2024, Vol. 48
文章信息
- 崔振昊, 唐文婷, 张小倩, 孙雪, 徐年军. 2024.
- CUI Zhenhao, TANG Wenting, ZHANG Xiaoqian, SUN Xue, XU Nianjun. 2024.
- 龙须菜磷脂酶D的原核表达、酶学特征及其对高温胁迫的响应分析
- Prokaryotic expression, enzymatic characterization, and high temperature response analysis of phospholipase D from Gracilariopsis lemaneiformis
- 海洋科学, 48(11): 91-101
- Marine Sciences, 48(11): 91-101.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240319001
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文章历史
- 收稿日期：2024-03-19
- 修回日期：2024-06-10
龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是中国继海带之后的产量第2位的栽培海藻, 龙须菜不仅是生产琼胶的重要来源, 还可用作鲍鱼等水产动物的饲料[1], 同时具有较强的氮磷吸收能力, 可缓解海水的富营养化问题[2], 具有较高的经济价值和生态价值。但其栽培周期受夏季高温的限制, 高温胁迫可抑制海藻的光合作用, 破坏生物大分子(核酸、蛋白质和脂质等)的稳定性, 扰乱正常的生理功能, 从而引起海藻的发病和死亡[3]。膜脂重塑是植物抵御各种非生物胁迫的有效策略之一, 植物可通过调节膜脂组成响应温度变化, 以保持膜的最佳流动性和完整性[4-5]。磷脂酶能水解甘油磷脂, 改变脂质组成, 在植物脂质重塑、脂质信号分子产生及胁迫应答中发挥了重要作用[6]。
磷脂酶D (phospholipase D, PLD)在植物中广泛存在, 其水解产物为游离头基和磷脂酸[7]。PLD的cDNA于1994年首次从蓖麻中克隆出来[8]。迄今为止, PLD已在许多植物中被发现, 包括烟草[9]、拟南芥[10]、水稻[11]、苔藓[12]等。根据PLDs序列的相似性和结构域结构, 它们分为3个亚家族(C2-PLD, PX-PH-PLD和SP-PLD)和几种亚型(PLDα, β, γ, δ, ε, ζ和φ)[13], 几乎所有的PLD基因都含有HKD基序。研究发现, 烟草中的PLD基因在盐、干旱、高温和脱落酸(ABA)胁迫下的基因表达水平均呈现上调或下调[14]。在盐、ABA、干旱和冷(4 ℃)处理下, 高粱叶片SbPLDβ1的表达显著上调, 而SbPLDζ的转录受到抑制[15]。玉米中PLD基因在干旱、高盐和低温胁迫下, 它们的相对表达水平均存在显著差异[16]。Yang等[17]报道, CbPLDδ参与了高山离子芥对低温胁迫的响应, 具有提高植物耐低温胁迫的潜力。水稻中PLDα1基因的过表达使水稻植株能够从严重的缺水中恢复过来, 从而减少了对其产量的影响[18]。高温胁迫可以激活烟草BY-2细胞、拟南芥和水稻幼苗中的PLD表达并导致磷脂酸水平增加[19]。这表明植物中PLD基因参与许多非生物胁迫响应。
尽管目前PLD基因家族已经在多种植物中得到克隆分析, 但在龙须菜中未见报道。本研究从龙须菜全长转录组中获得了3条PLDs基因, 分别以GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3来表示, 对龙须菜中的3条PLDs基因进行了克隆、原核表达和重组蛋白制备, 鉴定其重组蛋白功能, 并探究了高温胁迫下龙须菜GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3基因的表达情况及PLD的酶活变化。本研究可为今后研究龙须菜PLD基因在龙须菜响应高温胁迫中的作用提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料与处理实验用藻均采自福建省宁德市霞浦县海域龙须菜981品系。将藻体表面的附着物冲洗干净, 放入盐度为25的人工海水中, 在温度为23 ℃、光照强度50 μmol·m–2·s–1、光周期(12L: 12D)的光照培养箱中预培养1周。实验共设置2个组: 23 ℃常温对照组(Nt)和33 ℃高温组(Ht), 每组4个平行。分别在处理1 h、2 h、4 h、8 h和24 h后取样, 液氮速冻后立即放入–80 ℃冰箱, 用于后续基因表达量及酶活的测定。
1.2 方法 1.2.1 RNA提取及cDNA合成将龙须菜样品在液氮中研磨成粉末, 然后按照PlantRNAKit(OMEGA, Georgia, USA)试剂盒说明书进行总RNA提取。分别利用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDropND2000分光光度计(Thermo Scientific, USA)检测提取的总RNA的质量和浓度。使用HiScriptr Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNAwiper) 试剂盒(诺唯赞, 中国)进行反转录得到cDNA, 于–20 ℃保存备用。
1.2.2 目的基因克隆利用无缝克隆技术构建pET30a-GlPLDs原核表达载体。基于载体pET30a及龙须菜全长转录组序列信息, 选择NdeI和XhoI为酶切位点, 通过Snapgene软件设计3条PLDs基因的无缝克隆扩增引物, 引物相关信息见表 1。以龙须菜cDNA为模板, 进行PCR扩增。PCR扩增体系及程序参照PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase(TaKaRa, 日本)说明书。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后, 切胶回收, 并检测浓度和纯度, 利用无缝克隆试剂盒(UE, 中国)与pET30a连接, 进行无缝克隆后, 转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 菌落经PCR检测为阳性后, 挑选正确的菌落扩大培养并由杭州有康生物科技有限公司完成测序, 测序结果正确的菌液加甘油至20%~ 40%在–80 ℃保存备用。
| 引物 | 引物序列(5′-3′) |
| 荧光定量PCR引物 | |
| actin-F | AAGAACAACCGTGAGCGTATGACC |
| actin-R | ACCATCACCTGAGTCAAGCACAATAC |
| GlPLD1-F | TCAACTTGCTAAGACCAGAAGACATCC |
| GlPLD1-R | TTAAGATTCGCAGAGCCCGTCAAC |
| GlPLD2-F | ATACGGGCGGCGAACAGATTTATC |
| GlPLD2-R | TTATTCCACGGACCACTCTCAATGC |
| GlPLD3-F | TCGCCGATCTTAATGACGCCATC |
| GlPLD3-R | GTCCACCAATCCAAGCCTCCAATC |
| 全长cDNA克隆引物 | |
| GlPLD1-F | CTTTAAGAAGGAGATATACATATGATGGTCCTCATACATGGAGTGCT |
| GlPLD1-R | GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTACGAAACCAGTATGTTCGGGA |
| GlPLD2-F | CTTTAAGAAGGAGAGATACATATGATGGTTCTTATTCATGGAGTTCTTCTC |
| GlPLD2-R | GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGAGACCAGAATGTTGGGAATAAC |
| GlPLD3-F | CTTTAAGAAGGAGATATACATATGATGGAAGAGCGCGCCTACTC |
| GlPLD3-R | GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCCCGTGAGTGTGTTGGGAA |
将目的基因GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3序列使用ProtParamtool(https://web.expasy.org/protparam)进行PLD蛋白的氨基酸数、蛋白分子量和等电点等理化性质的分析; 分别使用Cellov2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/), WoLFPSORT tool(https://wolfpsort.hgc.jp/), Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)进行亚细胞定位预测; 使用SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)进行信号肽分析; 使用TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)对PLD进行跨膜结构域的预测。使用Pfam(https://pfam.xfam.org/)对其进行保守结构域预测, 使用ESPript3.0 (https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)进行多重序列比对。
1.2.4 系统进化树的构建利用文献以及数据库中已有的数据下载多个物种的PLD的氨基酸序列, 其中从蛋白数据库(https://www.uniprot.org/)中选择了绳状龙须菜(Gracilariopsis chorda)和角叉菜(Chondrus crispus)中具有代表性的PLD氨基酸序列。从条斑紫菜(Neopyropia yezoensis)的基因组数据中检索到了两个NyPLD的氨基酸序列[20]。小立碗藓(Physcomitrium patens)的蛋白质组数据从GitHub项目网页中获取(https://github.com/PycnopodiaD/Pleurozium_schreberi_annotated_genome_files)[21]。从http://cyanophora.rutgers.edu/porphyridium/下载了紫球藻(Porphyridium purpureum)的相关基因组信息, 并检索到了两个PLD的氨基酸序列。从The Arabidopsis Information Resource(TAIR, https://www.arabidopsis.org/index.jsp)下载了拟南芥Arabidopsis thaliana相关基因信息。用MEGA7.0的构建最大似然法构建进化树, 重复次数为1 000次, 利用TBtools进行进化树和结构域的可视化, 用Adobe Illustrator 2022进行进化树美化。
1.2.5 目的蛋白的原核表达将鉴定成功的克隆重组菌液取出, 于冰上解冻, 取5 μL菌液至5 mL含Kan的新鲜培养基中放大培养, 37 ℃培养12~16 h (200 r/min)。提取质粒, 步骤参照试剂盒说明书(OMEGA, USA)。将构建好的pET30a- GlPLD1、pET30a-GlPLD2和pET30a-GlPLD3质粒转化到BL21感受态细胞中。从转化的平板中挑选单克隆, 接种到具有Kan抗性的LB液体培养基中, 待培养至OD600为0.6时开始诱导, 向试管培养基中加入终浓度1 mmol/L的IPTG, 之后置于28 ℃诱导表达16 h。将诱导过后的菌液置于室温12 000 r/min离心2 min收集, 加入5 mL pH7.2~7.4的磷酸盐缓冲液充分涡旋悬浮菌体, 使用超声细胞破碎仪破(SCIENTZ-ⅡD, 新芝生物, 宁波)碎菌液, 处理后于4 ℃、12 000 r/min离心20 min, 将上清液和沉淀分开, 后分别取适量上清液及沉淀变性10 min, 变性后进行SDS-PAGE电泳检测。用考马斯亮蓝染色, 洗脱过夜至背景清晰, 拍照。
1.2.6 PLDs重组蛋白的纯化和复性利用His标签蛋白纯化试剂盒(索莱宝, 北京), 对重组蛋白分别进行纯化, 操作步骤参考说明书。将诱导过后的菌液置于室温12 000 r/min离心2 min收集, 加入5 mL RIPA裂解液(强)充分涡旋悬浮菌体, 使用超声细胞破碎仪破碎菌液。收集沉淀后用包涵体蛋白溶解及复性试剂盒(酷来博, 北京)进行蛋白复性, 具体操作步骤参考说明书。
1.2.7 PLDs重组蛋白酶活鉴定用复性成功的蛋白, 参照AmplexTM Red Phospholipase D Assay Kit试剂盒(Invitrogen, USA)说明书测定龙须菜PLD重组蛋白的酶活。以来源于花生的PLD(Merck, USA)为标准品。为测定最适pH, 提前准备1 mmol/L HCl和1 mmol/L NaOH溶液用于龙须菜PLD重组蛋白催化反应体系pH的调节。每个样品重复3次, 分别制作酶活性随pH、温度变化曲线。
1.2.8 龙须菜PLDs基因的表达同上方法提取龙须菜在常温和高温下的总RNA, 使用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR试剂盒合成cDNA(Vazyme, 中国), 合成后的cDNA稀释5倍作为模板, 利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(Vazyme, 中国)进行荧光定量PCR反应。利用Primer Premier 5.0(表 1)设计荧光定量PCR引物, 以actin作为内参基因。反应程序为: 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 10 s, 58 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 40个循环, 采用2−△△CT方法计算基因的相对表达量。
1.2.9 龙须菜PLD酶活的测定用微量法测定龙须菜中PLD的活性。按照磷脂酶D测试盒(苏州科铭, 中国)说明书提供的操作步骤进行实验, 用SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices, USA)分别在500 nm波长处测定吸光值, 根据公式计算相应的PLD酶活性。
1.3 数据分析基因定量和酶活测定实验结果均以平均值±标准差(SD)表示。数据统计分析使用SPSS软件(23.0), 各处理条件下PLDs基因表达及PLD酶活数据通过独立样本T-检验进行差异显著性分析, 显著水平设定为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 龙须菜PLDs基因序列分析从龙须菜全长转录组里搜索得到龙须菜3条PLDs基因, 分别对GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3基因序列的基本理化性质进行了分析。分析结果显示,
GlPLD1蛋白的相对分子质量为100.75 kDa, 理论等电点为8.81, 多肽序列的总平均亲水性(GRAVY)为−0.376, 预测不稳定指数46.03, 无跨膜结构域, 有信号肽, 亚细胞定位预测位于细胞核; GlPLD2蛋白的相对分子质量为100.69 kDa, 理论等电点为8.59, 线性多肽序列的GRAVY为−0.374, 预测不稳定指数为48.25, 无跨膜结构域和信号肽, 亚细胞定位预测位于叶绿体; GlPLD3蛋白的相对分子质量93.69 kDa, 理论等电点为5.14, 线性多肽序列的GRAVY为−0.409, 预测不稳定指数为40.57, 无跨膜结构域和信号肽, 亚细胞定位预测位于细胞质。
2.2 龙须菜PLDs的系统发育分析为了解龙须菜PLDs与其他物种的亲缘关系远近及其进化地位, 我们选择了红藻绳状龙须菜、角叉菜、条斑紫菜和紫球藻以及拟南芥和小立碗藓中具有代表性的PLD蛋白序列与3条GlPLDs蛋白序列进行进化树及结构域分析(图 1), 发现3个GlPLDs蛋白都聚在同一簇, 这一簇主要包含绳状龙须菜、条斑紫菜、紫球藻和角叉菜。其中GlPLD3与绳状龙须菜(PXF43966.1)亲缘较近, GlPLD1和GlPLD2与角叉菜(XP005714260.1)和绳状龙须菜(PXF44167.1)的亲缘关系最近。
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| 图 1 由PLD氨基酸序列构建的系统发育树及结构域分析 Fig. 1 Phylogenetic tree and domain analysis based on the amino acid sequence of phospholipase D 注: Arabidopsis thaliana: 拟南芥; Gracilariopsis chorda: 绳状龙须菜; Chondrus crispus: 角叉菜; Neopyropia yezoensis: 条斑紫菜; Physcomitrium patens: 小立碗藓; Porphyridium purpureum: 紫球藻 |
我们通过对3个PLD蛋白进行保守结构域的预测, 发现GlPLD1、GlPLD2、GlPLD3均具有一个C2结构域, 属于C2型PLD(图 1)。使用ESPript3.0软件对来自龙须菜、条斑紫菜、莱茵衣藻、角叉菜和拟南芥的PLD蛋白序列进行多重序列比对, 结果显示, GlPLD1和GlPLD2有两个HKD结构域, GlPLD3有一个HKD结构域(图 2)。
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| 图 2 PLD蛋白的多重序列比对 Fig. 2 Multiple sequence alignment of the phospholipase D protein 注: NyPLD1: 条斑紫菜(contig 1916 g311); NyPLD2: 条斑紫菜(contig 17468 g4270); CcPLD: 角叉菜(XP005714260.1); PpPLD: 紫球藻(evm.model.contig 2164.1); AtPLD: 拟南芥(AAG51567) |
以龙须菜cDNA为模板扩增获得龙须菜GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3基因的CDS全长序列, 扩增结果如图 3a所示, 3条基因的PCR片段长短与龙须菜全长转录组序列信息一致。将3条基因分别转化至大肠杆菌中, 重组菌的PCR结果如图 3b所示, 阴性对照泳道1无任何条带, 且PCR结果均为阳性克隆。测序后发现所有阳性克隆均与龙须菜全长转录组信息一致, 长度分别为2 667 bp、2 661 bp和2 511 bp, 可用于进一步实验。
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| 图 3 龙须菜中3个PLDs基因扩增产物(a)和阳性重组子菌液扩增检测(b) Fig. 3 Amplification of three GlPLD genes (a) and positive recombinant bacterial liquid amplification detection (b) 注: (a): M, DL5000Marker; 1-3, GlPLD1; 4-6, GlPLD2; 7-9, GlPLD3。(b): M, DL5000Marker; 1, 阴性对照; 2-3, GlPLD1; 4-5, GlPLD2; 6-7, GlPLD3。 |
为进一步鉴定GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3的功能, 通过对上清与沉淀进行SDS-PAGE分析检测, 发现蛋白在包涵体中表达(图 4)。为获得纯度较高的目的蛋白, 通过亲和层析纯化包涵体蛋白, 用500 mmol/L咪唑的平衡缓冲液洗脱目的蛋白, 并对洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测, 其蛋白大小与预测的蛋白分子量一致(图 5a), 表明GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3基因在大肠杆菌中成功表达。
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| 图 4 龙须菜PLD重组蛋白的诱导表达 Fig. 4 Induced expression of GlPLD recombinant proteins 注: M为蛋白Marker, 1-3分别为GlPLD1的全菌液、全菌破菌后上清、全菌破菌后沉淀, 4-6分别为GlPLD2的全菌液、全菌破菌后上清、全菌破菌后沉淀, 7-9分别为GlPLD3的全菌液、全菌破菌后上清、全菌破菌后沉淀 |
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| 图 5 龙须菜PLD重组蛋白的纯化和复性 Fig. 5 Purification and refolding of GlPLD recombinant proteins 注: (a)M为蛋白Marker, 泳道1-3为500 mmol/L Imidazole的GlPLD1洗脱组分, 泳道4-6为500 mmol/L Imidazole的GlPLD2洗脱组分, 泳道7-9为500 mmol/L Imidazole的GlPLD3洗脱组分; (b)M为蛋白Marker, 泳道1-2为GlPLD1蛋白复性结果, 泳道3-4为GlPLD2蛋白复性结果, 泳道5-6为GlPLD3蛋白复性结果 |
如图 5b所示, 经过复性和纯化处理后, 龙须菜PLDs包涵体蛋白成功复性和纯化, 蛋白纯度较高, 并且分子量大小也符合预期, 约为100 kDa。综上, 本研究利用表达质粒pET-30a在大肠杆菌中成功地实现了3个龙须菜PLD蛋白的重组表达, 获得的可溶性PLDs蛋白可用于后续蛋白功能研究。
2.5 PLD重组蛋白酶学特征分析通过测定PLD蛋白对磷脂酰胆碱的胆碱水解活性来表征重组蛋白的PLD酶活。以来源于花生的PLD的不同比活和相对荧光值建立标准曲线, 两者呈线性关系, 标准曲线为y = 1.100 5x + 3.495(图 6a)。根据标准曲线计算出3个GlPLD蛋白的最终酶活, 如图 6b所示, GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3重组蛋白均具有PLD活性, 进而鉴定了龙须菜GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3的基因功能。
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| 图 6 GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3重组蛋白的酶活测定 Fig. 6 Enzyme activity assay of recombinant GlPLD1, GlPLD2, and GlPLD3 proteins 注: 不同字母代表不同处理间差异显著(P < 0.05) |
进一步选取GlPLD2蛋白探究温度和pH值对其酶活的影响。由图 6c可以看出, 当温度在29~37 ℃时, 酶的比活较大, 而温度较低或者是高于37 ℃时, 酶的比活急剧降低, 说明温度过高或者过低酶的活性都会降低, 甚至会达到失活的状态。当温度在33 ℃时, GlPLD2的比活最大, 为255 U/mL。设置反应温度为33 ℃, 改变反应体系的pH, 探究GlPLD2的最适反应pH。由图 6d可以看出, pH值为5~11时, 均可以检测到其活性。酶促反应的pH值在小于7的酸性条件下以及大于9的碱性条件下酶的比活均会降低。而当酶促反应的pH介于7~9时, 其酶活的大小相对较高, 而当pH=8时其比活最大, 为250 U/mL, 所以, 本研究中GlPLD2的最适反应pH为8。
2.6 高温胁迫对龙须菜PLDs基因表达及PLD酶活的影响为进一步了解高温胁迫对龙须菜PLD的影响, 我们比较了常温和高温培养下GlPLD1、GlPLD2与GlPLD3的表达水平(图 7a-c)。结果表明, GlPLD1、GlPLD2与GlPLD3基因表现出相同的表达模式, 即在高温胁迫初期, 3个PLDs的表达水平显著上调, 并在4 h达到峰值, 4 h之后PLDs的表达水平迅速降低, 这说明高温胁迫初期, 龙须菜会通过上调PLDs基因的表达水平来响应高温胁迫。
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| 图 7 高温胁迫下GlPLD1、GlPLD2与GlPLD3基因表达水平变化(a-c)及龙须菜PLD酶活变化(d) Fig. 7 Changes in GlPLD1, GlPLD2 and GlPLD3 expression levels (a–c) and phospholipase D enzyme activity (d) changes in Gracilariopsis lemaneiformis under heat tress 注: Nt, 常温; Ht, 高温; 不同字母代表不同处理间差异显著(P < 0.05) |
在处理4 h和24 h时, 对常温、高温下的龙须菜藻体进行PLD酶活测定。如图 7d所示, 在高温胁迫4 h时, 高温下PLD的酶活性显著高于常温, 在24 h时常温和高温下的PLD酶活性无显著差异, 我们推测在高温胁迫初期, 龙须菜PLD的酶活会迅速上升以响应高温环境, 随着胁迫时间的延长, PLD的酶活与对照组无显著差异。
3 讨论目前PLD家族已经在众多植物中被克隆研究, 但在龙须菜中还未见报道, 本实验成功克隆了龙须菜中的3条PLD基因(GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3), 对其进行表达纯化, 纯化后的龙须菜PLD蛋白分子量分别为100.75 kDa、100.69 kDa、93.69 kDa, 这与目前报道的大部分PLD分子量在75 kDa~125 kDa[22]是一致的。亚细胞定位预测研究表明, GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3分别位于细胞核、叶绿体和细胞质中, 同样地, 兰花中PLD亚细胞定位于细胞质、叶绿体和细胞核中[23]。此外, 龙须菜GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3中均具有C2结构域, C2结构域通过以Ca2+依赖的方式结合磷脂介导可溶性蛋白向膜的定位[24], 具有N端附近Ca2+依赖的磷脂结合C2结构域的PLDs被称为C2-PLDs[23]。此外, 研究表明, 几乎所有PLD都有两个HKD (HxKxxxxD)结构域, 在此基序中, H、K和D分别代表一种氨基酸类型, 其中H为组氨酸, K为赖氨酸, D为天冬氨酸[25]。HKD基序是磷脂酶的标志性序列, 也是其水解催化活性的关键部位。这些HKD基序一般在320个氨基酸的间隔后出现[26]。通过多重序列比对, 龙须菜中的HKD基序均在320个氨基酸后出现的。我们在GlPLD1、GlPLD2中找到2个HKD结构域。与其他PLD基因有2个HKD基序不同, 在GlPLD3中仅找到1个HKD结构域。研究表明, 苔藓PLD同样缺乏HKD基序, 例如, 小立碗藓中的PpPLD12、赤茎藓中的PsPLD1和PsPLD 2和丘间种喙叶泥炭藓的SfPLDs14、15和20中不存在HKD1基序, 角齿藓中的CpPLD13和小立碗藓中的PpPLD9不存在HKD2基序[12]。推测这可能与龙须菜和苔藓进化地位较为原始有关。
重组蛋白酶活测定结果表明, GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3重组蛋白均具有PLD的功能, 从而在体外水平鉴定了龙须菜GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3的基因功能。进一步对龙须菜PLD2进行最适酶促反应条件探究发现, 龙须菜PLD2催化反应最适温度为33 ℃, 这与从土壤中分离得到的菌株Streptomyces sp. p82中PLD的最适反应温度为30 ℃相近[27], 而枯草芽胞杆菌中的PLD酶活性最适温度和哈维氏弧菌中PLD的酶活性最适温度分别为40 ℃和45 ℃[28-29]。此外, 本研究中, 龙须菜PLD2重组蛋白催化反应的最适pH值为8.0。与GlPLD2一致, 嗜热隐孢子虫的LyPls-PLD和克伦基链霉菌中PLD的酶活性在pH 8.0时最高[30-31]。而高山离子芥和香蕉中PLD酶促反应的最适pH值分别为7和6.5, 略低于GlPLD2[22, 32]。以上结果表明, 不同物种来源的PLD的最适酶促反应条件存在差异。
PLD参与了植物体内的多种胁迫应答[33]。马铃薯中StPLDα1、StPLDα2、StPLDδ1、StPLDδ4、StPLDδ5和StPLDζ2等6个基因在高温胁迫下表达水平显著上调[14]。高温胁迫下‘苏州青’中BrPLD01和‘矮脚黄’中BrPLD03的表达水平也逐渐上调[34]。与这些研究结果一致, 在本研究中, GlPLD1、GlPLD2与GlPLD3表现出相同的表达模式, 即在高温胁迫初期, GlPLD1、GlPLD2与GlPLD3的表达水平会显著上调, 并在4 h达到峰值, 而在4 h后, 其表达水平逐渐恢复正常水平; 与基因表达水平变化一致, 龙须菜中的PLD酶活在高温胁迫4 h时显著提高, 推测PLD参与了龙须菜对高温胁迫的响应, 且主要在胁迫前期发挥作用。PLD已被证明可直接与不同蛋白质产生相互作用, 包括蛋白酶抑制剂、Gα, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶、肌动蛋白和微管蛋白等, 此外, PLD还可通过水解磷脂产生脂质信号分子磷脂酸, 磷脂酸也可与多种蛋白质(转录因子、蛋白激酶、脂质激酶、蛋白磷酸酶以及囊泡运输相关蛋白等)结合互作, 这些相互作用会影响PLD及效应蛋白功能及其在细胞内的分布, 进而参与细胞信号传导及功能调节[35-37]。在逆境胁迫下, 植物中的PLD被激活并产生PA, 从而调控植物对逆境的响应。盐胁迫会诱导磷脂酸的短暂增加, 磷脂酸可结合并激活MPK6, 进而磷酸化SOS1 Na+/ H+反转运蛋白, 参与植物的盐胁迫应答[38]。拟南芥PLDα1激活产生磷脂酸, PLDα1衍生的磷脂酸可以结合2种NADPH氧化酶(RbohD和RbohF)以产生ROS, 响应ABA依赖性气孔闭合[39]。但在本研究中, PLD对龙须菜响应高温胁迫的具体代谢调节机制仍需进一步研究。
4 结论综上, 本研究以龙须菜为材料, 成功克隆了龙须菜GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3基因, 它们的cDNA序列长度分别为2 667 bp、2 661 bp和2 511 bp, 编码898、888和886个氨基酸。GlPLD3与绳状龙须菜(PXF43966.1)亲缘较近, GlPLD1和GlPLD2与角叉菜(XP005714260.1)和绳状龙须菜(PXF44167.1)的亲缘关系最近。GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3均具有保守的C2结构域和HKD结构域。通过原核表达分别获得了龙须菜GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3重组蛋白, 经体外酶促反应证明GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3均具有PLD功能, 可水解磷脂酰胆碱中的胆碱基团, 从而鉴定了龙须菜GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3基因的体外功能; 此外, GlPLD2催化酶促反应的最适温度和pH分别为33 ℃和8.0。另外, 高温胁迫会上调GlPLD1、GlPLD2和GlPLD3的基因表达水平和PLD酶活, 推测其在龙须菜高温胁迫应答中发挥功能。因此, 本研究可为进一步鉴定龙须菜PLD功能及PLD在龙须菜高温胁迫应答中的作用研究奠定基础。
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