甲藻孢囊是指浮游甲藻失去鞭毛和游动能力后形成的不动细胞, 是甲藻度过不良环境条件的休眠方式^[1-2]。大约有200多种甲藻在其生活史中的某个阶段会形成孢囊, 并长期保存在海洋沉积物中^[3]。在环境适宜条件下, 孢囊可以大量萌发形成浮游细胞, 进入上层水体; 如果孢囊的数量较多, 还有可能成为有害藻华的“种源”, 引发赤潮灾害^[3-4]。因此, 海洋沉积物中甲藻孢囊的多样性与数量分布, 是有害藻华监测的重要内容之一。

甲藻孢囊在我国近岸海域沉积物中的分布特征得到广泛研究, 包括渤海^[5-7]、黄海^[8-10]、东海^[11-12]和南海海域^[13-14]。许多研究表明, 沉积物中甲藻孢囊的种类组成及其分布与水体和沉积物的理化环境密切相关^[15-16], 主要取决于盐度、温度、营养盐、沉积物类型等环境因子^[17-18]。因此, 孢囊的物种组成和丰度分布不仅可以反映水体中甲藻的地理分布特征, 还可以在一定程度上反映相关水域的环境质量状况^[19]。

目前, 国际上关于河口潮间带甲藻孢囊的报道尚不多见, 这与河口潮间带的自然属性不利于孢囊的保存有关。河口潮间带位于陆、海交界处, 受河流输入、潮汐、海浪冲刷等多种动力因素影响, 不易保存来自海洋的甲藻孢囊; 此外, 受潮汐作用的影响, 潮间带经常暴露出水面, 而孢囊形成需要一定的时间, 故在原位形成孢囊较难。我国海岸带拥有众多的河口潮滩, 受养殖等生产活动影响, 环境质量下降, 生态系统退化。基于该背景, 本文对我国典型河口潮间带(如辽宁大辽河口、天津涧河口、山东黄河口、上海崇明长江口、福建闽江口和九龙江口)的沉积物展开调查, 发现辽宁大辽河口、天津涧河口、福建闽江口与九龙江口潮间带存在丰富的甲藻孢囊。本文首次报道了中国河口潮间带甲藻孢囊多样性, 并根据甲藻孢囊的季节变化特征与环境因子的关系, 做了初步分析。研究结果对于了解我国河口潮间带甲藻孢囊多样性以及形成机制具有重要参考价值。

1 材料和方法 1.1 研究区域与样品采集

辽宁大辽河口和天津涧河口位于渤海沿岸, 福建闽江口和九龙江口位于东海沿岸(图 1), 分别受到温带与亚热带海洋性季风气候的影响, 四个河口潮间带的基本环境概况如表 1所示。大辽河口与涧河口的年平均温度与降水量明显低于闽江口与九龙江口; 此外, 大辽河口与涧河口的潮差明显小于闽江口与九龙江口。四个河口潮间带的沉积物类型存在明显差异, 大辽河口的沉积物类型为粉砂质淤泥, 涧河口和九龙江口为淤泥质, 而闽江口为粉砂质砂(表 1)。四个河口区都有不同程度的滩涂或者池塘养殖, 养殖品种有差异(表 1)。

分别于2014年9—12月(秋), 2015年4—5月(春)和6—9月(夏), 2016年1—3月(冬)开展了4个季度的样品采集工作(图 1)。在每个采样站位的高、中、低三个潮区, 分别采集间隙水水样和0~2 cm的表层沉积物样, 并现场测定上覆海水的温度、盐度等环境指标。间隙水用塑料针管采集, 经0.45 μm的醋酸纤维膜过滤后保存于–20 ℃冰柜中, 用于总溶解态氮营养盐(total dissolved nitrogen, TDN)浓度的测定。表层沉积物用开口直径为3 cm的塑料注射器进行采样, 装入洁净的自封袋中保存于–20 ℃冰柜中, 用于甲藻孢囊的提取鉴定和粒度分析。

1.2 甲藻孢囊的提取、观察及数据处理

甲藻孢囊的提取采用Bolch^[22]的方法, 经过“超声-过筛-重液浮选-离心”步骤, 去除沉积物中的其他组分, 将甲藻孢囊从沉积物中提取出来。具体提取流程如下: (1)称取3 g湿重沉积物两份, 一份用于烘干测含水率以用于后续计算, 另一份用于孢囊的提取。(2)加过滤海水到称重后的沉积物湿样中, 搅拌均匀, 在超声清洗器中超声1~5 min。(3)将超声处理后的样品进行过筛处理。孔径120 μm的粗筛置于10 μm的细筛上面, 进行叠层过筛, 用少量过滤海水进行多次润洗, 至过筛后流出来的水较清, 收集细筛上的溶液至烧杯中, 定容11~13 mL。(4)取2 mL 1.40 g/cm³的多钨酸钠溶液到塑料离心管中, 然后缓慢加入烧杯中收集的溶液, 尽量避免两溶液的混合。(5)离心: 在3 000 r/min的转速下离心10 min, 离心后吸取离心管中间5 mL的溶液到另一离心管中, 加海水至15 mL; 将第二根离心管在2 000 r/min的转速下离心10 min, 离心后吸走上清液, 留底层2 mL溶液用于镜检。

甲藻孢囊分析鉴定时, 吸取0.02~0.10 mL已处理样品至浮游植物计数框(HYDRO-BIOS, 德国)中并加入适量的蒸馏水稀释, 然后在400倍倒置显微镜(Olympus IX81)下进行种类鉴定、计数并拍照。孢囊的种类鉴定主要参考Matsuoka等^[3]、王朝晖^[2]、蓝东兆等^[23]、Mudie等^[24]资料。

孢囊的丰度表达为每克干重沉积物中所含有的孢囊数(单位: cysts/g DW, DW指干质量)。参照Cho等^[25]的公式计算获得:

$ C = \frac{{N \times {V \mathord{\left/ {\vphantom {V Q}} \right. } Q}}}{{{W \mathord{\left/ {\vphantom {W {\left( {1 - R} \right)}}} \right. } {\left( {1 - R} \right)}}}}, $

(1)

式中, C: 沉积物中孢囊丰度(cysts/g DW); N: 显微镜下观察得到的孢囊数量; V: 沉积物样品处理后的定容体积(mL); Q: 显微观察体积(mL); W: 处理分析沉积物的湿质量(g); R: 沉积物的含水率。

基于样品中统计的孢囊总数, 计算样品中每个种类的相对丰度(P), 以各种类的百分比表示。其中, 相对丰度 > 2%的物种为优势种。

$ P = \frac{{{N_i}}}{N} \times 100\% , $

(2)

其中, N_i: 样品中物种i的绝对丰度; N: 样品中全部孢囊物种丰度之和。

甲藻孢囊的物种多样性特征利用香农–威纳指数(H′)^[26]进行分析, 计算公式如下:

$ H' = - \sum\limits_{i = 1}^s {{P_i}} \times {\log _2}{P_i} , $

(3)

S: 总孢囊种类数; P_i: 样品中某种孢囊的比例。

1.3 间隙水营养盐浓度和沉积物粒度的测定

间隙水中营养盐浓度的测定: 根据《中华人民共和国国家标准海洋调查规范第4部分: 海水化学要素调查》(GB/T 12763.4—2007)规定的海水营养盐测定方法, 使用AA3营养盐自动分析仪(Bran-Luebbe, 德国)进行测定。硝酸氮(NO₃^–-N)采用铜-镉还原后, 再用盐酸-萘乙二胺比色法测定; 亚硝酸氮(NO₂^–-N)采用盐酸-萘乙二胺比色法测定; 氨氮(NH₄⁺-N)采用水杨酸钠法测定。溶解无机氮(dissolved inorganic nitrogen, DIN)为硝酸氮(NO₃^–-N)、亚硝酸氮(NO₂^–-N)和氨氮(NH₄⁺-N)浓度之和。总溶解态氮(TDN)是将样品中的可溶性有机氮氧化为硝酸盐后, 被镉柱还原为亚硝酸盐, 采用重氮-偶氮显色法测定。溶解态磷酸盐(PO₄^3–-P)采用磷钼蓝法测定。

粒度的测定: 将沉积物样品冷冻干燥后, 称取0.1 g样品于烧杯中, 加入10 mL 10%的过氧化氢充分反应以去除有机质, 静置24 h后去除上清液, 再加入10 mL 10%的稀盐酸去除无机碳酸盐, 反应24 h后, 去除上清液并水洗去除残余盐酸后加入10 mL 0.5 mol/L的分散剂六偏磷酸钠, 并在超声清洗器中超声10 min, 使其充分分散。最后用Malvern Mastersizer 2000F激光粒度分析仪测定沉积物粒度, 沉积物粒度结果按照Folk命名法^[27]进行分类。

1.4 数据来源及统计分析

温度和降水量数据来源于国家气象信息中心-中国气象数据网(https://data.cma.cn)^[28]; 潮差数据来源于全球潮汐预报服务平台(https://global-tide.nmdis.org.cn)^[29]。孢囊丰度和物种多样性与环境因子之间的相关性使用软件SPSS 22(Statistical Product and Service Solutions)分析。

2 结果 2.1 环境因子的基本特征

受地理位置影响, 大辽河口和涧河口冬季温度与春夏季降水量显著低于闽江口与九龙江口, 但盐度明显高于闽江口与九龙江口(表 2)。与以往历史调查结果一致^[30-31], 四个河口的沉积物类型存在明显差异, 大辽河口的沉积物类型为粉砂质淤泥, 涧河口和九龙江口为淤泥质, 而闽江口为粉砂质砂(表 2)。大辽河口和涧河口间隙水中的TDN浓度明显高于闽江口和九龙江口, 尤其在春夏季节(表 2)。

2.2 孢囊组成特征

4个调查区域共发现甲藻孢囊43种(属于16属)和未定种5种(表 3、附图 1), 其中, 膝沟藻类(Gon­yaulacoid group)17种、裸甲藻类(Gymnodinioid group)2种、原多甲藻类(Protoperidinioid group)24种, 包括我国沿海未报道的3个新记录种, 分别为孟迪原多甲藻(Protoperidinium mendiolae), 脆弱海胆藻(Echinidinium delicatum)和透明海胆藻(E. transparantum)。从营养类型来看, 异养型种类(26种)多于自养型种类(17种)。

4个河口的孢囊多样性存在差异: 大辽河口、涧河口、闽江口、九龙江口分别鉴定出30种、26种、21种和24种, 其中, 孟迪原多甲藻仅出现在闽江口潮间带, 脆弱海胆藻仅出现在大辽河口和涧河口, 而透明海胆藻仅出现在九龙江口。调查期间, 发现了一种产麻痹性贝毒的塔玛亚历山大藻复合体(Alexandrium tamarense complex), 出现在涧河口和九龙江口。此外, 还发现3种产虾夷扇贝毒素的甲藻孢囊, 分别为网纹原角藻(Protoceratium reticulatum)、多边舌甲藻(Lingulodinium polyedrum)和具刺膝沟藻(Gonyaulax spinifera)。网纹原角藻孢囊分布在大辽河口和涧河口, 多边舌甲藻孢囊分布在大辽河口、涧河口和九龙江口, 而具刺膝沟藻孢囊在4个河口潮间带均有分布。

2.3 甲藻孢囊群落结构时空变化特征

4个河口表层沉积物中的孢囊丰度和多样性存在较大差异(图 2)。大辽河口的孢囊丰度最高, 变化范围为47~94 cysts/g DW, 平均值为69 cysts/g DW; 其次为涧河口, 孢囊丰度变化范围为24~75 cysts/g DW, 平均值为49 cysts/g DW[图 2(a)]。闽江口和九龙江口的孢囊丰度相对较低, 变化范围分别为14~50 cysts/g DW和5~50 cysts/g DW, 平均值分别为26 cysts/g DW与23 cysts/g DW[图 2(a)]。大辽河口、涧河口、九龙江口的孢囊峰值多出现在春夏两季, 秋季最低; 但闽江口的孢囊峰值出现在秋季。

4个河口表层沉积物中的孢囊丰度在不同的潮位存在较大差异(图 3)。大辽河口和闽江口的孢囊丰度变化较大, 变化范围分别为33~116 cysts/g DW和2~58 cysts/g DW, 其中, 大辽河口在低潮位孢囊丰度最高, 闽江口在高潮位孢囊丰度最高; 涧河口和九龙江口的孢囊丰度变化较小, 变化范围分别为46~51 cysts/g DW和13~27 cysts/g DW, 在低潮位孢囊丰度较高。

大辽河口与涧河口孢囊的多样性指数较高, 平均值分别为2.61与2.81[图 2(b)]。大辽河口以异养型孢囊为主, 优势物种包括微小原多甲藻(Protoperi­dinium minutum)、安倍原多甲藻(P. abei)、小齿原多甲藻(P. denticulatum)、长形原多甲藻(P. oblongum), 其中, 微小原多甲藻在四个季节均占主要优势[图 4(a)]。涧河口则以自养型孢囊为主, 包括李氏亚历山大藻(Alexandrium leei)、墨西哥易碎藻(Fragilidium mexicanum)、具刺膝沟藻、网纹原角藻, 其中, 墨西哥易碎藻在四个季节均占主要优势[图 4(b)]。

闽江口和九龙江口孢囊的多样性指数较低, 平均值分别为0.81与1.80[图 2(b)]。闽江口优势种较为单一, 春、秋季无明显优势种, 夏季以异养型孢囊长形原多甲藻和里昂原多甲藻为主, 冬季以自养型孢囊墨西哥易碎藻和异养型孢囊小齿原多甲藻为主[图 4(c)]。九龙江口以异养型孢囊为主, 包括小齿原多甲藻、长形原多甲藻、窄角原多甲藻(P. claudicans)、锥形原多甲藻(P. conicum)[图 4(d)]。

2.4 甲藻孢囊群落变化的环境相关性分析

孢囊总丰度、自养型孢囊丰度、异养型孢囊丰度、多样性指数与温度、降水量、盐度、潮差、沉积物粒度(< 63 μm)、TDN、DIN、NO₂^–-N、NH₄⁺-N、NO₃^–-N、PO₄^3–-P的相关性分析表明, 孢囊总丰度与盐度、TDN、DIN、NH₄⁺-N呈显著正相关, 与潮差呈显著负相关。自养型孢囊丰度与盐度、TDN、DIN、NH₄⁺-N、PO₄^3–-P呈显著正相关, 与降水量、潮差呈显著负相关; 而异养型孢囊丰度与环境因子相关性不显著。多样性指数(H′)与降水量、潮差呈显著负相关, 与盐度、沉积物粒度(< 63 μm)呈显著正相关(表 4)。

3 讨论

尽管甲藻孢囊可以随海流进行长距离搬运, 但由于河口位于河流入海处, 受海流、河流径流等动力因素的影响, 潮间带地区的泥沙经常发生扰动, 影响到孢囊的沉降与保存, 因此, 大多数的研究集中在近海海域, 关于河口潮间带孢囊的研究报道较少。目前, 我国渤海海域、闽江口海域甲藻孢囊的研究均有报道, 如王艳等^[6]在渤海发现32种孢囊, 平均丰度为58.8~103.6 cysts/g干质量。林元烧等^[32]、方琦等^[33-34]在闽江口附近海域、厦门湾开展了孢囊的调查研究, 发现10~17种孢囊, 丰度范围变化较大, 从0~138 cysts/g湿质量不等。本研究中大辽河口与涧河口的甲藻孢囊丰度明显高于闽江口与九龙江口。对不同潮位甲藻孢囊的丰度研究发现, 大辽河口和闽江口的孢囊丰度变化较大, 大辽河口在低潮位孢囊丰度最高, 闽江口在高潮位孢囊丰度最高, 这可能是因为闽江口属于强潮型河口^[43], 携带搬运孢囊的距离较远。涧河口和九龙江口的孢囊丰度变化较小, 总体来说, 在低潮位孢囊丰度较高, 部分解释了孢囊来源是海源输送的可能性。

尽管渤海海域常见的锥状斯氏藻、链状裸甲藻、前头斯氏藻孢囊在潮间带调查中没有发现, 但大辽河口和涧河口检测到的甲藻孢囊多样性与渤海的甲藻孢囊多样性存在一定相似性^[6]。如: 多边舌甲藻、网纹原角藻、墨西哥易碎藻、塔玛亚历山大藻、具刺膝沟藻、膜状膝沟藻、具指膝沟藻、分支原多甲藻、锥形原多甲藻、小齿原多甲藻、赛裸原多甲藻、微小原多甲藻等孢囊在渤海海域与潮间带均有分布。闽江口的优势种, 如: 墨西哥易碎藻、长形原多甲藻、里昂原多甲藻、小齿原多甲藻孢囊, 以及九龙江口的优势种, 如: 小齿原多甲藻、锥形原多甲藻孢囊在这两个河口邻近海域也均有报道^[32-34]。孢囊多样性的结果表明, 河口潮间带孢囊的来源与附近海域的孢囊在空间上有密切联系, 存在着海流长距离搬运孢囊的可能性。

本次调查中还发现了相邻海域未曾报道过的三个新记录种, 分别为孟迪原多甲藻、透明海胆藻和脆弱海胆藻孢囊。其中, 孟迪原多甲藻孢囊在秘鲁海岸

带曾有报道^[35], 本研究中出现在闽江口潮间带。透明海胆藻孢囊在大西洋西北部河口地区^[36]、墨西哥西南海岸^[37]、加利福尼亚海岸带^[36]曾有报道, 本研究中出现在九龙江口。脆弱海胆藻孢囊在墨西哥西南海岸带^[37]有过报道, 本研究中出现在大辽河口和涧河口。这些孢囊是否是原位形成的还有待于进一步调查研究。

甲藻孢囊的种类和丰度与水域环境密切相关, 已有研究表明温度、盐度、沉积物类型、营养盐、潮流等都可以影响孢囊的群落结构^{[16, 39]}。其中, 沉积物类型是较稳定的环境因子, 其粒径大小对甲藻孢囊的截留与保存起到关键作用, 较细小的沉积物粒径有利于甲藻孢囊的保存^[40-41]。石雅君等^[9]发现自养型甲藻孢囊和异养型甲藻孢囊对沉积物类型的敏感度存在差异, 异养型甲藻孢囊通常大于40 μm, 有的甚至达到60 μm, 而自养型甲藻孢囊通常小于40 μm, 更有利于黏合到沉积物中。本研究中, 自养型甲藻孢囊与沉积物粒度(< 63 μm)存在正相关关系, 进一步说明, 自养型甲藻孢囊对沉积物粒度的敏感度高于异养型甲藻孢囊。此外, 有研究表明, 甲藻孢囊丰度有随温度升高而下降、随盐度升高而升高的变化特征^[42], 这与本研究结果也是一致的。相关性分析表明, 甲藻孢囊与温度呈负相关(不显著), 与盐度呈显著正相关, 大辽河口和涧河口的温度要明显低于闽江口和九龙江口, 但盐度要明显高于闽江口和九龙江口, 部分解释其甲藻孢囊丰度较高的原因。闽江、九龙江径流量高于大辽河, 降水量也远高于大辽河口与涧河口, 且闽江口与九龙江口均属于强潮型河口^[43], 沉积物环境的不稳定性要高于大辽河口与涧河口, 这些动力因素的差异也会影响甲藻孢囊丰度。

Dale等^[44-45]指出富营养化可以增加沉积物中孢囊的丰度, 已有报道指出, 孢囊丰度尤其是自养型孢囊与DIN呈显著相关^[46], 本研究中孢囊的总丰度与自养型孢囊丰度与沉积物间隙水的TDN、DIN、NH₄⁺-N浓度呈显著正相关(表 4)。其中, NH₄⁺-N是各站位DIN的重要组成部分。此外, 自养型孢囊丰度与PO₄^3–-P呈显著正相关, 这与活性磷含量高的地方孢囊丰度高是相符的^[47]。调查区域的养殖活动以及污水排放, 是海水富营养化的主要来源。已有报道将一些自养型甲藻孢囊作为养殖和生活污水的指示物种^[48], 例如: 在深圳湾, 锥状斯氏藻被作为富营养化的指示孢囊^[47]。在本研究中, 优势物种网纹原角藻孢囊可以考虑作为大辽河口与涧河口的富营养化指示种。Zonneveld^[49]的研究证明网纹原角藻会在水温偏低且富营养的环境下出现较高值, Shin等^[50]的研究中也发现网纹原角藻的丰度的增加可以指示富营养化的加剧。同时, 异养型甲藻孢囊的比例增加也可以作为富营养化和工业污染的指示^[51], 在大辽河口和九龙江口, 微小原多甲藻和小齿原多甲藻的孢囊在四个季节均为优势种, 且占有较高比例, 可以作为富营养化的潜在指示种。

此外, 调查期间发现了一种产麻痹性贝毒的塔玛亚历山大藻复合体与3种产虾夷扇贝毒素的甲藻孢囊, 分别为网纹原角藻、多边舌甲藻和具刺膝沟藻。涧河口和九龙江口的有毒种塔玛亚历山大藻复合体的孢囊, 在邻近海域也有存在^{[6, 33]}, 这些孢囊很可能分别属于链状亚历山大藻和太平洋亚历山大藻^[52]。鉴于潮间带是贝类养殖的重要场所, 底泥中的有毒孢囊可能被贝类摄食并累积毒素, 后期应加强对这些有毒甲藻孢囊的监测。

综上所述, 河口潮间带甲藻孢囊的物种丰富度与数量虽然低于邻近海域, 但其存在数量不容忽视, 尤其是有毒孢囊的数量。潮间带孢囊的来源很可能以海源输送为主, 但存在原位形成的可能性, 其形成类群与机制值得后期进一步研究。

致谢: 感谢中国科学院烟台海岸带研究所王跃启、董志军等在野外采样中的帮助。