绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)又名剥皮鱼和耗儿鱼等, 属单角鲀科(Monacanthidae)、马面鲀属(Thamnaconus)^[1], 是中国北方沿海的重要经济鱼类, 其有生长速度快、养殖周期短和清理网箱附着物等养殖优点, 近年来形成了近海-远海网箱接力、海上网箱-陆基工厂化接力和北方-南方网箱接力养殖等商品鱼养成模式^[2], 据测算全国市场需求可达3 × 10⁵ t, 产值达3 × 10¹¹元, 市场和产业前景十分广阔, 已逐渐成为人工养殖的重点关注对象之一^[3], 但目前苗种培育过程中的开口期、开鳔期和饵料转化期等死亡高峰期严重制约了其出苗率, 仅为30% 左右, 影响了产业的发展与推广^[4]。目前对绿鳍马面鲀仔、稚和幼鱼的研究多围绕生长发育和生活习性等生物学特性展开^[5-7], 如张哲等^[5]研究了其早期生长发育与摄食特性, 得出其仔、稚和幼鱼的生长指标可拟合为2~3段直线及均为白天摄食类型的结论; 党保成等^[6]研究了其幼鱼游泳运动及能量代谢, 得出了幼鱼长时间处于0.36 m/s和0.48 m/s流速时, 体内会出现无氧代谢过程并加剧糖原和血糖的消耗, 因此在养殖水流速不要长期高于0.36 m/s的结论, 而目前关于其骨骼发育的研究尚未见报道。

鱼类骨骼是具有支撑身体、保护内脏器官、提供肌肉附着点和维持运动等功能的重要组织, 骨骼的形态与结构特征是鱼类进化和分类的重要依据之一, 其构造和功能可为鱼类环境学研究提供理论参考^[8]。鱼类早期发育过程中骨骼会发生一系列变化, 包括软骨的连续发育和之后的硬骨化过程, 这与运动方式和环境适应性等密切相关^[9-11], 如于超勇等^[9]研究的大泷六线鱼(Hexagrammos otakii) 2 d时即发育出胸鳍基板, 为其开口饵料的摄取提供了重要动力; 27 d匙骨的骨化支撑了胸舌骨肌, 增强了鱼体的摄食能力, 大泷六线鱼进入快速生长期; 至稚鱼后期阶段, 鱼体直线摄食行为显现, 此时大泷六线鱼附肢骨骼的骨骼元件逐步骨化完成, 为大泷六线鱼短途冲刺捕食猎物提供了必要条件。附肢骨骼是鱼类骨骼的重要组成部分之一, 具有维持身体平衡和抵御敌害等功能, 明确其发生发育的过程是认识鱼类在不同阶段的生活方式和功能需求的重要基础, 可指导苗种生产工作^[12-14]。

鱼类骨骼研究方法主要有3种: 软骨-硬骨染色法, 主要针对仔、稚和幼鱼等小型鱼类; 蒸煮剔骨法和X射线透视法, 主要针对中、大型鱼类^[15-17]。其中, 染色法能很好地区分出软骨与硬骨和显示出各骨骼的发育与骨化时序, 这是其余两种方法所不具备的, 目前, 运用此技术对鱼类早期骨骼发育展开了一定的研究, 摸清了大泷六线鱼、军曹鱼(Rachycentron canadum)、矛尾鰕虎鱼(Chaeturichthys stigmatias)、尖翅燕鱼(Platax teira)和金线鱼(Nemipterus virgatus)等鱼的附肢骨骼与脊柱的发育规律^[9-13], 为各自的繁殖生物学提供了理论参考。

本文运用软骨–硬骨双染色技术, 对绿鳍马面鲀仔、稚和早期幼鱼附肢骨骼的发育进行观察, 旨在填补绿鳍马面鲀仔、稚和早期幼鱼骨骼染色的空白, 为其苗种繁育提供参考, 同时丰富鱼类骨骼形态学发育的资料, 有助于鱼类系统分化和系统分类的研究。

1 材料与方法 1.1 实验材料

2022年5—6月于中国水产科学研究院东海水产研究所江苏赣榆研究中心进行实验, 取同一批次受精卵流水孵化, 孵化水温(22.5±0.5) ℃, 盐度29.5±0.5, pH值7.5±0.2, 经(50±2) h孵化出膜。同一批次的初孵仔鱼于3个4 m × 4 m × 1.5 m的水泥池培育, 密度约4 000~6 000 ind/m³, 培育期间水温(22.0±1.5) ℃, 盐度29.5±1.5, pH 7.5±0.4, 持续微充气和微流水, 依照生产要求进行管理。饵料投喂顺序: SS轮虫(3~7 d)、L轮虫(6~20 d)、卤虫无节幼体(18~30 d)、桡足类(25~ 35 d)、微粒饲料(28~60 d)。

1.2 实验方法 1.2.1 样本采集

以初孵仔鱼孵化时间为参考, 间隔24 h取样, 前30 d每d取一次, 后30 d每3 d取一次, 持续60 d。MS-222缓慢麻醉后10%中性福尔马林溶液(100 mL甲醛+ 900 mL蒸馏水+ 4 g磷酸二氢钠+ 6.5 g磷酸氢二钠)固定, 24 h后换液, 4 ℃低温保存, 实验室染色观察。

1.2.2 染色观察

软骨-硬骨双染色技术参考杨安峰^[15]的研究。主要流程包括: 清洗标本(蒸馏水浸泡(24~48 h)、软骨染色(10 mg阿利新蓝+ 80 mL纯乙醇+ 20 mL冰醋酸)(12~24 h)、梯度漂洗(依次置于95%、75%、40%、15%的乙醇溶液, 标本下沉为依据)、组织软化(1 g碱性蛋白酶+ 70 mL蒸馏水+ 30 mL硼砂饱和溶液)(24~48 h)、硬骨染色(4 mg茜素红+ 100 mL 0.5%氢氧化钾溶液)(12~24 h)、褪色漂白(0.5%氢氧化钾溶液+ 1~3滴3%双氧水)(0.5~1 h)、透明保存(依次置于3∶1、1∶1、1∶3的0.5%氢氧化钾-甘油合剂, 样本下沉后纯甘油中保存另加少量石炭酸防腐)。显微镜和体视镜观察染色情况, 拍照记录, Image View进行照片修正, 各附肢骨骼划分见图 1, 参照新鱼类解剖图鉴^[18]和苏锦祥等^[19]的研究命名骨骼。

2 结果 2.1 第一背鳍

图 2为绿鳍马面鲀第一背鳍骨骼的发育变化图, 第一背鳍骨骼主要由主鳍棘、副鳍棘和肩带等组成。由图版可知, 其肩带8 d清晰可见, 鳍基开始形成(图 2a); 10 d肩带变大呈三角形, 鳍基初步形成(图 2b); 12 d主鳍棘基本形成, 整体透明无色(图 2c); 15 d主鳍棘基部出现横向倒刺, 另基部后方出现副鳍棘(图 2d); 18 d主鳍棘、副鳍棘、锥形倒刺和肩带均为软骨状态, 肩带延长至脑后方(图 2e); 23 d主鳍棘、副鳍棘和锥形倒刺开始硬骨化, 骨化方向为基部向末端延伸, 肩带大部分介于软骨和硬骨之间(图 2f); 26 d主鳍棘、副鳍棘、锥形倒刺和肩带均硬骨化(图 2g); 33 d主鳍棘上的锥形倒刺显著增多, 规则排列, 指向朝下(图 2h); 45 d第一背鳍相关骨骼染色后呈淡紫色, 完全变为硬棘(图 2i)。

2.2 第二背鳍

图 3为绿鳍马面鲀第二背鳍骨骼的发育变化图, 第二背鳍骨骼主要由近端支鳍骨、远端支鳍骨和背鳍条等组成。由图版可知, 其第二背鳍14 d近端支鳍骨出现, 鳍膜尚存(图 3a); 18 d近端支鳍骨显著增长增多, 远端支鳍骨从前往后依次出现, 透明鳍条由鳍膜分化而出(图 3b); 22 d约一半近端支鳍骨中部介于软骨和硬骨之间, 远端支鳍骨全部出现, 与近端支鳍骨交替排列(图 3c); 25 d近端支鳍骨中部和鳍条开始硬骨化, 鳍条基部出现横向锥形倒刺(图 3d); 30 d近端支鳍骨和鳍条硬骨化明显, 远端支鳍骨与鳍条连接处开始硬骨化(图 3e); 39 d近端支鳍骨下端软骨略有残留, 上端软骨欲独成列(图 3f); 45 d近端支鳍骨下端软骨消失殆尽, 上端软骨独成一列, 中部开始延伸出骨片, 远端支鳍骨和鳍条硬骨化明显(图 3g); 60 d近端支鳍骨下端完全硬骨化, 中部延伸的骨片彼此近相连, 上端一列圆孔有序排列, 支鳍骨间单独成列的软骨无明显变化, 鳍条末梢软骨尚存(图 3h)。

2.3 臀鳍

图 4为绿鳍马面鲀臀鳍骨骼的发育变化图, 臀鳍骨骼主要由近端支鳍骨、远端支鳍骨和臀鳍条等组成。由图版可知, 其臀鳍14 d近端支鳍骨排列出现, 从前往后依次变短, 鳍膜清晰(图 4a); 18 d近端支鳍骨上端膨大变粗, 远端支鳍骨排列出现, 透明鳍条分化而出(图 4b); 22 d约一半近端支鳍骨中部介于软骨和硬骨之间, 远端支鳍骨全部出现(图 4c); 25 d近端支鳍骨和鳍条开始硬骨化(图 4d); 28 d近端支鳍骨和鳍条硬骨化明显, 鳍条基部出现锥形倒刺(图 4e); 39 d近端支鳍骨下端软骨略有残留, 腹腔后第一根支鳍骨格外膨大, 远端支鳍骨与鳍条连接处开始硬骨化(图 4f); 45 d近端支鳍骨中部硬骨化完全, 上端软骨欲独成列, 下端软骨消失殆尽(图 4g); 60 d近端支鳍骨硬骨化完全, 中部延伸的骨片彼此近相连, 鳍条末梢软骨尚存(图 4h)。

2.4 尾鳍

图 5为绿鳍马面鲀尾鳍骨骼的发育变化图, 尾鳍骨骼主要由尾下骨、尾上骨、侧尾下骨、尾杆骨和尾鳍条等组成。由图版可知, 其尾部18 d出现髓弓和脉弓, 脊索透明笔直(图 5a); 21 d尾下骨、侧尾下骨、尾上骨和尾鳍条均清晰可见, 髓弓和脉弓分别分化为愈合型髓棘和愈合型脉棘, 脊索末端开始上翘(图 5b); 22 d尾部骨骼显著增大, 脊索上翘明显(图 5c); 23 d尾部骨骼除尾上骨其余骨骼中部介于软骨和硬骨之间, 脊索弯曲达最大化(图 5d); 25 d脊索末端分化为尾杆骨, 并与尾鳍条开始硬骨化, 尾上骨中部介于软骨和硬骨之间(图 5e); 26 d末端锥体开始硬骨化, 12根尾鳍条硬骨化清晰, 其中尾下骨附着8根尾鳍条, 尾上骨和尾杆骨各附着1根鳍条, 侧尾下骨附着2根鳍条, 各鳍条数列锥形倒刺规则排列(图 5f); 33 d尾部骨骼边缘均有软骨残留(图 5g); 39 d尾鳍条末端出现分叉现象(图 5h); 60 d愈合型髓棘和愈合型脉棘末端边缘尚有软骨残留, 二者基部向外延伸出骨片, 鳍条末梢软骨尚存(图 5i)。

2.5 胸鳍和腹鳍

图 6为绿鳍马面鲀胸鳍和腹鳍骨骼的发育变化图, 胸鳍骨骼主要由肩喙骨、乌喙骨、肩胛骨、近端支鳍骨、远端支鳍骨和胸鳍条等组成, 腹鳍骨骼主要由腰带和锥形倒刺组成。由图版可知, 1 d肩喙骨和匙骨已存在, 肩喙骨似L, 匙骨似长条(图 6a); 3 d胸鳍近端支鳍骨清晰可见, 整体为1个软骨板, 胸鳍鳍条出现, 是绿鳍马面鲀最早出现的鳍条(图 6b); 7 d胸鳍近端支鳍骨中部开始分化, 出现横向空隙(图 6c); 11 d肩喙骨形态发生改变, 腹鳍的腰带呈一字形, 尚未破体(图 6d); 13 d肩喙骨分化为肩胛骨和乌喙骨, 肩胛骨支撑整个近端支鳍骨骨板, 乌喙骨向下延伸, 腹鳍鳍棘和腰带直连, 末端数个锥形倒刺, 后匙骨细长隐约可见(图 6e); 19 d胸鳍近端支鳍骨骨板分化出第2个横向空隙, 乌喙骨延伸至腰带处(图 6f); 22 d胸鳍近端支鳍骨骨板分化成4小部分, 远端支鳍骨和肩胛骨孔清晰可见, 腰带中部介于软骨和硬骨之间, 匙骨开始硬骨化(图 6g); 23 d腹鳍末端的锥形倒刺硬骨化明显, 后匙骨开始硬骨化(图 6h); 24 d匙骨和后匙骨硬骨化明显, 均为骨膜化骨, 腹鳍腰带由中间向两边硬骨化(图 6i); 25 d椭圆形鳃孔位于肩胛骨前方, 乌喙骨中部和胸鳍鳍条开始硬骨化, 腹鳍腰带两端末梢软骨尚存, 匙骨完全硬骨化并向后延伸出骨片(图 6j); 27 d胸鳍近端支鳍骨开始硬骨化, 肩胛骨缩小变短, 乌喙骨中部向前延伸出骨片, 下端末梢软骨尚存, 腹鳍腰带前端软骨消失殆尽(图 6k); 36 d胸鳍近端支鳍骨两端软骨尚存, 远端支鳍骨开始硬骨化, 后匙骨上部向后延伸出骨片, 腰带向下延伸出骨片(图 6l); 51 d肩胛骨开始硬骨化, 胸鳍鳍条末梢软骨尚存(图 6m); 60 d除远端支鳍骨、肩胛骨和乌喙骨下端边缘有软骨残存, 其余骨骼均已骨化为硬骨(图 6n)。

3 讨论 3.1 绿鳍马面鲀早期附肢骨骼发育的适应性意义

研究认为鱼类仔、稚鱼骨骼系统的发育与早期功能需及环境适应性等密切相关^[8], 绿鳍马面鲀初孵仔鱼的卵黄囊在3~4 d即吸收完毕, 油球也将消失殆尽, 及时有效摄取外源性营养则需要优先发展与游泳和摄食相关的骨骼。1 d出现的肩喙骨和匙骨, 共同支撑起胸舌骨肌, 让鱼体具备了初步的捕食能力^[20], 3 d出现的胸鳍鳍条和近端支鳍骨, 是绿鳍马面鲀最早发育的附肢骨骼, 仔鱼可依靠胸鳍、尾部和躯体的摆动初步具备游动能力。第一背鳍肩带于8 d出现, 12 d形成主鳍棘, 腹鳍腰带11 d出现, 13 d与腹鳍棘直连, 第一背鳍主鳍棘和腹鳍棘均出现锥形倒刺, 2鳍鳍棘展开时鱼体“体高”显著增加, 一方面可吓阻捕食者, 另一方面锥形倒刺易刺伤捕食者, 降低捕食者对绿鳍马面鲀仔、稚鱼的偏好, 提高个体存活率和种群存活率^[21]。第二背鳍和臀鳍的相关骨骼发育基本同步, 均为14 d出现近端支鳍骨, 18 d出现远端支鳍骨, 并由鳍膜分化出鳍条, 仔鱼的游动和平衡能力得以进一步提升, 这也是生产上将要进行饵料转换的重要标志之一。

尾鳍是为鱼类高速运动提供动力和改变运动方向的主要器官, 绿鳍马面鲀尾部18 d出现髓弓和脉弓, 21 d尾下骨、侧尾下骨、尾上骨和尾鳍鳍条均已清晰可见, 25 d脊索末端演化为尾杆骨并开始硬骨化。骨骼的形态结构反映了生物体在其生命历程中所受的机械负荷, 通常正常动物体内骨骼会根据负荷的改变而随时间重塑其形状^[22]。绿鳍马面鲀稚鱼逐渐发育的7片尾骨可为尾鳍提供坚固的骨骼结构, 是强大推动力的保障, 稚鱼期饵料转为卤虫, 鱼体摄食量日益增大, 体长体重变化迅速, 尾部骨骼的形态改变正是对环境相适应的结果。

3.2 绿鳍马面鲀早期附肢骨骼的发育和骨化特征

鱼类胸鳍、腹鳍、臀鳍和尾鳍等的发育时间节点因鱼的种类而有所不同, 这可能与摄食饵料、消化能力和生长环境等有关^[23-24]。本研究中绿鳍马面鲀早期附肢骨骼的出现时序依次为胸鳍(1 d)、第一背鳍(8 d)、腹鳍(11 d)、第二背鳍(14 d)、臀鳍(14 d)、尾鳍(18 d); 硬骨化时序依次为第一背鳍(23 d)、腹鳍(23 d)、第二背鳍(25 d)、臀鳍(25 d)、尾鳍(25 d)、胸鳍(27 d)。绿鳍马面鲀胸鳍最早发育与多数海水鱼类相一致, 随之是第一背鳍和腹鳍的发育, 尾鳍发育最晚, 这点与其他多数海水鱼类有所不同^[10-13], 原因可能是绿鳍马面鲀初孵仔鱼个体相对偏小(2.16±0.12) mm, 远小于大眼双锯鱼(Amphiprion ephippium)(4.472~6.152 mm)^[25]和拟赤梢鱼(Pseudaspius leptocephalus) (6.39±0.28) mm^[26]等鱼的初孵仔鱼, 至10 d全长才达到(2.93±0.15) mm, 前期增长缓慢、口裂较小和食量偏低, 不需要依靠尾鳍的快速摆动捕捉食物, 有研究认为饥饿和被捕食是影响仔、稚及幼鱼存活的主要影响因素, 在长期的进化过程中会优先发育与生存相关的组织^[27], 背棘和腹鳍的骨化与御敌有直接关系^[28], 绿鳍马面鲀优先发育和硬骨化第一背鳍和腹鳍, 有利于提高个体和群体存活率, 这与初孵仔鱼中口裂较小的赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的骨骼发育和硬骨化时序相一致^[29]。仔、稚鱼骨骼的发育直接影响鱼类饵料的转换过程, 早期骨骼的适时发育可显著提高饵料转换期间仔、稚鱼的成活率^[9]。第二背鳍和臀鳍的发育和硬骨化时序基本一致, 原因可能是绿鳍马面鲀摄食卤虫时体型已是侧扁, 仅依靠胸鳍难以掌握平衡和捕捉食物, 第二背鳍与臀鳍的及时发育和尾鳍的同步硬骨化可以弥补这一缺陷。

绿鳍马面鲀各附肢骨骼的近端支鳍骨和远端支鳍骨均为先软骨化后硬骨化, 骨化方向皆是从中部向两端延伸, 与刀鲚(Coilia nasus)的骨化方向相同^[30], 而与大黄鱼(Larimichthys crocea)的骨化方向相反^[28]。骨骼中直接由骨膜化硬骨的包括各鳍鳍条、匙骨、后匙骨和尾杆骨, 这与大多数海水鱼类相一致^[10-13], 其机理机制尚需进一步研究。

研究发现, 尾杆骨上翘普遍存在于大部分鱼类的早期发育阶段, 发育完全的尾骨中留有缩回并上翘的尾杆骨, 可以其为界限将尾骨分为尾上骨和尾下骨^[31]。绿鳍马面鲀具有5枚尾下骨, 这与同为鲀形目的菊黄东方鲀(Takifugu flavidus)具有2枚尾下骨相差较大^[32], 同时与矛尾鰕虎鱼具有3枚^[11]、有明银鱼(Salanx ariakensis)具有6枚^[33]、日本鬼鲉(Inimicus japonicus)具有4枚^[34]均不同, 而与大泷六线鱼与褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)的尾下骨数相同^{[9, 35]}。研究鱼类的骨骼发育不仅对鱼类分类学、发育学有重要意义, 同时分析骨骼的构造及构件特点能够为确定物种在分类学上的地位以及进化历程提供指导^[31]。绿鳍马面鲀的尾下骨高度联合成两部分, 分别是第1、2、3尾下骨发生联合, 以及第4、5尾下骨发生联合, 大泷六线鱼则是侧尾下骨与第1、2尾下骨发生联合和第3、4、5尾下骨发生联合^[9], 褐菖鲉是第2与第3、第4与第5尾下骨发生联合^[35], 而分类地位较低的美洲鲥(Alosas apidissima)^[36]与远东拟沙丁鱼(Sardinops melanostictus)^[37]仅存在第1和第2尾下骨融合的趋势。此外, 不同鱼类的尾上骨数量也存在较大差异, 绿鳍马面鲀具有1枚尾上骨, 与菊黄东方鲀没有尾上骨^[32]、矛尾鰕虎鱼具有2枚尾上骨^[11]及日本鬼鲉^[34]、褐菖鲉^[35]和鲱小鲷(Pagellus erythrinus)^[38]具有3枚尾上骨均不同。

4 结论

本研究对绿鳍马面鲀附肢骨骼的发育和骨化进行了观察与描述, 确定了附肢骨骼的发育时序, 探讨了附肢骨骼发育的适应性意义, 有助于进一步了解其早期发育阶段的功能趋向, 可为其苗种培育提供参考。