二氧化碳作为代表性温室气体, 能够引起全球变暖。为了减缓温室效应, 世界许多国家相继提出碳中和目标, 我国也提出力争于2030年前二氧化碳排放达到峰值, 2060年前实现碳中和的“双碳”目标。碳捕集与封存(Carbon Capture and Storage)是从源头捕集CO₂, 运输到地质封存地点, 并封存在特定地层(如地下、海底等), 使其长期与大气隔绝, 稳定大气CO₂浓度的主要技术之一。海洋碳封存是指将CO₂封存于海底咸水层、废弃油气藏或开发中的油气藏等地质储层中, 其泄漏风险较小, 泄漏地点远离人口密集区, 封存过程对饮用含水层损害轻微, 诱发地震的可能性低, 可以实现相对永久和安全的封存^[1]。另外, 可以将CO₂地质封存与海洋油气开采活动相结合, 将超临界状态的CO₂注入开发中的油气藏, 不但能提高采油效率, 还能降低CO₂封存成本^[2]。根据自然资源部中国地质调查局2023年发布的初步预测结果, 我国海域碳封存潜力巨大, 达2.58万亿吨^[3]。因此, 海洋碳封存是我国实现碳中和不可或缺的手段之一。

然而由于地层的复杂性、海底运动的可能性以及当前封存技术的限制性等原因, 海洋碳封存活动可能发生CO₂泄漏问题。例如将CO₂直接注至水柱, CO₂会与周围海水介质发生物化反应, 引起海洋酸化; 将CO₂封存于海底沉积物中, 则可能会因注入时孔隙压力增高或水合物形成时温度增高而导致其泄漏于海水中^[3-6], 导致海水CO₂浓度升高, 影响海洋环境安全和生物生态健康。曲健凤等^[7]通过分析CO₂泄漏与水体pH变化之间的关系, 成功建立了相关数值模型, 结果表明泄漏能导致海水pH短时间内大幅度下降, 泄漏速率为500 mL/min时, 海水pH会在短时间内下降至4.6。Diaz‐Pulido等^[8]发现当控制不同的CO₂分压, 使海水pH从对照组的8.1(二氧化碳计算浓度约为0.043 mmol/L)下降至处理组的7.6(二氧化碳计算浓度约为0.093 mmol/L)时, 珊瑚藻(Porolithon onkodes)的死亡率将从1%增加到9%。Baumann等^[9]发现当水体pH下降至7.7(二氧化碳计算浓度约为0.079 mmol/L)时, 美洲银汉鱼(Menidia beryllina)胚胎的存活率比对照组下降74%。黄显雅^[10]发现中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)浮游幼体存活率与海水酸化程度显著相关, 当通入不同浓度的超纯CO₂气体, 使水体pH下降至7.62(二氧化碳计算浓度约为0.089 mmol/L)时, 存活率比对照组下降69%。

虽然已有研究初步探讨了CO₂暴露对海洋生物的毒性效应, 但这些研究主要集中在CO₂对无脊椎动物生存等方面的影响。对于鱼类等脊椎动物的研究, 多数停留在宏观指标上, 如高浓度CO₂会导致鱼类呼吸性酸中毒, 进而引发死亡、昏迷、麻醉和窒息等毒性效应。然而, 关于鱼类的生理生化效应及其作用机制的研究仍不深入。

氧化还原反应是生命能量代谢的化学基础, 发挥着调节机体多种生物学功能的关键作用。然而, 自由基和活性氧(ROS)的过量产生或抗氧化能力不足会导致氧化应激。这些自由基和活性氧可以损伤细胞、蛋白质、脂质和DNA, 影响生物个体的生长发育^[11]。抗氧化系统是生物体对抗氧化应激的防御机制, 通过激活该系统, 机体可以清除活性氧, 减轻细胞损伤, 提高生存率。参与这一过程的关键酶包括超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等, 此外, 丙二醛(MDA)是细胞膜脂质受自由基攻击后的分解产物。这些酶和MDA常被用作氧化应激的生物标志物, 检测它们的水平可以反映体内氧化应激的程度^[12]。

本文以海洋生态毒理试验的模式鱼类——海水青鳉为受试生物, 开展CO₂暴露下的急慢性毒性试验, 研究该鱼类生存和抗氧化防御系统的响应, 以期为CO₂的毒性效应机制解析和生态风险评估提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 受试生物与材料

本研究受试生物海水青鳉(Oryzias melastigma)由中国海洋大学生态毒理实验室长期培养。该物种具有生存能力强、耐盐范围广、世代周期短、产卵率高、对环境变化敏感等优势, 是理想的海洋模式生物^[13-14]。受试生物在实验室内培养及实验过程中所用水体均为经滤膜(0.45 μm)过滤且经过紫外灭菌的海水。

为研究选取孵化后15 d左右的海水青鳉仔鱼(体长约7±0.5 mm)为受试生物样本, 参照《GB/T 27861— 2011化学品鱼类急性毒性实验》^[15]、《GB/T 21759— 2008化学品慢性毒性实验方法》^[16]、《GB/T 29764— 2013化学品青鳉鱼早期生命阶段毒性实验》^[17]等技术规范开展二氧化碳暴露的急慢性毒性试验。

本研究所用主要试剂材料包括: 总蛋白定量分析试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性分析试剂盒、过氧化氢酶(CAT)活性分析试剂盒、丙二醛(MDA)含量分析试剂盒均购自南京建成生物工程研究所; CO₂气体(纯度99.99%)购自青岛德海伟业公司。

1.2 主要仪器与设备

本研究涉及主要仪器设备包括: 酶标仪[型号: Labserv K3, 赛默飞世尔实验器材(上海)有限公司]、高速离心机(型号: TG16-WS, 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、智能光照培养箱(型号: GXZ-280B, 宁波江南仪器厂)、气体流量计(型号: KD800-4, 常州市科德热工仪表有限公司), 便携式pH计(6010M, 上海任氏电子有限公司)。

1.3 二氧化碳暴露浓度估算方法

CO₂气体从气瓶经减压阀和气体流量计调节注入生物暴露容器。由于CO₂暴露浓度难以实时监测, 本研究通过取水样测定pH与总碱度(TA), 根据以下公式估算CO₂暴露浓度^[18]:

$ \left[ {{\rm{C}}{{\rm{O}}_2}} \right] = \frac{{{\rm{TA}} \cdot {{\left[ {{{\rm{H}}^ + }} \right]}^2}}}{{K_1^* \cdot \left( {\left[ {{{\rm{H}}^ + }} \right] + 2K_2^*} \right)}} . $

(1)

式中, K₁^*和K₂^*分别为海水中H₂CO₃的一级和二级表观解离常数, [CO₂]为CO₂浓度, [H⁺]为氢离子浓度, TA为总碱度。

水体pH值采用便携式pH计进行测定, 水体TA利用酸碱滴定法^[19]进行测定。

1.4 急性毒性试验

目前海水平均pH 7.8(二氧化碳计算浓度约0.068 mmol/L), 为探究短时间内CO₂泄漏到何种程度会对生物产生致死效应, 而对CO₂浓度进行适当放大, 开展预试验, 依据预试验结果利用等对数间距法对CO₂正式试验进行浓度分组。共设定5个暴露组, 暴露浓度分别为26.2、21.4、19.9、18.5和15.9 mmol/L, 同时设置空白对照组, 每组设置3个平行。急性毒性试验采用静态试验法, 于3 L烧杯中加入消毒海水, 通过气体流量计调节CO₂暴露浓度, 持续通气维持水体CO₂浓度。将孵化后15 d左右的海水青鳉仔鱼随机投入各试验组中, 每组21尾, 暴露4 d, 每天记录受试生物死亡数量。试验期间不喂食, 不充氧。

1.5 慢性毒性试验

以急性毒性试验结果获得的半致死浓度(LC₅₀)为依据, 进行慢性毒性试验分组, 共设置5个暴露组, 暴露浓度分别为8.65、6.89、3.57、1.56和0.87 mmol/L, 同时设置空白对照组, 每组3个平行, 在亚致死条件下, 探究CO₂对生物抗氧化防御系统的影响。慢性毒性试验采用半静态试验法, 试验容器同急性毒性试验, 暴露时间为21 d, 每3 d更换一半试验水体, 持续通气维持水体CO₂浓度。分别于7 d、14 d和21 d随机选取受试生物样本进行后续酶活性等指标的分析测试。

1.6 样品分析与测试

选取的受试生物样本置于预冷的0.9%生理盐水中漂洗, 滤纸拭干, 准确称重后, 按重量体积比1∶9的比例加入0.9%生理盐水进行冰水浴组织匀浆, 3 000 r/min转速下低温离心10 min, 取上清液按试剂盒说明书进行超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量测定。SOD酶活性以WST-1法测定, 根据WST-1噻唑盐[2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2, 4-二磺酸苯基)-2氢-四唑盐]可以与超氧阴离子自由基反应产生水溶性染料的原理, 对SOD酶活性进行检测。CAT酶活性采用钼酸铵法测定, 利用过氧化氢可与钼酸铵反应形成稳定黄色复合物的原理, 通过测定反应体系中剩余过氧化氢的量, 间接测定CAT酶活性。MDA含量以TBA(硫代巴比妥酸)法测定, 根据MDA与硫代巴比妥酸反应成色的原理检测其含量。

1.7 数据统计与分析

采用IBM SPSS Statistics 22统计分析软件根据概率回归法拟合受试生物死亡率与CO₂暴露浓度之间的响应关系, 计算不同暴露时间下的半致死浓度。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各处理组与对照组之间SOD、CAT活性及丙二醛含量的组间差异显著性。

2 结果与分析 2.1 二氧化碳暴露对水体二氧化碳浓度的影响

根据第1.3节中的CO₂浓度计算公式, 本研究开展了不同流速下的CO₂曝气试验, 探求是否可以通过控制气体流速控制受试水体pH与TA, 进而控制水体CO₂浓度。

由图 1可知, 初始受试水体pH均为8.3左右, CO₂通气速率的不同, 各试验组达到稳定时耗费的时间也不同。如通气速率为6 mL/min时, 在5 h以内, 水体pH便基本稳定, 而在20 mL/min, 在7 h左右, 水体pH才会趋于稳定。除此之外, 各个试验组水体pH的最终稳定值也存在差异, 通气速率越大, 稳定后水体pH值越低。如通气速率为6 mL/min时, 水体pH稳定在5.2左右, 而在20 mL/min, 水体pH稳定在4.8左右。因此, 在本试验研究中, 水体pH确实可以通过调节CO₂曝气速率进行调控, 且均在曝气一段时间后基本达到稳定状态, 稳定后的水体pH值与CO₂曝气速率成反比。

另外, 本研究对受试水体进行了定期取样测定水体TA(mmol/L), 具体结果如表 1。发现总碱度变化幅度较小。通过独立样本Kruskal-Wallis检验发现总碱度随时间及流速变化不显著(P > 0.05), 这与黄显雅^[10]研究过程中的结果类似。

2.2 二氧化碳急性暴露对海水青鳉死亡率的影响

从图 2可以看出, 在96 h急性暴露试验期间, 对照组中海水青鳉受试生物全部存活, 但处理组中受试生物出现死亡, 且死亡率随CO₂暴露浓度增加和暴露时间延长而逐渐上升。最低浓度(15.9 mmol/L)暴露组中, 试验6 h后开始出现死亡, 之后死亡率逐步升高, 48 h后的平均死亡率为16.7%, 96 h后的平均死亡率为30.0%。最高浓度(26.2 mmol/L)暴露组中, 试验2 h后开始出现死亡, 之后死亡率迅速升高, 24 h的平均死亡率为75.0%, 72 h的死亡率达到100%。计算得到CO₂暴露下海水青鳉的48 h和96 h半致死浓度见表 2。

2.3 二氧化碳慢性暴露对海水青鳉SOD酶活性的影响

在21 d的CO₂慢性暴露试验中, 各处理组海水青鳉体内的SOD酶活性相较于对照组总体呈现被诱导状态(图 3)。暴露7 d后, 低浓度暴露组(≤1.56 mmol/L) SOD酶活性与对照组相比无显著差异, 中浓度暴露组(3.57 mmol/L)酶活性显著高于对照组, 但高浓度暴露组(≥6.89 mmol/L)酶活性与对照组相比无显著差异。暴露14 d后, 各暴露组酶活性均显著高于对照组, 其中3.57 mmol/L暴露组酶活性最高, 为对照组的150%。暴露21 d后, 各处理组酶活性有所下降, 其中2个处理组(3.57 mmol/L和6.89 mmol/L)的酶活性依然显著高于对照组, 其他处理组的酶活性与对照组相比无显著差异。

除此之外, 对不同时期的SOD酶活性分析发现, 二氧化碳对SOD酶活性的诱导作用先增强后减弱, 如在与对照组有显著差异的3.57 mmol/L暴露组, 在第7 d与对照组相比SOD酶活性上升了2.54 U/mg prot, 在第14 d上升了5.07 U/mg prot, 在第21 d上升了2.29 U/mg prot, 该变化与鱼类在不同生长阶段的耐受性和自身调节机制有关^[20]。

2.4 二氧化碳慢性暴露对海水青鳉CAT酶活性的影响

由图 4可知, 各处理组海水青鳉体内CAT酶活性相较于对照组总体呈现被抑制状态, 且抑制程度随暴露浓度增加而逐步加剧。暴露7 d后, 低浓度处理组(≤3.57 mmol/L)的CAT酶活性与对照组相比无显著差异, 但高浓度处理组(≥6.89 mmol/L)的酶活性显著低于对照组, 最高抑制率为48%。暴露14 d后, 低浓度处理组(≤3.57 mmol/L)的酶活性与对照组相比无显著差异, 但高浓度处理组(≥6.89 mmol/L)的酶活性依然显著低于对照组, 最高抑制率为73%。暴露21 d后, 高浓度处理组(≥6.89 mmol/L)的酶活性有所恢复, 但仍显著低于对照组, 最高抑制率为49%。通过各试验组CAT活性的差异显著性发现, 暴露21 d后, CO₂对海水青鳉体内CAT活性的最高无效应浓度(NOEC)为3.57 mmol/L, 最低效应浓度(LOEC)为6.89 mmol/L(图 4)。

除此之外, 对不同时期的CAT酶活性分析发现, 二氧化碳对CAT酶活性的抑制作用先增强后减弱, 如在与对照组有显著差异的6.89 mmol/L暴露组, 在第7 d与对照组相比CAT酶活性下降了1.97 U/mg prot, 在第14 d下降了2.49 U/mg prot, 在第21 d下降了1.63 U/mg prot; 在8.65 mmol/L暴露组, 在第7 d与对照组相比CAT酶活性下降了2.1 U/mg prot, 在第14 d下降了3.56 U/mg prot, 在第21 d下降了1.99 U/mg prot, 该变化与鱼类在不同生长阶段的耐受性和自身调节机制有关。

2.5 二氧化碳慢性暴露对海水青鳉MDA含量的影响

MDA是细胞膜脂质过氧化的产物, MDA含量可以反映机体细胞受到自由基攻击的过氧化损伤程度^[21]。在21 d的慢性暴露试验过程中, 各处理组中海水青鳉体内的MDA含量逐渐升高, 且升高幅度随CO₂暴露浓度的增加而依次增强(图 5)。暴露7 d后, 最低浓度处理组(0.87 mmol/L)的MDA含量与对照组相比无显著差异, 但其他处理组(≥1.56 mmol/L)的MDA含量显著高于对照组, 最高含量为对照组的246%。暴露14 d后, 除最低浓度处理组外, 其他处理组的MDA含量仍然显著高于对照组, 最高含量为对照组的256%。暴露21 d后, 各处理组MDA含量虽有所下降, 但仍显著高于对照组, 在8.65 mmol/L处理组中的MDA含量为对照组的312%。通过各试验组MDA含量的差异显著性发现, 暴露21 d后, CO₂对海水青鳉体内MDA含量的NOEC和LOEC分别为0.87 mmol/L和1.56 mmol/L(图 5)。

除此之外, 对不同时期的MDA含量分析发现, 机体内MDA含量先增加后减少, 如在与对照组有显著差异的8.65 mmol/L暴露组, 在第7 d与对照组相比MDA质量摩尔浓度增加了4.87 mmol/mg, 在第14 d增加了6.29 mmol/mg, 在第21 d增加了4.84 mmol/mg, 这也与上文中SOD、CAT活性变化结果类似, 同时也说明鱼类逐渐适应外界环境后, 二氧化碳对机体产生的毒害作用趋于减弱。

3 讨论

综合以上CO₂对海水青鳉的致死效应及抗氧化防御系统的研究结果, 封存区域CO₂短时间内的喷发式泄漏可能会引起海水青鳉个体死亡, 长时间内的缓慢渗漏会引起抗氧化系统损伤。在长期泄漏背景下, 机体在遭受CO₂胁迫时, 海水青鳉体内产生大量超氧阴离子自由基, 激活机体的抗氧化防御系统。SOD酶是抗氧化防御系统的第一环节酶, 能够催化机体内超氧阴离子自由基转化为过氧化氢^[22]。CAT是生物抗氧化防御系统中的第二环节酶, 能够将SOD催化产生的过氧化氢进一步转化为水和氧气^[23]。

本研究表明, 海水青鳉体内的CAT酶活性对于CO₂暴露比较敏感, 暴露14 d后, 最高浓度暴露组(8.65 mmol/L)中的酶活性仅为对照组的27%, 此时CAT酶活性受到显著抑制, 难以实现对SOD催化产物过氧化氢的及时转化, 从而使生物产生过氧化损伤。本研究中MDA含量增加可能是由于生物体内自由基的累积: 当外界CO₂浓度升高到一定水平时, 生物抗氧化防御系统被激活, SOD酶活性受到诱导, 然而CAT酶活性则受到抑制, 导致过氧化氢在体内累积, 诱发细胞膜脂质过氧化产生MDA。随着CO₂浓度的继续升高, 超出机体的耐受范围, 抗氧化防御系统受到明显破坏, 表现为对SOD酶的诱导作用减弱, 对CAT酶的抑制作用增强, 从而引起机体代谢产生的自由基大量累积, 生物体内的MDA含量则显著升高^[22-29], 表明生物体受到严重的过氧化损伤。

研究发现, 在CO₂暴露过程中, 海水青鳉SOD酶的诱导作用和CAT酶的抑制作用均随暴露时间呈现先增强后减弱的趋势。通过查阅文献发现, 这主要是由于海洋二氧化碳浓度升高, 会导致海水酸化, 打破海洋碳酸盐体系的动态平衡, 使海水中的HCO₃^‒和H⁺浓度上升, 直接对海洋生物的生长发育产生危害^[30-31]。而鱼类自身具有酸碱调节机制^[20], 可以通过鳃表面、肾、肠等组织, 排出体内过多的HCO₃^–和H^+[32]。但在仔鱼阶段, 其体内的组织器官发育尚不成熟, 对海水酸化较敏感, 随着鱼类的生长发育, 酸碱调节机制逐渐完善, 对酸化环境的耐受能力会逐渐增强。

本研究建立了CO₂暴露与海水青鳉抗氧化系统不同生物标志物响应之间的剂量-效应关系, 提出了引起MDA含量增加的原因机制, 研究结果对于评估CO₂暴露的生态风险具有科学意义。未来研究还需通过生物体内自由基含量检测和基因组学、蛋白组学等技术手段进一步揭示CO₂暴露对海洋鱼类的分子毒理学作用机制。

4 结论

CO₂暴露对海水青鳉的48 h和96 h半致死浓度分别为20.8和19.5 mmol/L。CO₂暴露能够诱导海水青鳉体内超氧化物歧化酶活性升高, 但过氧化氢酶活性则受到抑制。CO₂暴露能够引起海水青鳉抗氧化系统损伤, 表现为丙二醛含量升高, 该过程可能与生物体内过氧化氢累积有关。