抗生素(antibiotic)是微生物的次级代谢产物, 根据其结构特点分为β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、四环素类等^[1]。喹诺酮类抗生素(基本结构如图 1a)属合成类抗菌药, 发展至今已有4代。目前临床常用的为第3代和第4代, 即3位取代基为羧基、4位酮羰基、6位氟原子的氟喹诺酮类抗生素(基本结构如图 1b), 代表药物主要为左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、加替沙星、莫西沙星等。喹诺酮母核结构中几乎所有位置都可以用各种取代基进行修饰, 1、5、7、8位上可发生一些化学变化^[2], 从而产生具有不同理化性质、药代动力学和药理学的化合物。其中, 3位游离羧基可为阴阳离子交换、酰化反应、酯化反应等反应提供活性位点。

喹诺酮类抗生素(quinolones)抗菌谱广、抗菌效果强, 主要用于治疗尿路感染、眼科感染、胃肠道感染、皮肤和软组织感染等^[3]。随着喹诺酮药物活性范围的扩大及药代动力学的改善, 该类药物逐渐成为处方最多的抗生素之一。然而, 喹诺酮抗生素的不当使用甚至滥用会造成一定毒性。研究表明, 喹诺酮药物能渗透胎盘, 引起幼年动物关节病变^[4]; 喹诺酮类抗生素对兔腱细胞系表现出较强的毒性^[5]; 部分喹诺酮具有心脏毒性、肾毒性、神经系统毒性等^[3]。由于喹诺酮类抗生素对环境健康与安全影响, 开发新型喹诺酮类衍生物对于喹诺酮类抗生素的后续研究开发及临床应用具有重要的理论意义与应用价值。

壳聚糖(chitosan, CS)是甲壳素的脱乙酰化产物, 是自然界唯一的天然碱性多糖^[6-8], 是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1, 4糖苷键连接而成的聚合物。壳聚糖特殊的化学结构赋予了其独特的生物活性, 如生物相容性^[9]、成膜性^[10]、吸附性^[11]、无毒性、抑菌活性^[12]、抗氧化活性^[13]、吸湿保湿活性等^[14]。凭借其优良性质, 壳聚糖在生物医学、药物递送等方面被广泛应用^[15], 在医药、农业、环境修复和纺织等领域占有重要地位。然而, 壳聚糖在水及有机溶剂中溶解性较差, 极大地限制其应用和发展。为了解决这一问题, 通常采用物理、化学和生物手段对壳聚糖进行改性。化学改性是一种常用方式, 采用化学改性手段对壳聚糖进行衍生化修饰得到相应衍生物, 可以提高壳聚糖的活性及溶解性^[16-18]。基于此, 本文采用化学手段对壳聚糖结构中的氨基进行修饰, 将喹诺酮结构接枝无毒的壳聚糖, 以期得到低毒、高抑菌活性的衍生物。具体合成路线如图 2所示。

1 实验部分 1.1 药品与试剂

壳聚糖(课题组降解得到, 相对分子质量为8 000 Da, 脱乙酰度为90%), 左氧氟沙星水合物(LEV, 纯度98%)、环丙沙星(CIP, 纯度90%)及诺氟沙星(NOR, 纯度99%)购自上海源叶生物科技有限公司, N, N’-羰基二咪唑(CDI, 分析纯)购自上海麦克林生化科技有限公司, 氢氧化钠(分析纯)、盐酸(分析纯)、二甲亚砜(DMSO, 分析纯)、无水乙醇(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司, 大肠杆菌(CICC 23657)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)购自北京启迪利泰科技有限公司。

1.2 主要仪器与设备

DF-101S型恒温水浴锅, 郑州长城科工贸有限公司; MF-D105型集热式磁力恒温搅拌器, 郑州长城科工贸有限公司; Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪, 美国赛默飞世尔科技公司; Burker核磁共振波谱仪, 瑞士布鲁克拜厄斯宾有限公司; 冷冻干燥机, 北京博医康实验仪器有限公司; 酶标分析仪, 北京普朗新技术有限公司。

1.3 壳聚糖喹诺酮衍生物的合成 1.3.1 喹诺酮酰化壳聚糖衍生物的制备

分别取12.5 mmol左氧氟沙星、环丙沙星及诺氟沙星固体, 加入12.5 mmol CDI及100 mL DMSO, 水浴60 ℃使固体溶解, 活化12 h。活化结束后, 分别向烧瓶中加入6.25 mmol壳聚糖继续反应12 h。反应结束, 利用过量无水乙醇对溶液进行沉淀并洗涤、抽滤, 最后经索式提取48 h, 在−50 ℃下冷冻干燥24 h后即可得产物左氧氟沙星酰化壳聚糖衍生物(CS-LEV)、环丙沙星酰化壳聚糖衍生物(CS-CIP)及诺氟沙星酰化壳聚糖衍生物(CS-NOR)。

1.3.2 喹诺酮壳聚糖盐衍生物的制备

取6.25 mmol壳聚糖溶于10 mL去离子水, 并向其中加入6 mL 1 mol∙L^–1 HCl, 制备壳聚糖盐酸盐溶液, 备用。另分别取19.5 mmol左氧氟沙星、环丙沙星及诺氟沙星固体于30 mL去离子水, 并向其中加入19.5 mmol NaOH使其溶解, 待完全溶解后缓慢滴加至壳聚糖盐酸盐溶液中, 室温下避光搅拌12 h。反应结束后, 将反应液转移至100 g∙mol^–1(截留分子量)透析袋中透析48 h, 在−50 ℃下冷冻干燥48 h后即可得产物左氧氟沙星壳聚糖盐(CSLEV)、环丙沙星壳聚糖盐(CSCIP)及诺氟沙星壳聚糖盐(CSNOR)。

1.4 红外光谱检测

室温下, 采用Nicolet iS50傅立叶变换红外光谱仪进行分析: 将待测化合物与KBr按照1∶100质量比混合压片, 在波数4 000~400 cm^–1范围内进行扫描。

1.5 核磁共振氢谱检测

室温下, 采用Bruker AVIII-500波谱仪进行¹H NMR实验: 将15 mg样品溶于0.6 mL D₂O或DMSO-d6, 经过0.22 μm过滤器过滤后, 转移至核磁管中进一步分析。

1.6 核磁共振氟谱检测

室温下, 采用Bruker AVIII-500波谱仪进行¹⁹F NMR实验: 将10 mg产物及2 mg邻氟苯甲酸(内标物)溶于0.6 mL DMSO-d6, 转移至核磁管中进一步分析。

1.7 取代度计算

通过核磁共振氟谱中样品信号和内标物信号峰面积比值, 按下式计算取代度(degree of substitution, D_S):

$ {D}_{S}（\%）=\frac{\left({A}_{s}∕{n}_{s}\right)\times {m}_{r}}{\left({A}_{r}∕{n}_{r}\right)\times {m}_{s}} ×100, $

(1)

其中, A_s为样品的信号峰面积, n_s为样品的氟原子数, m_r为内标物的质量, A_r为内标物的信号峰面积, n_r为内标物的氟原子数, m_s为样品的质量。

1.8 抑菌活性测定

本文以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为供试菌种, 测定壳聚糖喹诺酮类衍生物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。抑菌实验测定参照GB/T 40672—2021方法^[19]并进行适当调整, 具体操作如下:

(1) 将供试菌种接种于液体培养基中, 并在37 ℃、110 r/min摇床中培养18 h, 菌液备用。

(2) 样品灭菌后利用无菌水配成16 mg∙mL^－1的样本储备液。取96孔板, 向第1列中分别加入200 μL样本储备液, 并向其余孔中加入100 μL无菌水, 采用梯度稀释法对样品溶液进行稀释。最后向每孔中加入100 μL对数生长期的菌液, 控制样品的最终浓度为8×10³, 4×10³, 2×10³, 1×10³, 5×10², 2.5×10², 1.25×10², 62.5, 31.25, 15.625, 7.813, 3.906, 1.953, 0.976 6, 0.488 3, 0.244 1, 0.122 1, 0.061 04, 0.030 52, 0.015 26 μg∙mL^–1。

(3) 将96孔板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。与空白对照组相比, 若样品组明显无菌落呈清亮状态, 该孔所对应的浓度即为该样品的MIC。待MIC观察结束, 吸取96孔板中细菌未生长的混合溶液100 μL于固体培养基上并涂布均匀, 继续培养24 h, 若培养基上无明显菌落生长, 该孔中溶液所对应的浓度即为该样品的MBC, 每个样品重复实验3次。

1.9 细胞毒性测定

本实验选取小鼠成纤维细胞系(L929)作为供试细胞株, 利用MTT法测定L929细胞毒性, 细胞毒性测定参照Agyin等人^[20]、Fan等人^[21]方法并进行适当调整。

将L929细胞复苏并传代培养后, 取100 μL细胞液于96孔板中。待孔中细胞密度达10⁵个/孔, 取100 μL不同浓度样品(1 000 μg∙mL^–1、500 μg∙mL^–1、250 μg∙mL^–1、125 μg∙mL^–1、62.5 μg∙mL^–1)加入96孔板中, 置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养24 h。24 h后弃去培养基, 向每孔中加入100 μL MTT溶液(浓度为0.5 mg∙mL^–1), 继续培养4 h后弃去MTT溶液, 向每孔中加入150 μL DMSO, 震荡均匀后于波长490 nm处测量吸光度。实验中空白组仅含完全培养基和MTT试剂, 对照组中仅含MTT试剂和细胞, 细胞存活率(cell viability, Cv)的计算公式如下:

$ C \mathrm{v}(\%)=\left(\frac{A_{\mathrm{s}}-A_{\mathrm{b}}}{A_{\mathrm{c}}-A_{\mathrm{b}}}\right) \times 100 $

(2)

其中, A_s为待测样品组的吸光度, A_c为对照组的吸光度, A_b为空白组的吸光度。

2 结果与分析 2.1 红外光谱分析 2.1.1 喹诺酮酰化壳聚糖衍生物红外光谱分析

图 3是壳聚糖及喹诺酮酰化壳聚糖衍生物的红外谱图。壳聚糖的光谱中, 在890 cm^–1附近出现了糖环内及糖环外C-O-C的弯曲振动峰, 在1 070 cm^–1附近出现了C-O-C的伸缩振动峰, 1 030 cm^－1附近出现的吸收峰与壳聚糖C3位的-OH伸缩振动有关, 1 580 cm^–1处吸收峰与-NH₂的弯曲振动有关。当壳聚糖与喹诺酮类抗生素发生酰化反应后, 壳聚糖结构中1 580cm^–1处的-NH₂吸收峰消失, 出现了1 660 cm^–1处新合成的酰胺键吸收峰^[22]。此外, 在1 620 cm^–1附近还出现了喹诺酮类抗生素结构中羰基的伸缩振动峰, 1 260 cm^–1附近的吸收峰与喹诺酮结构中C-F的伸缩振动有关^[23-24]。所有的喹诺酮壳聚糖盐衍生物在700~900 cm^–1指纹区均出现了新的特征吸收峰, 与喹诺酮结构中苯环的C-H弯曲振动有关, 由此可以初步证明喹诺酮酰化壳聚糖衍生物的成功制备。

2.1.2 喹诺酮壳聚糖盐衍生物红外光谱分析

图 4是壳聚糖及喹诺酮壳聚糖盐衍生物的红外谱图。与壳聚糖相比, 壳聚糖与喹诺酮阴阳离子结合后, 衍生物在1 620 cm^–1出现的特征吸收峰与喹诺酮类抗生素结构中羰基的伸缩振动有关, 1 260 cm^–1附近的吸收峰与喹诺酮类抗生素结构中C-F的伸缩振动有关^[23-24]。所有的喹诺酮壳聚糖盐衍生物在700~900 cm^–1指纹区均出现了新的特征吸收峰, 可以归属为苯环的C-H弯曲振动特征吸收峰, 由此可以初步证明喹诺酮壳聚糖盐衍生物的成功制备。

2.2 核磁共振氢谱分析 2.2.1 喹诺酮酰化壳聚糖衍生物核磁共振氢谱分析

为进一步验证喹诺酮酰化壳聚糖衍生物的成功合成, 测定了壳聚糖及衍生物的核磁共振氢谱, 结果如图 5所示。其中, δ = 4.79处代表溶剂D₂O的特征峰, δ = 2.5处代表溶剂DMSO-d6的特征峰, 壳聚糖各质子峰可归属如下: Ha: δ = 4.61, Hb: δ = 3.08, Hc-Hf: δ = 3.21~4.08。壳聚糖与喹诺酮类抗生素发生酰化反应后, 各衍生物在低场区δ = 9.0附近出现喹诺酮结构中吡啶环2位氢质子峰, 喹诺酮类抗生素结构中苯环1位氢质子峰的化学位移在δ = 7.5~8.0范围内, 哌嗪环上各氢质子峰出现在化学位移δ = 2.0~3.0范围内。衍生物CS-LEV在δ = 1.0~2.0范围出现左氧氟沙星结构中的甲基氢质子峰, 吗啉环上3位、5位氢质子峰出现在δ = 4.5附近; 衍生物CS-CIP在δ = 1.0~1.5范围内出现环丙基的各氢质子峰; 衍生物CS-NOR在δ = 1.4附近出现甲基的氢质子峰, 各衍生物的氢质子峰具体归属如图所示, 由此可以证明喹诺酮酰化壳聚糖衍生物的成功合成^[25-27]。

2.2.2 喹诺酮壳聚糖盐衍生物核磁共振氢谱分析

为进一步验证喹诺酮壳聚糖盐衍生物的成功合成, 测定了壳聚糖及衍生物的核磁共振氢谱, 结果如图 6所示。其中, δ = 4.79处代表溶剂D₂O的特征峰, 壳聚糖各质子峰可归属如下: Ha: δ = 4.61, Hb: δ = 3.08, Hc-Hf: δ = 3.21~4.08。壳聚糖与喹诺酮类抗生素阴阳离子结合后, 在低场区δ = 8.0~8.5范围内出现喹诺酮类抗生素结构中吡啶环2位氢质子峰, 喹诺酮类抗生素结构中苯环1位氢质子峰的化学位移在δ = 7.0~8.0范围内, 哌嗪环上各氢质子峰出现在化学位移δ = 2.0~3.5范围内。衍生物CSLEV在δ = 1.0~2.5范围出现左氧氟沙星结构中的甲基氢质子峰, 吗啉环上3位、5位氢质子峰出现在δ = 4.5附近; 衍生物CSCIP在δ = 0.9~1.5范围内出现环丙基5位和6位氢质子峰, 4位氢质子峰出现在δ = 4.3; 衍生物CSNOR在δ = 1.0附近出现甲基的氢质子峰。各衍生物的氢质子峰具体归属如图所示, 由此可以证明喹诺酮壳聚糖盐衍生物的成功合成^[25-27]。

2.3 核磁共振氟谱分析 2.3.1 喹诺酮酰化壳聚糖衍生物核磁共振氟谱分析

喹诺酮酰化壳聚糖衍生物的核磁共振氟谱如图 7所示。其中, 内标物邻氟苯甲酸结构中氟原子的特征吸收峰出现在δ = –111附近; CS-LEV的氟原子特征峰出现在δ = –122.48; CS-CIP的氟原子特征峰出现在δ = –121.86; CS-NOR的氟原子特征峰出现在δ = –121.68 ^[28-29]。

2.3.2 喹诺酮壳聚糖盐衍生物核磁共振氟谱分析

喹诺酮壳聚糖盐衍生物核磁共振氟谱如图 8所示。其中, 内标物邻氟苯甲酸结构中氟原子的特征吸收峰出现在δ= –116附近; CSLEV的氟原子特征峰出现在δ = –121.55; CSCIP的氟原子特征峰出现在δ = –124.60; CSNOR的氟原子特征峰出现在δ = –124.31^[28-29]。

2.4 取代度(D_S)分析

本实验制得的壳聚糖喹诺酮类衍生物取代度如表 1所示。结果表明, 同类化合物的取代度相近。酰化产物CS-LEV、CS-CIP、CS-NOR取代度低, 分别为4.91%、2.50%、2.31%; 离子交换产物CSLEV、CSCIP、CSNOR取代度较高, 分别为36.29%、36.66%、29.39%。

2.5 抑菌活性分析

壳聚糖、喹诺酮及壳聚糖喹诺酮类衍生物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性如表 2所示。实验结果表明, 壳聚糖对两类细菌的最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC)均大于8 000 μg∙mL^–1。与壳聚糖原料相比, 壳聚糖喹诺酮类衍生物的抑菌活性明显提高。两个系列产物相比, 喹诺酮壳聚糖盐衍生物(CSLEV、CSCIP、CSNOR)的抑菌活性较高。其中, 环丙沙星壳聚糖盐衍生物与环丙沙星抑菌效果相似, 对大肠杆菌的MIC为0.122 1 μg∙mL^–1, MBC为0.122 1 μg∙mL^–1, 对金黄色葡萄球菌的MIC为0.488 3 μg∙mL^–1, MBC为1.953 μg∙mL^–1。

2.6 细胞毒性分析

壳聚糖、喹诺酮及壳聚糖喹诺酮类衍生物的细胞毒性如图 9所示。实验结果表明, 壳聚糖对细胞表现出无毒或低毒。与喹诺酮原料相比, 壳聚糖喹诺酮类衍生物处理的细胞存活率明显提升, 细胞毒性明显下降。两个系列产物中, 喹诺酮酰化壳聚糖类衍生物(CS-LEV, CS-CIP, CS-NOR)的细胞毒性较低, 在所有测试浓度下处理的细胞存活率均大于80%, 表现为低细胞毒性或无毒。而喹诺酮壳聚糖盐衍生物(CSLEV, CSCIP, CSNOR)除最大测试浓度以外, 其他测试浓度下处理的细胞存活率均大于80%, 表现为低细胞毒性或无毒, 相较于喹诺酮原料细胞毒性降低。

3 结果与讨论

喹诺酮结构中, 1位氮原子、3位羧基、4位酮羰基、6位氟原子的引入可提升药物抑菌活性。喹诺酮的3位羧基和4位酮羰基以原核生物DNA回旋酶为作用靶点, 通过抑制DNA回旋酶和拓扑异构酶抑制DNA的合成, 从而发挥抑菌和杀菌作用^[30]。这是喹诺酮具有抑菌活性的原因, 也是壳聚糖喹诺酮类衍生物具有抑菌活性的原因。然而, 研究表明多种喹诺酮药物与药物不良反应有关, 严重的甚至危及生命。包括左氧氟沙星在内的12种喹诺酮类药物会诱导斑马鱼心脏发育畸形^[31], 这可能与喹诺酮药物结构中的哌嗪环或7位甲基化有关; 另有研究表明左氧氟沙星和环丙沙星对兔腱细胞系具有严重的毒副作用, 这可能与细胞氧化应激后基因表达有关。壳聚糖是一种无毒的天然阳离子多糖, 具有良好的生物相容性, 在医药和农业领域具有广泛的应用前景。但壳聚糖的低溶解度和低生物活性, 限制了其在实际工业中的进一步应用。因此本文将喹诺酮类抗生素通过不同方式接枝壳聚糖, 从而使衍生物在细胞毒性降低的同时维持高抑菌活性。

本文选取左氧氟沙星、环丙沙星及诺氟沙星三类结构中含有羧基的喹诺酮类抗生素, 与壳聚糖通过阴阳离子交换、酰化反应进行接枝, 合成了2个系列、6个壳聚糖喹诺酮类衍生物。通过傅里叶变换红外光谱、核磁共振氢谱及氟谱表征化合物的结构; 通过肉汤稀释法检测化合物的抑菌活性、MTT法检测化合物的细胞毒性。实验表明, 合成的化合物抑菌活性显著高于壳聚糖, 喹诺酮壳聚糖盐衍生物的抑菌活性高于酰化反应产物。其中, 环丙沙星壳聚糖盐(CSCIP)的抑菌活性与环丙沙星相近。同时, 除部分样品在最大测试浓度下细胞存活率低于80%, 其他样品在各测试浓度下均表现为低毒或无毒。所有样品的细胞毒性相较于喹诺酮原料均明显降低。因此, 本文为延长喹诺酮类药物的临床使用时间提供了实验依据, 对喹诺酮药物后续的开发利用具有重要的理论意义和价值。

4 结论

本文基于阴阳离子结合和酰化反应原理, 将喹诺酮类抗生素经离子键和酰胺键接枝于壳聚糖分子链, 制备得到6种壳聚糖喹诺酮类衍生物。活性实验结果表明, 壳聚糖喹诺酮类衍生物抑菌活性相较于壳聚糖原料显著提高, 细胞毒性相较于喹诺酮类抗生素明显降低。其中, 喹诺酮壳聚糖盐衍生物的抑菌活性与喹诺酮类抗生素原料接近, 且细胞毒性相较于喹诺酮类抗生素明显下降, 在大部分测试浓度下表现出低细胞毒性或无毒性。