2024, Vol. 48
文章信息
- 涂康, 韩自强, 肖懿哲, 谢双如, 黄琼叶. 2024.
- TU Kang, HAN Ziqiang, XIAO Yizhe, XIE Shuangru, HUANG Qiongye. 2024.
- 温度与盐度对福建牡蛎与长牡蛎、熊本牡蛎、香港巨牡蛎种间杂交子代孵化及其早期生长成活的影响
- Effects of temperature and salinity on hatching, early growth, and survival of interspecific hybrid larvae between Crassostrea angulata and C. gigas, C. sikamea, and C. hongkongensis
- 海洋科学, 48(4): 53-62
- Marine Sciences, 48(4): 53-62.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20230915001
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文章历史
- 收稿日期：2023-09-15
- 修回日期：2023-11-14
2. 集美大学水产学院, 福建 厦门 361100
2. Fisheries College of JIMEI University, Xiamen 361100, China
牡蛎作为重要的海水养殖贝类, 为人类提供了丰富而优质的蛋白质。2022年我国牡蛎养殖产量达到619.9万吨, 占全国贝类养殖总产量的38.8%, 福建省牡蛎养殖产量212.7万吨, 位居全国第一[1]。全球共有100多种牡蛎, 中国沿海已发现并鉴定的有23种[2], 其中巨蛎属牡蛎(Crassostrea)占比最多。我国沿海巨蛎属牡蛎常见养殖种类有福建牡蛎(C. angulata)、长牡蛎(C. gigas)、熊本牡蛎(C. sikamea)、以及香港巨牡蛎(C. hongkongensis)。其中福建牡蛎主要分布于长江口以南浙江、福建、广东等地, 尤以福建最为常见, 属于当地优势种; 长牡蛎自然分布于长江口以北沿海地区, 与福建牡蛎互为近缘种[3]; 熊本牡蛎分布区与福建牡蛎多有重合, 主要分布于长江口以南到广西沿海等地, 其个体大小相较同时期福建牡蛎稍小; 香港巨牡蛎主要分布于福建南部以及两广沿海地区, 适应河口低盐环境[4]。
遗传学上将两个基因型不同的纯合子之间的交配称为杂交, 杂交育种是动植物进行种质改良的重要手段之一。杂交可以分为种内杂交和种间杂交, 种间杂交加大了物种间的基因交流, 在人为筛选作用下有一定概率促使后代产生积极的变异, 产生杂种优势, 常被用于水产动物遗传改良[5-6]。牡蛎可以人工解剖授精的繁殖特性, 更是为其杂交育种的运用提供了便利。目前虽然关于牡蛎种间杂交育种的报道很多, 但是多为两个物种间不同杂交与自交组合间的比较, 缺乏多个物种间杂交组合的横向比较。例如, 福建牡蛎与长牡蛎[7-8]熊本牡蛎[9-10]和香港巨牡蛎[11-12]均有种间杂交的报道, 但是福建牡蛎与哪种牡蛎杂交效果最优却无法判断, 限制了种间杂交在福建牡蛎苗种生产实际中的运用。
温度与盐度是影响海洋生物生长、存活与分布最重要的两个环境因子[13]。巨蛎属牡蛎对环境盐度与温度具有广泛的适应性[14], 但不同种之间的耐受性存在差异, 在浮游幼虫阶段表现得尤为明显[15]。因此, 本文研究了福建牡蛎与长牡蛎、熊本牡蛎、香港巨牡蛎种间杂交子代孵化和浮游幼虫阶段生长成活的温度盐度条件, 旨在筛选出适合福建牡蛎的种间杂交组合以及其生长与成活最适的盐度与温度条件, 为种间杂交在福建牡蛎育种中的应用提供实践方案与技术资料, 同时为研究巨蛎属牡蛎杂交子代育苗过程中对盐度与温度的需求提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 材料处理福建牡蛎取自福建莆田, 长牡蛎取自山东烟台, 熊本牡蛎取自江苏南通, 香港巨牡蛎取自广东饶平, 各种亲贝均是在远离牡蛎养殖区采集的野生群体, 采用CO1技术检测确定所有亲本均为纯种。2022年7月至2022年9月陆续从各地采集2龄亲贝转移到福建省中灵农业发展有限公司, 清除壳表附着物后在水泥池中进行性腺促熟, 期间每天投喂云微藻、扁藻及角毛藻的混合藻液, 每天换水50%。
2022年10月在亲贝性腺成熟后, 建立7种交配组合: 福建牡蛎♀×长牡蛎♂(AG)、长牡蛎♀×福建牡蛎♂(GA)、福建牡蛎♀×熊本牡蛎♂(AS)、熊本牡蛎♀×福建牡蛎♂(SA)、福建牡蛎♀×香港牡蛎♂(AH)、香港牡蛎♀×福建牡蛎♂(HA)、福建牡蛎♀×福建牡蛎♂(AA)。采用解剖方法分别获取精卵, 在海水中清洗后, 用300目洁净筛绢过滤杂质。卵子在海水中促熟0.5~1 h, 丢弃状态不好的卵子后, 加入适量精子, 在显微镜下观察, 确保每个卵子周围有7~10个精子。混合后的精卵轻轻搅拌, 直至全部卵子受精, 将受精卵置于圆柱形孵化桶内孵化, 孵化密度为20个/mL, 桶体积为600 L。至此, 共建立6个杂交实验组合及1个自交组合。实验发现杂交过程中AS、AH两组均无法正常受精, 出现配子不兼容现象, 因此这2个实验组无后续幼虫培育环节。
1.2 实验设计 1.2.1 盐度与温度对幼虫孵化的影响设置盐度梯度为15、20、25、30、35的海水孵化桶, 其中30为当地正常海水盐度, 低盐组用曝气1 d的自来水与砂滤后的海水按比例配置, 高盐组采用砂滤海水与海水晶按比例配置, 用高精度恒温加热棒控制水温为25±0.5 ℃。将不同杂交组合的受精卵分别置于不同盐度孵化桶中孵化, 孵化密度为15粒/mL, 每组3个重复。24 h后测算孵化率并开始选优。
设置温度梯度为15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的海水孵化桶, 使用高精度恒温加热棒控制水温。待水温达到目标温度且上下起伏不超过0.5 ℃后, 将受精卵分别置于不同温度孵化桶中孵化, HA组控制盐度为20, 其他组采用正常海水(盐度25), 孵化密度为15粒/mL, 每组3个重复。24 h后测算孵化率并开始选优。
1.2.2 盐度与温度对浮游幼虫生长的影响选优结束后, 设置4组水温23~25 ℃, 盐度梯度15、20、25、30、35的600 L白色塑料桶, 将不同组合D型幼虫各分为5个等分组, 分别转移至不同盐度梯度白桶中培育; 同时设置3组盐度25, 1组盐度20(HA组), 温度梯度为15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的600 L白色塑料桶, 按照同样的方法将幼虫转移至桶中培育。每个实验组设置3个重复。初始D型幼虫培育密度设置为15粒/mL, 饵料以小球藻和金藻为主, 投喂密度5×104~1.5×105 cell/mL, 调整投喂藻类的盐度与温度与各实验组相同。每天换水1次, 每次换水量1/3, 避光培养。
1.3 幼虫培育设置水温23~25 ℃、盐度23~25、pH 8.2~8.5的40 m3育苗池, 将选优后的AG、GA、SA、AA组D型幼虫移入育苗池培养, 同时设置水温23~25℃、盐度18~20、pH 8.2~8.5的40 m3育苗池, 将选优后的HA组D型幼虫移入其中培养。幼虫初始培育密度15粒/mL。调整投喂藻类的盐度与温度与各实验组相同, 前期饵料以小球藻和金藻为主, 投喂密度3×104~8×104 cell/mL, 每天投喂2次; 待幼虫壳高达到130 µm以上后, 以小球藻为主, 角毛藻为辅, 投喂密度5×104~1.0×105 cell/mL, 每天投喂3次。每天换水一次, 每次换水量1/3, 避光培养。
1.4 数据处理实验过程中定期统计幼虫壳高与存活数据, 计算壳高特定增长率(SGR)和成活率(St)。计算公式如下:
| $ {\rm{SGR}}\left( {\% \cdot {d^{ - 1}}} \right) = \frac{{\ln {H_t} - \ln {H_0}}}{t} \times 100 , $ | (1) |
| $ {S_t}\left( \% \right) = \frac{{{N_t}}}{{{N_0}}} \times 100 , $ | (2) |
式中, H0为初始壳高, Ht为t时壳高, t为实验时间; N0为实验初始每毫升海水中幼虫数量, Nt为t时统计每毫升幼虫数量。
1.5 数据分析使用Excel 2016和SPSS 25软件对数据进行统计与处理, 使用单因素方差分析(ANOVA)来分析不同实验组之间的差异性, 差异显著性均设置为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 不同盐度和温度条件下的幼虫孵化率实验过程中AS、AH两组均无法正常受精, 出现配子不兼容现象, 后续不作分析。不同实验组合幼虫孵化率随盐度的变化整体呈现为先上升后下降的趋势(图 1a)。AG、GA、AA三组对高盐环境的耐受性强于对低盐环境的耐受性, SA、HA两组更适应低盐环境; AG、GA、SA、HA、AA都在盐度25时孵化率最高, 分别为78.33%、75.00%、63.33%、55.00%、71.67%。盐度15时, AG组孵化率最高, 为41.67± 6.24%; 盐度小于25时, 不同组合随盐度增大孵化率上升趋势相近; 盐度大于25时, AG、GA、AA三组孵化率缓慢降低, SA、HA组孵化率急剧下降。从图 1可知, SA组孵化率在不同盐度条件下均明显低于AA组(P < 0.05), HA组在盐度超过20后孵化率也显著低于AA组(P < 0.05), 表现出杂种劣势; AG、GA两组在所有盐度条件下孵化率均高于AA组, 表现出杂种优势。
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| 图 1 盐度与温度对各组合幼虫孵化率的影响 Fig. 1 Effects of salinity and temperature on the hatching rate of larvae in different combinations |
孵化温度由低到高, 幼虫孵化率同样呈现出先升高后下降的趋势(图 1b)。温度为15 ℃时, HA孵化率最低, 为18.33%±2.36%, GA孵化率最高为51.67%± 6.24%; GA组在25 ℃之后孵化率迅速下降, 低于AA组, 表现出对低温的适应性; 温度超过25 ℃后, AG孵化率均高于其他实验组, 在温度为25 ℃时有最高孵化率83.33%±6.24%; SA、HA在各温度条件下孵化率均低于AA组, 表现出杂种劣势。
2.2 不同盐度和温度条件下的幼虫培育7 d生长情况幼虫孵化后在不同盐度条件下培育7 d后, 壳高如图 2a所示, 成活率如图 2b所示。盐度由低到高, 不同杂交组合壳高表现出先增大后减小的趋势, 其中HA组在盐度20时壳高最大, 为(97.8±1.70) µm, 其他组在盐度为25时壳高最大。AG组在所有实验组中壳高均为最大, 在盐度为25时为(124.7±3.17) µm; SA、HA在不同盐度条件下壳高均低于AA组。由图 2b可知, 盐度为15时, GA有最高成活率40.0%± 6.67%; 盐度超过20后, AG成活率在各组中均为最高, 在盐度为25时达到最大值86.67%±5.44%; SA组与HA组在盐度超过20后成活率均低于AA组, 且盐度为35时HA组在第5天死亡率达到100%, 幼虫全部淘汰, 杂种劣势明显。
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| 图 2 不同盐度条件下各组合幼虫培育7 d壳高与成活率情况 Fig. 2 Shell height and survival rates of larvae in different combinations cultured for 7 days at different salinities |
幼虫孵化后在不同温度下培育7 d后, 壳高情况如图 3a所示, 成活率情况如图 3b所示。由图 3a可知, 所有实验组壳高在不同温度条件下均表现出先增大后减小的趋势, 在温度为25 ℃的时候壳高有最大值。温度不超过20℃时, GA组壳高大于AG组, 20 ℃时GA组壳高为各组最大, 达(119.0±1.87) µm; 温度高于20 ℃后, AG组在所有实验组中壳高均为最大, 25 ℃时达到最大值(126.0±2.27) µm; SA组和HA组壳高在不同温度条件下均低于AA组, 25 ℃时分别有最大壳高(93.2±1.84) µm、(98.8±1.31) µm。由图 3b可知, 不同实验组成活率随温度的上升表现出先增大后减小的趋势, 在温度为25 ℃时成活率均为最大。温度为15 ℃时, GA组成活率最高, 为66.67%±5.44%; 温度超过20摄氏度后, AG组成活率均为最高, 其中温度为25℃时, AG成活率达到最高值88.89%±3.14%。不同温度条件下, SA组和HA组成活率均低于AA组, 25℃时分别有最大成活率48.89%±3.14%和46.67%±5.44%。
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| 图 3 不同温度条件下各组合幼虫培育7 d壳高与成活率情况 Fig. 3 Shell height and survival rates of larvae in different combinations cultured for 7 days at different temperatures |
适宜温度与盐度条件下不同杂交组合幼虫壳高生长情况如表 1所示。由表可知, D型幼虫时期GA、AA之间壳高差异不明显, 两组与AG、SA、HA互相差异明显(P <0.05)。第4日开始所有实验组之间壳高差异明显(P <0.05), 不同实验组之间壳高差异表现为AG > GA > AA > HA > SA。AG组壳高SGR始终最大, 为0.09; GA组次之, 为0.08; SA与HA组在幼虫生长前期壳高SGR远小于AA组, 均为0.04, 表现为前期生长速度缓慢, 第4 d壳高SGR为0.06, 生长速度开始加快, 第10 d之后壳高SGR稳定为0.07。培育至第16 d, 生长速度最快的AG组的壳高较AA组高出22.3%, GA组高出11.4%, 但SA组与HA组壳高均低于AA组, 其中SA组壳高较AA组低13.3%, HA组壳高较AA组低6.1%。结果表现为AG组杂种优势最大, SA与HA组杂种劣势明显。
| 实验组 | 日龄/d | ||||||
| 1 | 4 | 7 | 10 | 13 | 16 | ||
| AG | 壳高/µm | 72.5±0.41a | 94.8±1.03a | 122.5±2.45a | 158.2±4.4a | 206.5±5.89a | 266.7±6.79a |
| 壳高SGR/(%·d−1) | — | 0.09 | 0.09 | 0.09 | 0.09 | 0.09 | |
| GA | 壳高/µm | 71.5±0.41b | 90.8±0.62b | 117.2±1.65b | 150.8±3.06b | 193.5±3.94b | 242.8±4.73b |
| 壳高SGR/(%·d−1) | — | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | |
| AA | 壳高/µm | 70.7±0.62b | 88.0±0.71c | 110.2±2.32c | 137.0±3.34c | 173.8±4.09c | 218.0±5.35c |
| 壳高SGR/(%·d−1) | — | 0.07 | 0.07 | 0.07 | 0.08 | 0.08 | |
| SA | 壳高/µm | 63.7±0.24c | 72.5±1.08d | 92.7±1.84d | 121.3±2.95d | 156.5±3.63d | 189.0±4.32d |
| 壳高SGR/(%·d−1) | — | 0.04 | 0.06 | 0.07 | 0.07 | 0.07 | |
| HA | 壳高/µm | 68.5±0.41d | 77.7±0.85e | 99.2±1.7e | 125.8±2.46e | 164.7±3.52e | 204.8±5.17e |
| 壳高SGR/(%·d−1) | — | 0.04 | 0.06 | 0.07 | 0.07 | 0.07 | |
| 注: 不同字母代表不同实验组间存在显著差异(P < 0.05) | |||||||
不同杂交组合幼虫培育前16 d成活率如图 4所示。由图可知, AG组成活率始终最高, 第16 d成活率还能达到66.67%±5.44%; GA组成活率仅次于AG组, 第4 d至第10 d下降趋势明显, 第16 d成活率为53.33%±5.44%; SA组与HA组成活率始终低于AA组, HA组前7 d成活率高于SA组, 但下降幅度明显超过SA组, 第10 d之后成活率低于SA组, 该两组孵化后10 d内成活率下降明显, 10 d后下降趋势有所减缓, SA组第16 d成活率为20.00%±5.44%, HA组第16天成活率为15.56%±3.14%。
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| 图 4 不同实验组合幼虫培育16 d成活率 Fig. 4 Survival rates of larvae in different combinations cultured for 16 days |
杂交子代的快速生长和高成活率是贝类杂交育种的最终目的。亲本的选择是子代产生杂种优势的重要前提, 子一代的高杂合度有利于产生杂种优势, 能够获得常规选育多代才能出现的优良性状[9], 对于水产动物遗传改良、提高产量和提升品质效果显著; 环境盐度与温度对于贝类幼虫的生长与成活具有显著影响[16], 研究表明, 盐度与温度在影响幼虫生长的时候存在互作效应[13], 但需要其中一个因子接近幼虫耐受极限, 另一个因子处于适宜范围时, 两者之间才会出现明显的相互作用, 当两个因子均处于适宜范围时, 相互作用并不明显, 单因子实验可以准确反映环境对幼虫生长的影响[17]。
3.1 巨蛎属牡蛎种间杂交分析对于巨蛎属牡蛎来说, 由于亲本之间亲缘关系相对较远, 产生了生殖隔离, 杂交成功率普遍很低[7, 18-19]。本文分别研究了盐度与温度对福建牡蛎与长牡蛎、熊本牡蛎、香港巨牡蛎的杂交子代以及福建牡蛎自交子代生长与成活的影响。福建牡蛎和长牡蛎都是经过长期实践证明的优良养殖物种, 同时亲缘关系相对其他种较近[20], 种间杂交成功率高, 且杂交子代在生长和存活方面都优于亲本种, 表现出明显的杂种优势[7, 21], 从研究结果来看, 正反杂交子代的表型结果并不相同, 福建牡蛎♀×长牡蛎♂产生的子一代在与环境互作方面普遍优于长牡蛎♀×福建牡蛎♂子一代, 在最适温盐条件下福建牡蛎♀×长牡蛎♂幼虫孵化率、幼虫生长及成活率均高于反交品系及福建牡蛎自交品系, 杂交子代在浮游幼虫阶段母本效应明显[22]。福建牡蛎、熊本牡蛎和香港巨牡蛎三者之间亲缘关系相对较远, 产生生殖隔离, 种间杂交成功率普遍较低, 且只能单向受精, 反向受精则会出现杂交不育(hybrid sterility)现象[10-11, 23]。本研究发现, 熊本牡蛎♀与福建牡蛎♂、香港巨牡蛎♀与福建牡蛎♂虽然能够正常受精, 但由于染色体组兼容性较差或者不兼容, 子一代孵化率、生长速度、成活率都显著低于亲本后代, 在最适温盐条件下, 福建牡蛎与熊本牡蛎、香港巨牡蛎杂交子代在最适温盐条件下孵化率与幼虫生长、成活率均远低于自交品系, 杂种劣势明显, 印证了Palumbi[24]的研究结果。
3.2 盐度对牡蛎幼虫生长与存活的影响盐度是影响海洋贝类的生长、存活及分布的重要环境因子之一, 贝类的受精、孵化及生长各阶段都会随盐度的变化而发生一定的变化[25-26]。牡蛎是渗透压随变者, 体内渗透压会随着周围海水盐度的变化而变化[27], 不同种类牡蛎对盐度的耐受范围不同, 当渗透压的变化超过自身调节最大限度, 就会出现大量死亡现象。
福建牡蛎与长牡蛎均为广盐分布种, 能够适应盐度15~35的生存环境[11, 28], 从本研究的结果分析, 福建牡蛎与长牡蛎的正反交后代均表现出较强的盐度耐受性, 能够在15~35盐度范围内正常存活, 盐度25~30区间为最适生长盐度, 盐度为15时孵化率、生长和存活都受到一定的抑制作用, 可见杂交子代对高盐的耐受性强于对低盐的耐受性; 福建牡蛎自交组在培养16 d后存活率仍然保持在46.7%, 与苏家齐[9]结果中第11 d全部死亡的结果不一致, 可能是由于本研究中采用的亲贝均来自于野生群体, 具有更强的抗逆性。王昌勃[29]研究发现, 熊本牡蛎幼虫适宜生长盐度为18~26, 本研究中福建牡蛎与熊本牡蛎的杂交子一代适盐范围与熊本牡蛎相近, 与福建牡蛎自交子代幼虫的适应高盐环境差异较大, 这一结果表明杂交子代表现出一定的母本效应。本研究发现, 盐度对福建牡蛎与香港巨牡蛎杂交子代生长与存活的影响远高于对其他四组。盐度低于20时, 杂交子代幼虫孵化率高于福建牡蛎自交子代, 盐度高于20时, 杂交子代幼虫孵化率显著低于福建牡蛎自交子代, 且下降趋势明显, 这与任琰[12]研究结果相近。与福建牡蛎自交后代相比, 福建牡蛎与熊本牡蛎、香港巨牡蛎的杂交子代在孵化、幼虫生长与存活方面均处于劣势, 杂种劣势明显, 结果与苏家齐[9]、Zhang等[30]研究结果一致。
3.3 温度对幼虫生长与存活的影响温度是海水贝类的生长、存活及分布的另一重要影响因子[31]。一方面, 贝类是变温动物, 当外界温度适宜时, 升温能让贝类机体代谢旺盛, 摄食活动增强, 进而促进生长[32-33]; 温度高于或低于适温范围时, 贝类体内新陈代谢收到抑制, 同时机体免疫酶活性下降, 生理功能紊乱, 导致生长缓慢、不生长甚至死亡[34]。另一方面, 温度影响了水中各类因素动态, 如pH、盐度、饵料藻类活性等, 间接影响贝类的生长及分布[35]。本研究中, 温度为15 ℃时, 各实验组的孵化率、生长与成活率都处在较低水平, 随着温度上升, 幼虫各项指标均有不同程度的升高, 当温度超过25 ℃后, 大部分实验组幼虫各项指标开始下降, 温度超过30 ℃后, 下降趋势进一步加大, 与之前的研究结果一致[35]。
福建牡蛎与长牡蛎的分布特点决定了福建牡蛎的高温耐受性和长牡蛎的低温耐受性[7]。姜高伟等[8]研究了温度对长牡蛎与福建牡蛎种间杂交的影响, 发现杂交子代能够成功遗传长牡蛎的低温耐受性和福建牡蛎的高温耐受性, 与本研究结果一致, 同时本研究发现福建牡蛎与长牡蛎正反交子代在孵化率、生长与存活各项指标上存在差异, 母本效应明显。
从地理分布上可知, 熊本牡蛎[36]与香港巨牡蛎[22]均喜好高温环境, 从本研究结果来看, 福建牡蛎与熊本牡蛎、香港巨牡蛎的杂交子代也呈现出明显的高温适应性, 最适生长温度为25~30 ℃, 孵化后杂交子代均表现出显著的杂种劣势, 且随着培养时间的增长, 劣势愈发显著。这种情况同样表现在长牡蛎与熊本牡蛎[37]、香港巨牡蛎[38]的杂交子代上。但许飞[39]在对福建牡蛎与熊本牡蛎杂交进行研究时, 发现杂交子代在受精、孵化及成活率方面表现出杂种劣势, 但在后期生长方面却表现出一定的杂种优势。因此, 杂种优势不仅与亲本的遗传距离有关, 同时也可能与养殖方法、环境因子等有关[40], 如果能够找出影响杂种优势效应的因子, 并从技术层面加以解决, 那么就可以为改善熊本牡蛎个体太小、香港巨牡蛎无法在高盐环境生存的问题提供新思路。
综上所述, 福建牡蛎与长牡蛎的杂交子代在孵化、浮游幼虫生长阶段均表现出优于福建牡蛎自交子代的性状, 杂种优势明显; 福建牡蛎与熊本牡蛎、香港巨牡蛎只能单向受精, 且杂交子代在幼虫孵化及浮游幼虫生长阶段杂种劣势明显; 本研究确定了福建牡蛎与长牡蛎的杂交组合更适宜福建地区牡蛎养殖, 其中, 福建牡蛎♀×长牡蛎♂优于长牡蛎♀×福建牡蛎♂。同时确定了其杂交子代浮游幼虫阶段的最适温盐组合, 为福建牡蛎良种选育提供了参考依据, 也为杂交子代的人工育苗提供了技术方案。
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