2024, Vol. 48
文章信息
- 于海洋, 孟杰, 许飞. 2024.
- YU Haiyang, MENG Jie, XU Fei. 2024.
- 海浪胁迫对单体牡蛎脂质代谢的影响
- Mechanical stress from waves affects lipid metabolism in clutchless oysters
- 海洋科学, 48(12): 94-101
- Marine Sciences, 48(12): 94-101.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240311002
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文章历史
- 收稿日期：2024-03-11
- 修回日期：2024-09-09
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 山东省牡蛎种业技术创新中心, 山东 青岛 266105
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Shandong Technology Innovation Center of Oyster Seed Industry, Qingdao 266105, China
牡蛎是营固着生活的双壳贝类, 多分布于亚热带和温带海域, 其中长牡蛎(Crassostrea gigas)是中国黄渤海地区的常见物种, 具有重要的生态意义和经济价值[1]。由于其对环境的适应力强、生长速度快, 20世纪被引入欧洲、美洲、澳大利亚等地进行养殖[2-3]。牡蛎的生长依赖于它们与环境之间的稳定关系, 这种对外部环境的依赖性使牡蛎极易受到环境波动的影响。潮间带和浅海区养殖经常会遭遇极端天气事件[4-5], 尤其是在夏季, 高密度养殖的牡蛎面临更多的环境压力, 即使环境稍有震荡, 也可能造成剧烈的生理功能变化, 对养殖业造成巨大的经济损失。目前温度、盐度、溶氧以及病原等常见的水产养殖应激源已经有大量研究报道[6-10]。然而由海浪造成的物理震荡应激鲜被关注。一些研究表明, 机械搅拌和震动对贝类免疫监视、细胞吞噬和酚氧化酶活性等生理活动具有显著影响[10-11], 贻贝受到震荡胁迫后呼吸爆发活力显著降低[7], 蛤类受到机械搅拌后血细胞活性降低[10]。
肥满度是牡蛎的重要经济性状, 但是养殖过程中经常出现肥满度突然降低的现象, 造成无法准确把握采收时期, 对养殖企业的生产造成显著影响。这种情况的发生多出现在大型海浪过后, 推测可能与养殖模式造成的震荡胁迫有关。扇贝具有附着习性, 可以自由游泳, 软体部构造更加适应运动造成的晃动,比如粗壮的闭壳肌以及更加紧凑的内脏结构。而牡蛎为了适应固着生活方式, 演化出了相应的软体部构造, 肥大的内脏团承载着消化、分泌、免疫、繁殖等诸多生物学功能[12-13]。然而两者的养殖方式几乎相同, 养殖企业多采用扇贝养殖笼吊养牡蛎, 且普遍发现三倍体牡蛎的肥满度受到风浪的显著影响。这种养殖方式不符合牡蛎固着生活的生物学习性, 使牡蛎暴露在长期的震荡环境, 可能会影响牡蛎进食等行为, 对其软体部造成机械损伤。然而吊笼养殖方式对于牡蛎的影响机制尚无确切的数据支撑。本研究采用模拟海浪震荡的方式处理单体三倍体长牡蛎, 采用代谢组学方法对单体长牡蛎的血清进行研究, 比较了模拟海浪震荡后不同时间点的代谢物差异, 以期为解析牡蛎受风浪震荡影响的应激调控机制提供数据支持。
1 材料与方法 1.1 实验动物处理及取样实验用单体牡蛎为课题组在烟台牡蛎养殖场培育的三倍体长牡蛎, 平均壳高约16 cm, 在温度(20±0.5) ℃、盐度30±1的海水中饲养一周, 每天换水、清除粪便, 并投喂足量小球藻。海浪冲击模拟实验设备为贝类附着基清洗装置, 实验装置水容量为4 m³, 投放牡蛎密度为40只/m³, 海水拨动板的震荡频率约为2次/s, 振幅约为30 cm, 形成的海水波浪能够造成牡蛎个体在水中持续翻转, 整个实验期间水温控制在20 ℃左右。震荡处理6 h后(6 h组)随机选取24只进行血清取样, 由心脏处抽取血液, 在4 ℃下以900 r/min的速度离心, 吸取上清100 μL, 每3只混合为一个样本液氮冻存, 共计8个生物学重复。其余个体放入砂滤海水中静置暂养, 分别于震荡后6 h(12 h组)和18 h(24 h组)再各随机选取24只进行血清取样。同时在未进行震荡处理的牡蛎中选取24只取样作为空白对照组(Ctrl组)。所有样本收集齐后, 转移至−80 ℃冰箱中冻存。
1.2 代谢物提取将样本从−80 ℃冰箱中取出后置于冰上解冻(后续操作均在冰上进行), 涡旋10 s混匀。吸取50 μL样本到新离心管中, 加入20 %乙腈甲醇内标提取液300 μL, 涡旋3 min混匀。在4 ℃条件下, 12 000 r/min离心10 min, 取上清液200 μL到新离心管中, −20 ℃冰箱中静置30 min。在4 ℃条件下, 12 000 r/min离心3 min, 移取上清液180 μL到对应进样瓶内衬管中, 用于上机分析。
1.3 液相色谱质谱分析参考之前报道的方法开展代谢物鉴定, 简述如下: 采用UHPLC体系(1290, Agilent Technologies)进行液相色谱分析, 色谱柱为Waters ACQUITY Premier HSS T3 Column(1.8 µm, 2.1 mm×100 mm), 耦合TripleTOF 6600 (Q-TOF, AB Sciex)系统。流动相A: 0.1%甲酸/水; 流动相B: 0.1%甲酸/乙腈, 仪器柱温: 40 ℃; 流速: 0.4 mL/min; 进样量: 4 μL。洗脱梯度为: 2 min内流动相B由5%递增至20%, 随后在3 min内递增到60%, 然后在1 min内递增到99%并维持1.5 min, 随后在0.1 min内快速降低至5%并维持2.4 min。
质谱数据用Analyst TF 1.7.1软件(Sciex, Concord, ON, Canada)采用信息依赖性采集模式(IDA)进行采集。电喷雾电离(ESI)源条件设置为: 离子源气体1和2(GAS1、GAS2)均为345 kPa, 气帘气(CUR)为172 kPa, 离子源温度(TEM)为550 ℃, 去簇电压(DP)为60 V(正离子模式)或−60 V(负离子模式), 离子喷雾电压浮动(ISVF) 5 000 V (正离子模式)或−4 000 V (负离子模式)。飞行时间质谱扫描参数设置为: 质量范围为50~1 000 Da, 累积时间为200 ms, 开启动态背景扣除(DBS)。子离子扫描参数设置为: 质量范围为25~1 000 Da, 累积时间为40 ms, 碰撞能量30 V (正离子模式)或−30 V(负离子模式), collision碰撞能量变化范围为15, 分辨率为UNIT, 强度为100 s–1, 同位素排除4 Da, 质量偏差50×10−6, 每个循环最大候选离子数为18。
1.4 数据预处理质谱下机原始数据经过ProteoWizard转换为mzXML格式, 采用XCMS程序进行峰提取和对齐, 保留时间校正。采用“SVR”方法对峰面积进行校正, 并对各组样本中缺失率大于50%的峰进行过滤。校正筛选后的峰, 通过检索自建数据库、整合公共库、AI预测库以及metDNA方法得到代谢物鉴定信息。
1.5 数据分析采用正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)的正交投影法对代谢物含量进行分析。通过主成分分析(PCA)表征各组样本之间的总体代谢差异和组内样本之间的变异度大小。通过OPLS-DA模型对每个代谢产物给予VIP值, 以表达其对模型构建的贡献程度。各组间差异代谢物(DEMs)筛选标准为VIP > 1, P (Student’s t-test) < 0.05。
差异代谢物的检索数据库为KEGG数据库, 差异丰度得分(differential abundance score, DA Score)的计算公式为(nu-nd)/n, 其中nu为该通路上调差异代谢物数量, nd为该通路下调差异代谢物数量, n为注释到该通路的所有代谢物数量。通过min-max算法对代谢物在不同样品中的相对丰度进行[0, 1]归一化, 通过R软件的pheatmap包绘制热图, 反映各代谢物的动态变化情况。通过ggplot2包绘制箱线图, 对某一类别下的所有代谢物进行统计, 以反映某一类别代谢物的总体丰度变化趋势。
2 结果与分析 2.1 样本差异性分析各组样品的主成分分析结果表明, 一个特征向量(PC1)即可以将不同实验组样品进行较好的区分, 且组内的聚集性和重复性较好(图 1), 表明牡蛎经过波浪冲击后, 血液代谢物组分发生了明显的变化, 震荡对牡蛎的生理具有显著影响。
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| 图 1 主成分分析结果 Fig. 1 Principal component analysis 注: QC为质量控制样本, Ctrl为对照组, 6 h, 12 h, 24 h分别对应实验处理组6 h, 12 h和24 h |
基于非靶向代谢组技术, 在4组共32个样品血清样本中共计鉴定到2 770个代谢物, 各组间存在含量差异的代谢物1 380个, 其中1 133个在实验组与对照组之间存在差异, 在6 h、12 h、24 h组分别鉴定到652个、783个和916个与对照组存在显著差异的代谢物(图 2)。维恩分析表明, 3个实验组之间的共有差异代谢物占比最大(39.5%), 震荡结束后6 h(12 h组)和18 h (24 h组)依然能够鉴定到大量差异代谢物, 其中223个(20.0%)为两组共有, 199个为24 h组特有(17.6%)。
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| 图 2 三个实验组相对于对照组的差异代谢物(DEM)韦恩图 Fig. 2 Venn diagram of the differential metabolites of the three experimental groups relative to the control group |
通过对差异代谢物进行KEGG通路分析(图 3), 发现差异代谢物主要在甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢等通路富集。一些通路上的差异代谢产物有时序变化。比如鞘脂类代谢(Sphingolipid metabolism)在震荡6 h后发生了整体上调, 随后逐渐下降(接近于DA值的0点)。戊糖和葡萄糖醛酸相互转化通路(Pentose and glucuronate interconversions)在3组样品中均为下调, 差异性统计(P值)随着时间增加而变化, 在24 h组中具有显著性(P=0.025)。
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| 图 3 KEGG通路差异丰度得分分析 Fig. 3 Differential abundance score analysis of KEGG pathway 注: 横坐标表示差异丰度得分(DA Score)。图中线段的长度为DA Score的绝对值, 线段端点的圆点大小表示该通路中差异代谢物的个数, 圆点分布在中轴左侧且线段越长, 表示该通路整体表达情况越倾向于下调, 圆点分布在中轴右侧且线段越长, 表示该通路整体表达情况越倾向于上调, 圆点越大表示代谢物数目越多 |
根据KEGG富集结果, 重点分析了脂肪主要组成成分甘油酯(GL)、甘油磷脂(GP)和鞘脂类(SP)的代谢动态变化情况。甘油三酯在震荡后整体存在下降趋势(图 4a和b), 甘油二酯(图 4c和d)、单甘油酯(图 4e和f)和脂肪酸(图 4g和h)的相对含量存在上升趋势, 所有检测到的甘油单酯物质在12 h和24 h组的相对含量均发生了显著上调。
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| 图 4 甘油脂类及游离脂肪酸定量结果 Fig. 4 Quantitative analysis of glycerides and free fatty acids 注: *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001, ****表示P < 0.000 1 |
甘油磷脂也具有类似的趋势(图 5), 即简单形式的磷脂酸或去除一分子脂肪酸的溶血磷脂的含量显著升高, C-3位与磷酸相连的取代基为胆碱、肌醇、丝氨酸、乙醇胺等复杂形式的甘油磷脂总体含量降低。连接基团较多的鞘磷脂类在6 h和12 h组有显著上升, 但在24 h组恢复至对照组水平, 神经酰胺类有较显著的升高, 而基本骨架鞘氨醇含量显著升高(图 6)。
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| 图 5 甘油磷脂类分子在不同样品中的定量结果 Fig. 5 Quantitative analysis of glycerophospholipids 注: *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001, ****表示P < 0.0001 |
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| 图 6 鞘氨醇类定量结果 Fig. 6 Quantitative analysis of sphingolipids 注: *表示P < 0.05, **表示P < 0.01, ***表示P < 0.001 |
一些脂类参与合成的生物活性代谢产物发生了显著上调, 其中亚油醇乙醇胺(N-linoleoylethanolamine, LEA)、N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(N-retinylidene-N- retinylethanolamine, A2E)等发生了大幅上调(图 7)。
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| 图 7 亚油醇乙醇胺和N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺相对含量变化趋势 Fig. 7 Relative contents of N-linoleoylethanolamine and N-retinoid-N-retinaldehydeethanolamine 注: p.adj表示通过Holm方法进行多重检验校正后的P值 |
为了维持生理稳态, 生物体需要激活各种代谢途径以应对环境压力, 如大西洋鲑鱼在受到渗透压变化和海洋洄游后显示出减少脂质合成和增加脂质分解等脂质代谢相关功能的变化[14], 并且演化出生产内源性长链多不饱和脂肪酸的能力, 这种能力是通过增加亚油酸和亚麻酸来实现的[15]。本研究中, 甘油三酯在震荡后整体呈现下降趋势, 甘油二酯、甘油单酯和游离脂肪酸的相对含量上升, 所有检测到的单甘油酯物质在12 h和24 h组的相对含量均发生了显著上调。表明牡蛎受到震荡后, 牡蛎机体可能出现大量的能量需求, 甘油酯可能发生了经由甘油三酯到游离脂肪酸的水解反应。
脂质在生物膜修复等生物过程中发挥着功能性和结构性作用, 因此当生物面对环境压力时脂质在调控细胞稳态过程中发挥重要作用[16]。甘油磷脂是构成生物膜的基本物质, 在细胞信号和能量储存等方面也具有重要作用[17]。长牡蛎的主要营养物质中, 蛋白质约占39.1%~ 53.1%, 糖原21.6%~38.9%, 脂肪7.8%~8.7%[18], 其血细胞细胞膜中磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)是磷脂的主要组成成分, 各约占总磷脂的35%和33%[19], 磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)含量较低, 各约占总磷脂的6%和3%[19]。在本研究发现, PC和PE出现了显著降低, 而脱去C-3位与磷酸相连的取代基的磷脂酸显著升高(图 5), 可能与组织受损, 细胞膜发生水解有关[20]。在24 h实验组中脱去一个脂肪酸的溶血磷脂显著升高, 表明磷脂酸发生了磷脂1位或2位酯键水解, 可能用于能量代谢。此外, PE代谢产生的甘油二脂、脂肪酸和磷脂酸在许多细胞通路中充当第二信使。震荡后牡蛎体内PE和PS的含量变化可能会导致细胞功能和稳态受损。已有研究表明, 在哺乳动物线粒体中, PE缺乏会损害电子传递链蛋白的活性, 从而损害线粒体功能, 进而引起心血管疾病、神经变性等疾病的发生和发展[21-23]。同时, 脂质代谢会对细胞的机械应激产生反应。细胞膜脂质双层结构的组成会影响脂筏、小窝等功能性微观构造的形成。这些微观构造能够缓冲细胞膜受到的机械应力, 并在调节成纤维细胞与细胞外基质力学性能之间的通讯中起到重要作用, 而脂质代谢过程的及时调整则能够保证这些微观功能小体的产生和募集[24]。
鞘脂也是生物膜结构的重要组成部分, 在维持细胞屏障功能和流动性等方面具有重要作用, 鞘脂代谢产物还是参与细胞生长、分化、衰老和程序性死亡调控的重要分子[25-26]。鞘脂代谢是细胞代谢的一种形式, 其产物为神经酰胺、鞘氨醇(SPH)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P), 它们在体内的总体水平趋于相对平衡。本研究发现, 震荡处理后神经酰胺和鞘氨醇水平增加, 推测与细胞膜的破裂有关。贝类等海洋无脊椎动物的鞘磷脂组成与脊椎动物有较大差异, 比如神经酰胺氨乙基磷酸(ceramide aminoethylphosphonate, CAEP)在长牡蛎血细胞的细胞膜中约占磷脂类的15%[19], 可能是用于替代脊椎动物细胞膜中常见的鞘磷脂成分。由于实验方法的局限, 本研究无法分析CAEP的变化, 不能评估鞘脂类的总体变化情况。不过在已分析的三类鞘磷脂物质中, 鞘氨醇的升高幅度和显著性最强, 可能是由于细胞膜受损后, 鞘脂代谢产生鞘氨醇的速率加快。神经酰胺的生物合成是大多数复杂鞘脂的前体, 在细胞分化、增殖、凋亡和衰老等生命活动的调控中具有重要作用, 不仅是鞘脂代谢通路中的第二信使分子, 还参与炎症反应、鞘脂代谢损伤和细胞凋亡, 被认为是诱导细胞凋亡的重要细胞信号[27]。之后, 神经酰胺通过神经酰胺转运蛋白(CERT)或囊泡转运蛋白被送往高尔基体, 在那里产生复杂的鞘磷脂(如鞘磷脂、神经节苷脂或1-磷酸神经酰胺[28])。鞘磷脂是细胞膜的组成成分, 参与细胞膜破损的修复过程。在细胞膜中, 鞘磷脂可转化为鞘氨醇, 后者也是细胞膜的成分之一。鞘氨醇可被鞘磷脂激酶2(SPHK2)磷酸化, 生成鞘氨醇1-磷酸(S1P), 这是一种具有生物活性的脂质介质, 可作为细胞信号分子调控多种生物过程, 包括细胞存活、增殖和运动, 有研究表明, 细胞核和线粒体中的鞘氨醇1-磷酸(S1P)可控制表观遗传学关键基因的转录[29]。另外, 神经酰胺酶产生的鞘氨醇可重新酰化生成神经酰胺。在我们的实验中, 对照组、处理6 h组、处理12 h组和处理24 h组的鞘磷脂含量先升高后降低, 这可能反映了牡蛎细胞损伤修复以及内环境恢复平衡的过程。
在相对含量变化幅度较大的物质中, 发现一些具有重要活性的生物因子属于脂质代谢过程的产物, 如亚油醇乙醇胺(LEA)和N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E), 上调幅度分别达到10倍和5倍。LEA是一种内源性信号分子, 在细胞和组织中表现出多种生物学活性。在哺乳动物中具有镇定安神的作用, 能够激活相应的核受体抑制动物食物摄入, 从而促使动物进行脂质代谢[30]。N-视黄醛-甘油磷脂酰乙醇胺(PE)会与2个全反式视黄醇分子发生反应, 形成细胞毒性化合物A2E, A2E诱导氧化应激反应, 导致IL-6和IL-1信号通路介导的慢性炎症级联反应的激活。两类物质对牡蛎的生理效应尚不可知, 但参考它们在其他动物中的生理功能, 则震荡后LEA的升高可能是牡蛎为了应对海浪造成的刺激, 而副作用则是抑制了食物摄入并加速体内营养物质的分解。A2E含量的大幅升高则可能会造成牡蛎体内的氧化应激反应和炎症反应的激活。
4 结论本研究基于非靶向代谢组学, 比较了震荡胁迫下不同时间点牡蛎的代谢情况, 通过脂质代谢的变化推测了牡蛎在受到剧烈震荡后的生理生化变化过程, 发现参与甘油磷脂代谢、甘油酯水解和鞘脂代谢的一些代谢物发生了较大变化, 这些代谢的异常变化会导致牡蛎机体发生各种生理生化反应。这些发现证实了在海浪胁迫下牡蛎机体会受到显著影响, 为进一步探索牡蛎肥满度剧烈变化过程的机制提供了一定见解。研究结果还需要通过其他倍性牡蛎在生理生化、分子生物学等层面更为深入的验证和解析。
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