoretic images of RPA products of nucleic acid solutions of Alexandrium pacificum extracted using the DMSO-Triton X100 rapid extraction solution at different temperatures and for different durations 注: 对照组为CTAB法提取的核酸溶液, 1-5依次为核酸溶液原液、101、102、103、104倍稀释液; BC为空白对照 |
 |
| 图 6 DMSO-Triton X100快提液在不同温度和时长条件下提取太平洋亚历山大藻核酸溶液的PCR扩增产物电泳图 Fig. 6 Electrophoretic images of PCR amplification products of nucleic acid solutions of Alexandrium pacificum extracted using the DMSO-Triton X100 rapid extraction solution at different temperatures and for different durations 注: 对照组为CTAB法提取的核酸溶液, 1-5依次为核酸溶液原液、101、102、103、104倍稀释液; BC为空白对照 |
结果显示, 由DMSO-Triton X100快提液提取得到的东海原甲藻、米氏凯伦藻、赤潮异弯藻、球形棕囊藻、抑食金球藻与圆海链藻6种藻华微藻核酸溶液作为DNA模板的PCR反应均正常进行, 产生明亮的目标扩增条带(图 7b); 与使用CTAB法提取的核酸溶液PCR结果(图 7a)相比, 无明显差异。该结果说明DMSO-Triton X100核酸快提液能够裂解不同类型的藻华微藻细胞, 有效地提取核酸物质, 满足常规分子实验。
 |
| 图 7 DMSO-Triton X100快提液提取6种藻华微藻核酸溶液的PCR扩增产物电泳图 Fig. 7 Electrophoretic images of PCR amplification products of nucleic acid solutions of six HAB-forming microalgae extracted using the DMSO-Triton X100 rapid extraction solution 注: Pd为东海原甲藻, Km为米氏凯伦藻, Ha为赤潮异弯藻, Pg为球形棕囊藻, Aa为抑食金球藻, Tr为圆海链藻, BC为空白对照 |
实验结果显示, 在RPA和PCR反应中, 自然海水背景对照组核酸原液或10倍稀释液产生了微弱的目标扩增条带, 说明本研究采集青岛汇泉湾海水中存在极低密度的太平洋亚历山大藻细胞或DNA等核酸片段(图 8a、9a)。
 |
| 图 8 DMSO-Triton X100快提液提取模拟野外微藻样品与实验室对照微藻样品核酸溶液的RPA扩增产物电泳图 Fig. 8 Electrophoretic images of RPA products of nucleic acid solutions of simulated field microalga samples and laboratory control microalga samples extracted using the DMSO-Triton X100 rapid extraction solution 注: 1-5依次为核酸溶液原液、101、102、103、104倍稀释液, BC为空白对照 |
 |
| 图 9 DMSO-Triton X100快提液提取模拟野外微藻样品与实验室对照微藻样品核酸溶液的PCR扩增产物电泳图 Fig. 9 Electrophoretic images of PCR amplification products of nucleic acid solutions of simulated field microalga samples and laboratory control microalga samples extracted using the DMSO-Triton X100 rapid extraction solution 注: 1-5依次为核酸溶液原液、101、102、103、104倍稀释液, BC为空白对照 |
在RPA反应中, 以分别添加5、50、500、5 000个太平洋亚历山大藻细胞的模拟野外微藻样品和实验室对照微藻样品提取的核酸原液作为DNA模板的实验组均产生目标扩增条带; 且随着藻细胞数量的增加, 目标扩增条带明亮度逐渐增加, 表明扩增产物量依次增加; 同样, 随着核酸溶液稀释倍数增加, 目标扩增条带亮度逐渐减弱, 表明扩增产物量依次减少(图 8b、c)。在PCR反应中, 模拟野外微藻样品的扩增结果与实验室对照微藻样品对照组的扩增结果表现与RPA反应一致的规律(图 9b、c)。
结果表明, DMSO-Triton X100快提液提取效果稳定, 可有效提取不同藻细胞浓度样品的核酸, 不易受到海水杂质的干扰。
3 讨论 3.1 DMSO-Triton X100核酸快提法的特点快速分子检测技术在藻华监测与预警中发挥重要作用[15]。然而, 实现快速分子检测的首要挑战在于核酸的快速高效提取, 这也是分子生物学实验的基础步骤, 其提取方法和效率直接影响检测结果[16]。目前, 有关藻华微藻的核酸快提方法的报道较少。为此, 本研究对比分析了4种核酸快提方法对多种不同类型的藻华微藻核酸提取的效果, 筛选出最合适的DMSO-Triton X100快提法。其主要特点如下:
对分子反应无抑制效应。评价一种核酸提取方法是否可用, 需要关注的要点之一是提取核酸溶液对分子反应无不利影响或影响有限。在本研究中, 选取的4种核酸快提液在95 ℃中裂解太平洋亚历山大藻10 min, 经显微镜观察, 这4种快提液中的微藻细胞完全裂解, 藻细胞内核酸物质充分释放。4种快提液裂解工作条件一致, 理论上核酸粗提液中核酸质量应该相似。但实验发现, 除了DMSO-Triton X100提取液, 其他3种快提液提取核酸溶液原液为DNA模板的RPA和PCR均无扩增反应, 而10倍或100倍稀释后的核酸溶液为DNA模板对RPA和PCR反应正常, 基本无不利影响; 同时, 对比分析核酸快提液原液和稀释液作为添加剂对RPA和PCR反应影响, 也发现除了DMSO-Triton X100提取液, 其他3种快提液原液会抑制RPA和PCR反应, 而10倍或100倍稀释后作为添加剂对RPA和PCR反应无不利影响。结合2个实验结果, 可推断除了DMSO-Triton X100提取液, 其他3种快提液对扩增反应产生的不利影响主要源自快提液试剂自身。因商业保护, 商品化试剂盒的主要成分无法知晓, 而本研究自制SDS-formamide快提液对扩增反应产生的不利影响主要源自其主要成分SDS。SDS是一种常见的阴离子洗涤剂, 能够破坏细胞的膜结构, 使蛋白质变性, 释放核酸。然而SDS若未经洗脱除去, 被带入到PCR反应中, 则会降低聚合酶的活性, 抑制扩增反应[17]。类似的常见PCR抑制剂还包括乙醇、EDTA、苯酚和异丙醇等[18]。DMSO-Triton X100快提液自身成分以及提取的核酸溶液均未对RPA和PCR反应产生抑制效应。Triton X100是1种非离子性洗涤剂, 在水中不解离, 稳定性高, 不易受强电解质无机盐类的影响。其在快速裂解细胞的同时降低DNA的二级结构, 促进扩增反应[19]。同样, DMSO也可以降低DNA双链的结合力量, 减少非特异的产生, 有利于扩增反应[20]。本研究初步发现, 与一些传统的核酸提取化学试剂相比, DMSO和Triton X100是较理想的组合。但是, 其裂解得到的核酸粗提液是否可以适用于不同分子实验, 还需进行更多针对性测试。目前基于化学裂解的核酸提取方法的研发趋势也是侧重于调整试剂成分的组成和比例, 以期最大限度地减少抑制效应[21]。此外, DMSO的毒性作用不容忽视, 特别是对细胞毒性较大, 在使用过程中应尽量避免其挥发。
操作简单, 裂解条件温和。适宜的裂解温度和时长往往是影响核酸提取效果的关键因素。如赵升等[22]研发了一种核酸快提试剂, 通过加热和震荡2个步骤, 在4 min内即可实现对流感病毒RNA的提取。但该方法需要95 ℃高温持续裂解才可以完成, 有一定的局限性。Edwards等[23]研发了一种基于SDS的方法, 在15 min内分离出PCR扩增的基因组DNA, 而不使用氯仿或苯酚等危险化学品, 但该提取方案需要使用高速离心机来完成。本研究中的DMSO-Triton X100快提法对裂解条件的要求较低, 在实验设置的不同裂解温度和时间下均有良好的提取效果, 提供了一定的灵活性, 研究者可以根据实际情况合理设置实验条件来满足不同的研究需求。此外, DMSO-Triton X100快提法核酸提取全过程仅在一个离心管内完成, 操作简单, 可满足不同应用场景的需求。
核酸提取效率高。常见的商品化核酸提取试剂盒主要原理是利用离心柱在离心力的作用下将裂解溶液通过改性的二氧化硅树脂, 使核酸留在树脂上, 除去废液之后即可完成核酸的提取步骤。这种方法可以确保核酸的纯度, 但受限于树脂膜的载容量, 只能吸附一定量的核酸, 当样本核酸量超过树脂膜的载容量时则会吸附饱和, 造成部分核酸的损失, 不利于后续的定量分析[24]。Wang等[25]研发了一种基于氢氧化钠的核酸提取方法, 将一小块样品用氢氧化钠溶液裂解, 然后将裂解液的5 μL快速转移到含有495 μL Tris缓冲液(pH = 8)的新离心管中进行中和即可作为扩增模板。虽然该方法可以从植物样品中快速制备样品, 但中和步骤会显著稀释样品, 从而降低DNA浓度, 降低检测灵敏度。但是, DMSO-Triton X100快提法核酸提取全过程无需离心, 不需要更换离心管, 裂解的核酸溶液无需经稀释, 可直接作为多种分子反应的核酸模板, 最大程度上减少了核酸的损失。
具有一定的抗环境杂质干扰能力。在自然海水环境中, 杂质干扰对核酸快速提取方法构成了挑战, 不同环境下的生物成分与非生物成分可能会对核酸提取过程造成影响。Zou等[26]研发了一种纸条核酸提取法, 通过使用Whatman NO.1等高纤维素含量的试纸, 能够迅速、简便地从植物、动物和微生物样本中提取和纯化核酸。然而这种检测方式存在诸多问题, 如纸条在吸附核酸过程中容易受到环境杂质的干扰, 提取的核酸产量和纯度不能得到保证, 且提取过程需要洗脱干燥等, 并不适用于现场检测。DMSO-Triton X100快提法经过实验验证, 在模拟自然海水样品中显示出稳定的提取效果, 具有一定的抗环境杂质干扰能力, 可以获得满足分子实验需求的核酸模板。
总之, 本研究研发的DMSO-Triton X100快提法具有对分子反应无抑制效应、操作简单、裂解条件温和、核酸提取效率高等诸多优点, 同时具备了快提液成分简单、易于配置和使用成本低等在实际应用中也需要考虑的特点。因此, 该方法具备了替代实验室常用的传统提取法和商品化试剂盒的潜力。
3.2 DMSO-Triton X100核酸快提法的应用前景在实际研究中, 研究人员需要从不同来源的样品中提取核酸, 如细胞培养物、组织样本、体液样品等。若一种核酸提取方法具有很强的普适性, 可有效地提取不同目标生物的核酸, 将会提高实验效率[27]。本研究已初步证实了DMSO-Triton X100快提法可有效地提取甲藻、硅藻、针胞藻、定鞭藻和海金藻等多种不同门类海洋微藻核酸, 满足常规分子实验, 表明了该方法对海洋微藻的核酸提取具有不错的普适性。在后续应用中可以尝试将该快提方法应用于不同领域和场景, 例如医学诊断、环境监测、食品安全等, 有望为多个领域的研究和实践提供技术支持。
DMSO-Triton X100快提法快速、简便的核酸提取流程可助力分子生物学方法拓展应用范围和场景。不少便捷的分子生物学方法是基于现场或原位应用需要而被研发的, 但是其核酸模板提取往往需要常规实验室条件来完成, 限制了该方法在野外或原位的应用[28-29]。比如, 等温扩增技术因不需要热循环设备, 具有很强的现场应用潜力, 但核酸模板常依赖于实验室条件进行提取, 已成为其野外应用的绊脚石。核酸快提方法的研发解决了这一难题, DMSO-Triton X100核酸快提法无需复杂仪器支持, 可快速、简便地从样品中提取核酸, 使得等温扩增技术得以在野外或资源匮乏的环境中应用, 拓展等温扩增技术的应用范围和场景。同时, 核酸快提法也可助力一些实验室条件下常用的传统分子方法, 简化实验流程, 提高实验效率。
核酸提取效率和核酸损失对于科学研究具有重要意义, 尤其是在降低检测限和稀有物种鉴定研究方面。为此, 一些新型的核酸提取材料和方法被研发应用, 如: 羧基修饰的二氧化硅包覆的磁性纳米颗粒方法、二氧化硅包覆的磁性颗粒与氧化石墨烯组成的新型磁性材料等[30-31]。但这些材料和方法或价格贵、或操作不简便、或提取过程不稳定、或对PCR扩增有抑制效应[30-32], 目前应用场景有限。而DMSO-Triton X100快提法是基于化学溶液的直接裂解, 展现出较高的核酸提取效率, 有助于提高下游检测方法的灵敏度, 也为稀有物种鉴定提供了技术支持。
综上所述, 本研究研发的DMSO-Triton X100快速提取法操作便捷、核酸提取效率高、适用性强, 可快速提取藻华微藻核酸。在中国近海有害藻华频繁、藻华藻种多样化的背景下, 该方法将促进分子现场和原位检测方法的研发和应用, 有利于提升藻华动态的快速检测。此外, 该方法有望推广至其他研究领域的核酸提取, 助力于实验流程的简化, 提高实验效率。
| [1] |
Scientific Committee on Oceanic Research. Global harmful algal blooms: Science and implementation plan[R]. Delaware and Paris: SCOR, 2017.
|
| [2] |
俞志明, 陈楠生. 国内外赤潮的发展趋势与研究热点[J]. 海洋与湖沼, 2019, 50(3): 474-486. YU Zhiming, CHEN Nansheng. Emerging trends in red tide and major research progresses[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2019, 50(3): 474-486. |
| [3] |
陈国福, 张春云, 王广策, 等. 赤潮藻的分子生物学检测技术[J]. 高技术通讯, 2009, 19(3): 314-322. CHEN Guofu, ZHANG Chunyun, WANG Guangce, et al. Advances in molecular detection techniques for red tide algae[J]. Chinese High Technology Letters, 2009, 19(3): 314-322. DOI:10.3772/j.issn.1002-0470.2009.03.018 |
| [4] |
FU H, ZHANG C, WANG Y, et al. Advances in multiplex molecular detection technologies for harmful algae[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2022, 29(29): 43745-43757. DOI:10.1007/s11356-022-20269-z |
| [5] |
DAHM R. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research[J]. Human Genetics, 2008, 122(6): 565-581. DOI:10.1007/s00439-007-0433-0 |
| [6] |
张丽. 动物组织病料中病原核酸提取技术研究与应用[D]. 呼和浩特: 内蒙古农业大学, 2013. ZHANG Li. Research and application of nucleic acid extraction technology from the Pathogen of infected animal tissues[D]. Hohhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2013. |
| [7] |
钱程. 荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2022. QIAN Cheng. Study of fluorescence-based visual nucleic acid detection and its application in rapid diagnosis of animal and plant pathogens[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2022. |
| [8] |
毛瑞. 核酸现场检测关键技术研究及初步应用[D]. 北京: 中国科学院过程工程研究所, 2018. MAO Rui. Research and application of key technologies for on-site nucleic acid detection[D]. Beijing: Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, 2018. |
| [9] |
TOLDRÀ A, O'SULLIVAN C K, CAMPÀS M. Detecting harmful algal blooms with isothermal molecular strategies[J]. Trends in Biotechnology, 2019, 37(12): 1278-1281. DOI:10.1016/j.tibtech.2019.07.003 |
| [10] |
OROZCO J, MEDLIN L K. Review: advances in electrochemical genosensors-based methods for monitoring blooms of toxic algae[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2013, 20(10): 6838-6850. DOI:10.1007/s11356-012-1258-5 |
| [11] |
GUILLARD R R L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates[M]//SMITH W L, CHANLEY M H. Culture of marine invertebrate animals. Boston, MA: Springer US, 1975: 29-60.
|
| [12] |
PIEPENBURG O, WILLIAMS C H, STEMPLE D L, et al. DNA detection using recombination proteins[J]. PLoS Biology, 2006, 4(7): e204. DOI:10.1371/journal.pbio.0040204 |
| [13] |
CHEN Z F, ZHANG Q C, KONG F Z, et al. Resolving phytoplankton taxa based on high-throughput sequencing during brown tides in the Bohai Sea, China[J]. Harmful Algae, 2019, 84: 127-138. DOI:10.1016/j.hal.2019.03.011 |
| [14] |
WINNEPENNINCKX B, BACKELJAU T, DE WACHTER R. Extraction of high molecular weight DNA from mollusks[J]. Trends in Genetics, 1993, 9(12): 407. DOI:10.1016/0168-9525(93)90102-N |
| [15] |
GONG P, ANTRIM A K, BICKMAN S R, et al. Sandwich hybridization assay for in situ real-time cyanobacterial detection and monitoring: a review[J]. Biosensors, 2022, 12(8): 640. DOI:10.3390/bios12080640 |
| [16] |
THATCHER S A. DNA/RNA preparation for molecular detection[J]. Clinical Chemistry, 2015, 61(1): 89-99. DOI:10.1373/clinchem.2014.221374 |
| [17] |
REES W A, YAGER T D, KORTE J, et al. Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting[J]. Biochemistry, 1993, 32(1): 137-144. DOI:10.1021/bi00052a019 |
| [18] |
SCHRADER C, SCHIELKE A, ELLERBROEK L, et al. PCR inhibitors-occurrence, properties and removal[J]. Journal of Applied Microbiology, 2012, 113(5): 1014-1026. DOI:10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x |
| [19] |
魏华, 孙立国, 朱晶, 等. 不同的DNA提取法对两种常见医院感染菌ERIC-PCR鉴定的影响研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2007, 17(9): 1044-1047. WEI Hua, SUN Liguo, ZHU Jing, et al. Comparison of five DNA extraction methods for identification of two species normally caused nosocomial infection by enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction[J]. Chinese Journal of Nosocomiology, 2007, 17(9): 1044-1047. DOI:10.3321/j.issn:1005-4529.2007.09.002 |
| [20] |
SYN C K C, TEO W L, SWARUP S. Three-detergent method for the extraction of RNA from several bacteria[J]. BioTechniques, 1999, 27(6): 1140-1145. DOI:10.2144/99276bm11 |
| [21] |
PAUL R, OSTERMANN E, WEI Q. Advances in point-of-care nucleic acid extraction technologies for rapid diagnosis of human and plant diseases[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2020, 169: 112592. DOI:10.1016/j.bios.2020.112592 |
| [22] |
赵升, 姬艳芳, 张璐, 等. 一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价[J]. 中国病毒病杂志, 2019, 9(2): 135-138. ZHAO Sheng, JI Yanfang, ZHANG Lu, et al. Application of a rapid nucleic acid extraction method for influenza virus detection[J]. Chinese Journal of Viral Diseases, 2019, 9(2): 135-138. |
| [23] |
EDWARDS K, JOHNSTONE C, THOMPSON C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19(6): 1349-1349. DOI:10.1093/nar/19.6.1349 |
| [24] |
TIAN H, HÜHMER A F R, LANDERS J P. Evaluation of silica resins for direct and efficient extraction of DNA from complex biological matrices in a miniaturized format[J]. Analytical Biochemistry, 2000, 283(2): 175-191. DOI:10.1006/abio.2000.4577 |
| [25] |
WANG H, QI M, CUTLER A J. A simple method of preparing plant samples for PCR[J]. Nucleic Acids Research, 1993, 21(17): 4153-4154. DOI:10.1093/nar/21.17.4153 |
| [26] |
ZOU Y, MASON M G, WANG Y, et al. Nucleic acid purification from plants, animals and microbes in under 30 seconds[J]. PLoS Biology, 2017, 15(11): e2003916. DOI:10.1371/journal.pbio.2003916 |
| [27] |
QIAN C, WANG R, WU C, et al. A fast and visual method for duplex shrimp pathogens detection with high specificity using rapid PCR and molecular beacon[J]. Analytica Chimica Acta, 2018, 1040: 105-111. DOI:10.1016/j.aca.2018.07.064 |
| [28] |
ZHAO Y, CHEN F, LI Q, et al. Isothermal amplification of nucleic acids[J]. Chemical Reviews, 2015, 115(22): 12491-12545. DOI:10.1021/acs.chemrev.5b00428 |
| [29] |
YAN L, ZHOU J, ZHENG Y, et al. Isothermal amplified detection of DNA and RNA[J]. Molecular BioSystems, 2014, 10(5): 970. DOI:10.1039/c3mb70304e |
| [30] |
WU Y, CHEN H, CHEN Z, et al. Robotic sample preparation system based on magnetic separation[J]. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 2016, 16(12): 12257-12262. DOI:10.1166/jnn.2016.12826 |
| [31] |
PHAM X, BAEK A, KIM T H, et al. Graphene oxide conjugated magnetic beads for RNA extraction[J]. Chemistry: An Asian Journal, 2017, 12(15): 1883-1888. DOI:10.1002/asia.201700554 |
| [32] |
李蒙航, 赵振军, 李佩佩. 核酸固相分离方法及其在病原PCR诊断中的应用综述[J]. 化学工业与工程, 2021, 38(1): 86-95. LI Menghang, ZHAO Zhenjun, LI Peipei. A review: solid phase separation of nucleic acids and its application in PCR diagnosis of pathogens[J]. Chemical Industry and Engineering, 2021, 38(1): 86-95. |