2024, Vol. 48
文章信息
- 张学鑫, 李荣锋, 李航, 李冠天, 毕允晨. 2024.
- ZHANG Xuexin, LI Rongfeng, LI Hang, LI Guantian, BI Yunchen. 2024.
- 方格星虫(Sipunculus nudus L.)体壁多糖的分离纯化、结构鉴定和抗凝血活性研究
- Extraction, purification, structural determination, and anticoagulant activity of polysaccharides from the body wall of Sipunculus nudus L.
- 海洋科学, 48(12): 83-93
- Marine Sciences, 48(12): 83-93.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240320002
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文章历史
- 收稿日期：2024-03-20
- 修回日期：2024-04-15
2. 青岛海洋科技中心海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
海洋环境蕴藏着丰富的生物资源, 其中海洋生物活性物质以其独特的化学结构和广谱药理作用而备受关注。与陆生生物相比, 海洋生物在长期适应高盐、高压、低温、缺氧等极端环境的进化过程中, 形成了独特的代谢途径和次生代谢产物, 是天然活性物质的重要来源, 其中包括许多结构新颖、功能多样的海洋生物活性多糖[1]。海洋动物, 尤其是海洋无脊椎动物体内富含多糖、脂肪酸、生物碱等活性成分。其中, 具有复杂分子结构和显著生物活性的海洋动物多糖是海洋药用资源研究的热点。研究表明, 从海参[2]、海葵[3]、海胆[4]、牡蛎[5]、海绵[6]和文蛤[7]等海洋底栖动物中提取分离的多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗凝血、抗病毒、清除自由基、提高免疫力等多种药理活性[8]。随着海洋生物资源的进一步开发利用和海洋药物研究的深入, 特别是海洋糖组学的发展和应用, 结构独特、活性显著的海洋动物新型多糖将为心脑血管、肿瘤、炎症性疾病等的防治提供先导化合物和药物候选物, 具有广阔的开发前景。
方格星虫(Sipunculus nudus L.), 隶属于环节动物门, 主要栖息于热带和亚热带近海潮间带和浅海沙泥底, 常被称为沙虫[9], 主要分布于中国南部沿海地区, 以广东、广西、海南和福建为其主要产地[10]。方格星虫体内含有丰富的生物活性物质, 其中多糖成分具有多种生理功能。例如, 董兰芳等[11]发现方格星虫多糖对枯草芽孢杆菌和藤黄八叠球菌具有一定的抑制效应。Gao等[12]发现方格星虫多糖可以对人肠上皮细胞辐射损伤起到保护作用。Zhang等[13]的研究证实方格星虫多糖能够激活巨噬细胞并具有强大的免疫刺激活性, 能够上调细胞因子(IL-6和TNF-α)的表达, 同时诱导iNOS和COX-2的表达。Li等[14]报道方格星虫多糖具有显著的抗氧化和骨髓损伤保护能力, 在预防辐射损伤方面发挥重要作用。然而目前对其结构研究仍然较少。方格星虫多糖活性广泛, 系统开展其生物活性与结构的相关性研究, 对于阐明其作用机制和开发应用均具有重要意义。
抗凝血物质在预防和治疗血栓性疾病, 如心脑血管血栓、下肢静脉血栓、肺栓塞等方面发挥着重要作用[15]。目前临床常用的抗凝药物主要为肝素类抗凝物质[16]。然而, 肝素类药物存在出血风险高、血小板减少、药物来源较为单一, 容易产生肝素抵抗等问题[17]。因此, 开发新型高效低毒的抗凝药物对于血栓性疾病的防治具有重要意义, 是国内外的研究热点。近年来, 从海洋动物中发现了多种具有抗凝活性的硫酸化多糖, 如鲍鱼[18]、海星[19]、沙蚕[20]、海兔[21]、珊瑚[22]、海参[23]和单环刺螠[24]多糖等。这些海洋来源的抗凝多糖具有活性高、毒副作用小、来源广泛等优势[25]。目前关于海洋动物硫酸化多糖抗凝活性的研究大多集中于棘皮动物和软体动物, 而对海洋环节动物多糖的研究相对较少。鉴于星虫动物在进化地位、生存环境和次生代谢等方面的特殊性, 其体内可能存在结构新颖、活性显著的抗凝血多糖。方格星虫多糖已被证明具有多种生物学活性, 但其抗凝血活性及可能的作用机制尚不清楚, 有待深入研究。本文以方格星虫为研究对象, 采用多种分离分析手段对其体壁多糖的化学结构和抗凝血作用进行系统研究, 以期发现新型抗凝候选物, 为开发新型海洋抗凝物质提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料方格星虫采自青岛附近海域。15种标准单糖, 包括古罗糖醛酸、甘露糖、甘露糖醛酸、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖购买自Sigma公司。DEAE纤维素(DE-52)、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司。BCA蛋白检测试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。苯酚、硫酸、氯化钠、三氟乙酸、氢氧化钠、盐酸、硝酸钠和叠氮化钠购买自国药集团化学试剂有限公司。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。乙腈和氯仿购自ACS公司。活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒、凝血酶时间(TT)测定试剂盒和凝血酶原时间(PT)测定试剂盒均购自上海太阳生物技术有限公司。
1.2 多糖的提取取700 g新鲜完整的方格星虫, 剖去内脏并洗净, 取其体壁粉碎匀浆。在60 ℃下热水浸提3次, 每次浸提6 h, 料液比1∶5。向提取后的溶液中依次加入0.2%(w/w)的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶, 其中胰蛋白酶的反应条件为37 ℃, pH = 8.0; 木瓜蛋白酶反应条件为55 ℃, pH = 6.0; 中性蛋白酶反应条件为45 ℃, pH = 7.0; 碱性蛋白酶反应条件为50 ℃, pH = 10.0; 反应时间均为6 h。反应结束后加热至100 ℃将酶灭活, 8 000 r/min离心20 min弃去沉淀。利用旋转蒸发仪将溶液浓缩至200 mL, 加入乙醇过夜, 乙醇终浓度分别为30%、50%、80%。每次醇沉结束后离心弃去上清, 将得到3种沉淀称重, 并计算产率。之后沉淀再次加水复溶, 透析3次(3 500 Da)之后冻干。利用BCA试剂盒测定粗多糖样品中的蛋白浓度[26], 利用苯酚硫酸法对样品中的总糖浓度进行测定[27], 绘制的标准曲线如图 1所示。取部分多糖于105 ℃下烘干至恒重, 根据其质量的变化测定水分占比。
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| 图 1 总糖与蛋白浓度测定标准曲线 Fig. 1 Standard curves for determining total sugar and protein concentrations |
利用Cellulose DEAE-52阴离子交换柱(3.5 cm × 30 cm)通过Äkta avant 25系统对粗多糖进行NaCl线性洗脱纯化。NaCl溶液物质的量浓度从0上升到0.5 mol/L, 线性上升时间为30 min, 流速为2.0 mL/min。用15 mL离心管收集馏分, 共收集45~60管。其中前200 mL为纯水洗脱, 后续为线性梯度NaCl洗脱。利用苯酚–硫酸法测量各组分的多糖浓度并作图。
1.4 单糖组成分析多糖样品的单糖组成分析采用柱前PMP衍生化HPLC分析法[28]。首先称取适量样品于水解管中, 加入1 mL物质的量浓度为2 mol/L的三氟乙酸, 于氮气保护下110 ℃水解5 h。取出后将其冷却至室温, 取0.5 mL于4 mL离心管中, pH调至中性; 向其中加入0.2 mL物质的量浓度为0.3 mol/L的NaOH溶液, 0.4 mL PMP甲醇溶液, 充氮气后于70 ℃下水浴60 min。取出后冷却后加入0.2 mL物质的量浓度为0.3 mol/L的HCl, 加水定容到2 mL。再加1.5 mL的氯仿, 振荡摇匀后静置分层, 弃去下层氯仿, 如此反复萃取3次, 水层过0.45 μm滤膜。色谱柱为C18 4.6 mm × 250 mm × 5 μm。流动相A为15%乙腈(经0.05 mol/L的KH2PO4稀释, pH = 6.8), 流动相B为40%乙腈(经0.05 mol/L的KH2PO4稀释, pH = 6.8)。柱温为25 ℃; 进样量为20 μL; 检测波长为254 nm。流动相梯度按照表 1进行。
| 时间/min | 流动速度/(mL·min−1) | 流动相A/% | 流动相B/% |
| 0 | 1.0 | 100 | 0 |
| 10 | 1.0 | 92 | 8 |
| 40 | 1.0 | 63 | 37 |
| 45 | 1.0 | 100 | 0 |
| 50 | 1.0 | 100 | 0 |
单糖浓度按下式计算:
| $ W=\frac{\left(C-C_0\right) \times V \times N}{m}，$ | (1) |
其中, W代表试样中目标物的质量分数, 单位mg/kg; C代表试样测定液中目标物的质量浓度, 单位mg/L; C0代表空白对照中目标物的质量浓度, 单位mg/L; V代表定容体积, 单位mL; N代表稀释倍数; M代表试样的取样量, 单位g。
1.5 分子量测定采用凝胶渗透色谱法进行测定。色谱柱使用PL aquagel-OH Mixed-H, 8 μm, 7.5 mm × 300 mm(分子量范围500~1.0 × 107 Da)。检测器为示差检测器和双角度激光散射检测器。流速为1.0 mL/min, 柱温为45 ℃; 进样量为50 μL。流动相为0.1 mol/L硝酸钠(0.01% 叠氮化钠)等度洗脱。通过样品的出峰时间等利用GPC软件包(Agilent, USA)在线处理输出信号。据此, 拟合计算出样品的峰值分子量(Mp)、数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和Z均分子量(Mz)。
1.6 硫酸根浓度测定以硫酸钾为标准品, 采用明胶-氯化钡法测定多糖中的硫酸根浓度[29]。称取1 g明胶, 加入200 mL去离子水后加热至60 ℃, 充分溶解后冷却, 0.5 g BaCl2溶解于100 mL 5%明胶溶液后4 ℃过夜。准确称取20 mg硫酸钾定容至100 mL。分别取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL硫酸钾溶液置于试管中, 加入去离子水补齐至1 mL。准确称取10.0 mg纯化组分置于安部瓶中, 加入2 mL HC1溶液(1 mol/L)后封口, 100 ℃水解6 h后于50 ℃真空减压烘干, 浓缩后的固体溶解于200 μL去离子水。分别取标准品溶液、样品溶液、去离子水(空白)各50 μL, 100 μL的BaCl2-明胶溶液于微孔板中, 吹打混匀后静置5 min, 于360 nm处测定吸光度值。以标准品溶液的吸光度为纵坐标、SO42−离子的浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线, 如图 2所示。由线性方程y = 0.047x − 0.011 8计算多糖样品中的硫酸根浓度。
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| 图 2 BaCl2-明胶比浊法测定硫酸基浓度的标准曲线 Fig. 2 Standard curve for determining the sulfate concentration based on BaCl2-gelatin turbidimetry |
将纯化后的多糖样品涂布在光滑的黑色基底(1.0 × 1.0 cm2)上, 利用扫描电子显微镜观测(SEM)S-3400N2 (Hitachi, Japan)分别在3.0 kV × 1.00 k, 3.0 kV × 2.00 k和3.0 kV × 5.00 k的条件下对多糖的表面结构进行观测。
1.8 红外光谱分析利用Nicolet iS50(Thermo Electron Scientific Instruments, USA)红外光谱仪对冻干后的多糖样品进行观测。多糖的红外光谱检测范围为500~4 000 cm−1, 分辨率为4 cm−1, 扫描次数为32次。
1.9 抗凝血活性测定将冻干后的多糖样品制备成2、4、8 mg/mL的溶液, 以2 mg/mL的硫酸软骨素作为阳性对照, 分别使用活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒、凝血酶时间(TT)测定试剂盒和凝血酶原时间(PT)测定试剂盒进行测定。APTT活性测定: 分别取10 μL各浓度样品溶液或空白对照(生理盐水), 30 μL羊血浆, 30 μL鞣花酸试剂置于血凝杯中, 在37 ℃混合孵育5 min, 加入30 μL CaCl2, 使用凝血分析仪检测并记录凝固时间。PT活性测定: 分别取10 μL各浓度样品溶液或生理盐水, 30 μL羊血浆, 置于血凝杯中, 在37 ℃下加入60 μL的PT检测剂, 使用凝血分析仪检测并记录凝固时间。TT活性测定: 分别取10 μL各浓度样品溶液或空白对照, 45 μL羊血浆, 置于血凝杯中, 在37 ℃下加入45 μL TT检测剂, 使用凝血分析仪检测并记录凝固时间。
2 结果与分析 2.1 方格星虫多糖的提取与分离纯化本研究采用了水提、酶解和醇沉的方法, 从方格星虫体壁中提取分离多糖。对提取时间、温度和料液比等因素进行优化后的结果表明, 在液料比1∶5、提取温度60 ℃、提取3次(每次6 h)的最优条件下, 方格星虫多糖的80%醇沉提取率可达5.76%, 高于传统热水提取法[11, 13]。产物水溶性较好, 总糖占比为90.24%, 水分占比为2.00%, 蛋白占比为3.84%, 表明其纯度较高, 满足后续测定需要。此外, 30%和50%醇沉产物产率分别为2.90%和2.05%, 但产物难溶于水, 经测定总糖浓度较低, 故未进行后续测定。
DEAE-52离子交换层析洗脱曲线(以碳水化合物浓度计)如图 3所示, 在洗脱体积为220~300 mL范围内出现一个较为对称尖峰, 收集该峰馏分后, 经脱盐、浓缩及冷冻干燥后, 得到纯化的非中性多糖, 命名为SLP。SLP的蛋白洗脱曲线和多糖洗脱曲线高度重合, 证明SLP含有一定量的蛋白组分。
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| 图 3 方格星虫多糖的洗脱曲线 Fig. 3 Elution curve of polysaccharides from Sipunculus nudus L. |
采用PMP衍生化-HPLC法分析了SLP的单糖组成(图 4)。SLP主要含有4种中性单糖, 分别为甘露糖(Man)、核糖(Rib)、半乳糖(Gal)和葡萄糖(Glc), 这表明SLP属于杂多糖, 其组分相对简单。根据各单糖峰面积, 可计算出4种单糖在SLP中的相对摩尔浓度, 结果见表 2。葡萄糖和半乳糖是SLP的主要组分, 分别占总糖量的42.32%和32.54%, 二者合计超过70%。甘露糖和核糖的浓度相对较低, 分别为6.09%和17.23%。此外, SLP中未检出岩藻糖和木糖, 说明其可能不含硫酸化岩藻糖。综合单糖组成分析结果, 初步推断SLP可能是一种含有核糖的杂多糖。这一结果与文献报道的其他海洋无脊椎动物多糖组成存在一定差异, 例如, 海绵多糖主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成, 三者的比例为2.89∶1.94∶1.00[6]; 海星多糖主要由糖醛酸、氨基半乳糖、氨基葡萄糖和半乳糖组成, 四者比例为56.8∶45.4∶12.6∶1[19]; 海参多糖主要由N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和岩藻糖组成, 三者的比例为1.18∶1∶1[30]; 海胆多糖主要由葡萄糖醛酸、甘露糖、木糖和鼠李糖组成, 四者的比例为1.51∶1.27∶1∶1[31], 这表明SLP具有较为独特的单糖组成, 其结构和功能有待进一步研究。
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| 图 4 SLP的PMP衍生产物的HPLC色谱图 Fig. 4 HPLC chromatogram of the PMP derivative products of SLP |
| 成分 | GulA | ManA | Man | GlcN | Rib | Rha | GlcA | GalA |
| 质量分数/% | – | – | 6.09 ± 0.03 | – | 17.23 ± 1.13 | – | 1.09 ± 0.00 | 0.04 ± 0.00 |
| 成分 | GalN | GlcNAc | Glc | GalNAc | Gal | Xyl | Ara | Fuc |
| 质量分数/% | – | – | 42.32 ± 0.13 | – | 32.54 ± 0.03 | 0.11 ± 0.00 | 0.18 ± 0.01 | 0.38 ± 0.00 |
| 注: 表中的缩写分别代表: GulA: 古罗糖醛酸; ManA: 甘露糖醛酸; Man: 甘露糖; GlcN: 氨基葡萄糖; Rib: 核糖; Rha: 鼠李糖; GlcA: 葡萄糖醛酸; GalA: 半乳糖醛酸; GalN: 氨基半乳糖; GlcNAc: N-乙酰氨基葡萄糖; Glc: 葡萄糖; GalNAc: N-乙酰氨基半乳糖; Gal: 半乳糖; Xyl: 木糖; Ara: 阿拉伯糖; Fuc: 岩藻糖。表中数据均以平均值±标准差表示 | ||||||||
多糖的均一性和分子量是影响其生物活性的重要因素。SLP在相对分子质量约为9.0 × 103处出现对称单峰, 表明SLP为均一纯度较高的多糖。SLP的Mw、LS 90°、LS 15°的测定结果图像如图 5所示。SLP的平均分子量如表 3所示, 其的数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw)和Z均分子量(Mz)分别为9 201、9 622和10 052 Da, 均在1.0 × 104 Da左右, 峰值分子量(Mp)为9 595 Da, 与Mw基本一致。多分散系数(PDI: Mw/Mn)为1.05, 进一步证实SLP分子量分布均一。与其他海洋动物中分离的抗凝多糖如海参多糖[23] (1.85 × 104 Da)和鲍鱼内脏多糖[18](2.62 × 104 Da)相比, SLP的分子量相对较低。多糖的生物活性往往具有明显的分子量依赖性[32-35], Lin等[36]和Wang等[37]发现低分子量的枸杞叶多糖组分和浒苔多糖组分具有更好的抗凝血活性。我们推测SLP抗凝血活性的实现可能与其较小的相对分子质量有着密切联系。
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| 图 5 SLP的分子量测定色谱图 Fig. 5 Chromatogram for SLP molecular weight determination 注: Ht: 检测器响应信号强度; W: 质量分数; M: 分子质量 |
| Mp | Mn | Mw | Mz | PDI (Mw/Mn) | |
| 分子量/(g·mol−1) | 9 595 ± 38 | 9 201 ± 13 | 9 622 ± 16 | 10 052 ± 20 | 1.05 ± 0.00 |
| 注: 表中所有的缩写分别代表: Mp: 峰值分子量; Mn: 数均分子量; Mw: 重均分子量; Mz: Z均分子量。表中数据均以平均值±标准差表示 | |||||
由标准曲线的线性方程y = 0.047x − 0.011 8可计算出多糖样品中, 硫酸基的质量比约为0.40%。结合SLP的单糖组成数据和总糖浓度, 可算出SLP中的硫酸根取代度约为0.74%。相比之下, 海参多糖中硫酸根的浓度为35.86%[30], 海兔多糖中硫酸根的浓度为28.42%[21], 海星多糖中硫酸根的浓度为28.1%[19], 与其他海洋底栖动物来源的抗凝多糖相比, SLP的硫酸化取代程度很低。而海洋来源的抗凝多糖往往是通过修饰在多糖上的硫酸根发挥作用[18-19, 23], SLP较低的硫酸根浓度暗示了其可能的独特抗凝血机理。蚯蚓作为环节动物门的代表生物之一, 其体内的多糖也较少含有硫酸根修饰, 研究表明其通过影响血液中的P2Y12受体, 从而发挥抗血小板作用[38]。因此我们推测SLP的抗凝血机理可能与其类似, 具有进一步开发改性的潜力。
2.5 多糖的表面结构及组装SEM可直观反映多糖分子的微观形貌特征。本研究采用SEM观察了SLP的表面形态, 电镜照片见图 6。放大倍数为1 000倍时, 多糖的表面结构以不规则的片状结构为主, 分布较为分散, 暗示多糖分子在样品表面并没有形成紧密堆积, 而是以一种相对稀疏的方式排布。这种稀疏的排布可能使多糖分子更容易与血液中的凝血因子相互作用, 从而发挥抗凝血作用[39]。当放大提高至5 000倍时, 片状结构的表面逐渐光滑, 但断口处较为不平整。尽管有这些观察结果, 但SLP的整体结构仍保持着一定程度的规律性。
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| 图 6 SLP的SEM观测图像 Fig. 6 SEM images of SLP |
红外光谱(FT-IR)可用于鉴定多糖的糖苷键型和取代基类型。图 7示出了SLP的FT-IR光谱。在3 258 cm–1处出现强而宽的吸收峰, 对应多糖分子中O–H和N–H的伸缩振动, 表明SLP分子中含有大量的羟基和氨基。在2 929 cm–1处的吸收峰归属于C–H的不对称伸缩振动。1 637 cm–1处的吸收峰为水分子的变形振动峰, 说明SLP结构中含有结合水[40]。1 024 cm–1处的吸收峰分别对应多糖的C–O–C的伸缩振动, 是多糖结构的特征吸收峰之一。1 533 cm–1处的吸收峰对应–N–H的伸缩振动[41], 1 395 cm–1处是–CH2–的弯曲振动峰[42]。926 cm–1处的峰表明存在葡萄糖环[14]。在865 cm–1处的吸收峰表明SLP具有α-构象[43]。一般来说, 多糖分子中硫酸基的特征吸收峰出现在1 240~1 260 cm–1范围内。而SLP的红外光谱在该区域未见典型的硫酸基吸收峰, 表明其硫酸基浓度较低, 与硫酸根含浓度测定的结果基本吻合。
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| 图 7 SLP的红外分析谱图 Fig. 7 Infrared spectroscopy analysis of SLP |
多糖的抗凝血活性可通过活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和凝血酶原时间(PT)等指标来评价。SLP对APTT有一定的延长作用, 表现出抗凝血活性, 且呈剂量依赖性(图 8)。当SLP质量浓度为200 μg/mL时, APTT为较对照组延长了约43.7%。随着SLP质量浓度升高到400 μg/mL, APTT延长到105.8 s, 是对照组的2.95倍, 但当SLP质量浓度继续升高到800 μg/mL时, APTT并未显著延长(120.8 s), 提示SLP的抗凝活性存在剂量饱和效应。硫酸软骨素在200 μg/mL时, APTT延长时间为78.1 s, 要略高于同浓度下的SLP。总体而言, SLP对APTT的延长作用略低于硫酸软骨素以及海参多糖[30]。
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| 图 8 SLP的抗凝血活性测定 Fig. 8 Determination of the anticoagulant activity of SLP |
海洋生物活性多糖是海洋药物开发的重要领域。本研究以中国南方海域特有的底栖动物方格星虫为研究对象, 采用水提法、酶解法和DEAE–52离子交换层析等方法, 成功分离纯化了一种非中性杂多糖SLP, 产率为5.76%, 纯度超过90%。其得率显著优于文献报道[11, 13]。这可能是由于温和的酶解条件更有利于多糖的完全释放, 同时反复的乙醇沉淀和离子交换层析能够有效去除蛋白、脂质等杂质。因此, 本研究建立的分离纯化工艺简便高效, 适合SLP的制备。此外, 在多糖的提取过程中采用了分级醇沉, 在低浓度醇沉过程中基本没有多糖组分析出。这说明了方格星虫体壁内不含有分子量较大的多糖。
本研究采用了HPLC、GPC、SEM和FT-IR等多种现代分析技术, 对SLP的化学结构进行了表征。结果表明, SLP是一种由Man、Rib、Gal和Glc以1∶2.83∶5.34∶6.95的物质的量比组成的杂多糖。与这一结果与文献报道的其他海洋无脊椎动物多糖组成存在一定差异, 例如, 海绵多糖主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成, 三者的比例为2.89∶1.94∶1.00[6]; 海星多糖主要由糖醛酸、氨基半乳糖、氨基葡萄糖和半乳糖组成, 四者比例为56.8∶45.4∶12.6∶1[19]; 海参多糖主要由N-乙酰氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和岩藻糖组成, 三者的比例为1.18∶1∶1[30]; 海胆多糖主要由葡萄糖醛酸、甘露糖、木糖和鼠李糖组成, 四者的比例为1.51∶1.27∶1∶1[31], 这提示SLP是一类具有新颖化学结构的海洋动物来源的杂多糖。
SLP的平均分子量为9.62 kDa, 多分散系数为1.05, 其分子量低于大多数海洋动物硫酸化多糖如鲍鱼[45]、刺参[46]多糖等, 且均一性较好。通常, 多糖的生物活性往往具有明显的分子量依赖性[32-35], Lin等[36]和Wang等[37]发现低分子量的枸杞叶多糖组分和浒苔多糖组分具有更好的抗凝血活性。我们推测SLP抗凝血活性的实现可能与其较小的相对分子质量有着密切联系。FT-IR光谱进一步证实SLP主要由α糖苷键连接的糖单元构成, 含有氨基和羟基, 但硫酸基浓度很低。综上, SLP具有不同于其他海洋多糖的结构, 可能为其独特生物活性提供分子基础。
本研究首次证实, 方格星虫多糖SLP具备抗凝血活性, 其主要表现为对活化部分凝血活酶时间(APTT)的延长作用。在200~400 µg/mL的浓度范围内, 这种延长作用呈现出剂量依赖性。然而, 当浓度达到800 µg/mL时, 抗凝血活性出现饱和现象。鲍鱼多糖和海参多糖均表现出对APTT的显著延长作用。然而, SLP在400 µg/mL时对APTT的延长倍数略低于同等浓度下的鲍鱼多糖[18]和刺参多糖[23], 提示其抗凝血活性相对较弱。分析其原因, 可能与SLP的低硫酸化程度有关。通过FTIR结果和硫酸根浓度测定结果可知, SLP的硫酸基浓度很低。硫酸基浓度被认为是影响多糖抗凝活性的关键因素, 其作用机制主要是通过提高分子负电荷密度, 增强与凝血因子的静电结合[44]。一般认为, 高度硫酸化有利于维持多糖分子的线性构象, 硫酸基团的大量引入也赋予多糖更多的负电荷基团, 有利于其与带正电的生物大分子(如蛋白质)结合。但值得注意的是, SLP的硫酸基浓度明显低于其他海洋硫酸化多糖(20%~30%), 却表现出显著的抗凝血活性, 提示其结构新颖, 作用机制独特。SLP对TT和PT的影响不明显, 表明SLP对凝血酶活性和外源性凝血途径的影响较小。这提示SLP主要通过影响内源性凝血途径发挥抗凝作用, 其作用机制可能与肝素等抗凝药物不同[47]。海参多糖主要由葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖组成, 其中有着大量的硫酸根修饰的岩藻糖基, 是其抗凝血功效的主要来源[48]。相比之下, SLP其独特的单糖组成和空间结构很可能影响凝血因子的结合和活化过程, SLP含有较多核糖成分, 有可能通过影响凝血因子水平或血小板功能等多靶点发挥作用。因此, 深入研究SLP的抗凝作用机制和构效关系, 并采用化学修饰等手段对其结构进行改造, 对于开发新型海洋抗凝药物具有重要意义。总之, 本研究首次证实了方格星虫多糖SLP的抗凝血活性, 丰富了海洋动物来源的新型抗凝活性多糖的种类, 但其体内/外抗凝作用机制还有待进一步研究。
4 结论本文依次采用水提法、酶解法、乙醇沉淀和离子交换层析等方法, 从方格星虫体壁中分离纯化了一种水溶性多糖SLP, 其提取产率为5.76%, 分子量约9.62 kDa, 主要由Man、Rib、Gal和Glc以1∶2.83∶5.34∶6.95的物质的量比组成。结构分析表明, SLP主要以α糖苷键连接, 含有氨基和羟基, 但硫酸基浓度较低, 具有规则的片层状结构。SLP具有一定的抗凝血活性, 主要表现为对APTT的延长作用, 在200~400 µg/mL浓度范围内呈剂量依赖性, 但高浓度下出现活性饱和效应, 抗凝效果总体低于硫酸软骨素和海参多糖等硫酸化多糖。其抗凝活性较低与其低硫酸基浓度有关, 但SLP的化学组成和空间结构也暗示了其独特的抗凝血作用方式和机制。本研究优化了方格星虫多糖的分离纯化方法、明确了其化学结构和抗凝活性, 为开发新型海洋抗凝药物提供了理论支持与实验依据。考虑到SLP的得率高、成本低、毒性小等优点, 今后可采用化学修饰等手段进一步提高其抗凝活性, 并探索其与其他抗凝药物的联用效果, 以期开发出疗效更佳、毒副作用更小的复方制剂。总之, 本研究为开发方格星虫多糖的药用价值提供了新思路, 对拓宽海洋药物资源、丰富海洋药物品种具有重要意义。
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