盐度(S)是影响水生动物生理代谢的重要环境因子^[1], 盐度的变化往往会直接或间接影响水生动物的存活、生长和繁殖等^[2-4], 从而导致生态系统中种群动态及群落组成发生变化^[5-6]。已有许多研究表明, 盐度胁迫会引起水生动物生理功能的变化。例如, 在0~28的盐度范围内, 随着盐度的升高, 施氏鲟(Acipenser schrenckii)血液生理指标中的血液总胆红素含量会增加, 总蛋白和甘油三酯含量先上升后下降, 血清淀粉酶含量变化则与之相反^[7]。对于中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)而言, 水体盐度的升高会导致其性早熟率上升, 成活率降低^[8]。在海洋无脊椎动物中, 河口桡足类常常暴露在盐度剧烈波动的环境中, 这会影响其生命周期特征, 进而影响它们的种群动态^[9]。大量证据表明, 生活在这些环境中的生物并不都严格遵循外部盐度条件, 大多具有不同程度的渗透调节能力^[10-11]。而与渗透随变(其渗透压可随环境浓度变化而变化)不同, 渗透调节是个能量消耗很大的过程^[12-13]。

在水域生态系统中, 藻类作为浮游动物的主要食物来源, 为浮游动物的生存和繁殖提供物质和能量^[14]。在食物限制时, 轮虫无法获得足够的能量, 这将影响轮虫的寿命和繁殖^[15-16]。另外, 食物短缺也会限制水生动物的渗透调节能力, 进而影响其对盐度的耐受性, 但这种限制会在资源增加时得到补偿。例如, Rippingale等^[17]的研究表明, 当食物充足时, 在高渗盐度下, 桡足类Sulcanus conflictus的寿命会延长。类似地, Hammock等^[18]发现, 当食物资源水平较高时, 桡足类Eurytemora affinis的存活率在低渗和高渗环境下都会增加。因此, 上述关于食物丰度变化对水生生物生命特征影响的研究表明, 在低渗或高渗盐度条件下, 食物丰度变化会影响浮游生物对盐度的耐受性。

褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)是一种典型的盐水轮虫, 具有较强的渗透调节能力。在自然环境下, 轮虫常以藻类为食。我们在先前的研究中发现, 褶皱臂尾轮虫能很好地摄食球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)并扩大自身种群。但在复杂多变的海洋环境中, 球形棕囊藻作为一种常见的赤潮藻类, 其生物量经常发生波动。目前, 球形棕囊藻丰度的变化是否会对轮虫的盐度耐受性产生影响还知之甚少。因此, 在本研究中, 我们通过设置不同丰度的球形棕囊藻种群, 来模拟轮虫在自然环境中可能经历的一系列食物丰度变化(低食物丰度、中等食物丰度和高食物丰度), 选取五个盐度条件(S=3、5、20、30、45), 通过记录褶皱臂尾轮虫生活史参数, 分析在不同的资源条件下轮虫对盐度耐受性的变化。

1 材料和方法 1.1 藻类和浮游动物

使用无菌的f/2培养基在2 L大锥形瓶中培养球形棕囊藻, 温度25 ℃, 光暗比为14 h∶10 h。褶皱臂尾轮虫休眠卵在相同条件的曝气人工海水(盐度33, 溶解氧 > 6 mg/mL)中进行孵化和培养, 孵化出的轮虫以球形棕囊藻作为食物喂养。

1.2 实验设计

将褶皱臂尾轮虫置于不同食物丰度和不同盐度组合条件下, 记录褶皱臂尾轮虫生活史参数的变化, 来分析食物丰度对褶皱臂尾轮虫盐度耐受性的影响。挑选龄期4 h以内的轮虫幼体暴露于5个盐度条件(S=3、5、20、30、45)下, 并分别投喂6种不同丰度的球形棕囊藻(1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、3.6×10⁵个/mL), 因而共有30个处理(5个盐度×6个食物丰度)。随机挑选出24只轮虫幼体分别置于24孔板中进行完整的生活史实验, 相当于每个处理设置24个平行。每隔一段时间轻微摇晃孔板以防止藻细胞沉淀。

为了准确评估轮虫的存活、发育和繁殖所受的影响, 分别记录了以下生活史参数: (1)存活时间；(2)母体轮虫的成熟时间与首次繁殖时间, 即首次怀卵时间和首次产幼体时间；(3)母体轮虫的首次产幼体后体长；(4)每只母体轮虫的总后代数；(5)能产后代的轮虫数量。

为了获得准确的首次怀卵时间和首次产幼体时间, 每4 h在体视显微镜下观察轮虫的发育成熟情况。首次繁殖后, 每12 h记录新生子代数和母体轮虫死亡数, 并将新生幼体和死亡母体从孔板中移除。每隔24 h更换新鲜培养基, 实验一直持续到全部母体轮虫死亡后结束(约14 d)。

为了测定每个处理下母体轮虫首次产幼体后体长, 针对每个处理另外设置24个重复, 待轮虫首次繁殖产幼体后, 从24个重复中随机挑选12只轮虫, 用75%的乙醇固定, 置于光学显微镜下利用成像软件NIS Elements BR(日本尼康)测量轮虫体长(从头冠到尾部基底, 即躯尾交界处)。实验培养条件均为: 温度25 ℃, 光暗比14 h ׃ 10 h, pH值8.3。

1.3 数据分析

在生活史实验中, 除“能产后代的轮虫数量”这一指标外(此指标是针对24孔的一个统计, 没有平行), 其他的生活史指标均采用双因素方差分析(α=0.05), 来评估所有处理中盐度与棕囊藻丰度之间是否存在交互作用。随着交互作用的产生, 为了探索这些影响并为其生活史响应提供一种趋势指示, 我们利用公式拟合生活史参数随盐度和棕囊藻丰度的变化趋势。另外, 在同一盐度不同藻类丰度下, 我们还研究了总后代数与存活时间的关系, 并对数据进行线性拟合, 评估两者之间是否存在权衡。

利用公式拟合得到的参数来评估随着藻类丰度的增加, 盐度变化对轮虫的影响。我们将数据拟合到两个预测模型中[模型(1)和(2)], 这两个模型都是用来描述非线性趋势呈指数变化最终趋向于理论极值(分别为下降或上升)的模型。选择这两个模型有利于将数据简单化, 允许在各处理之间进行比较:

$ r=r_0+\alpha e^{-\beta A}, $

(1)

$ r=\gamma\left(1-e^{-\delta A}\right), $

(2)

其中r代表任一个生活史参数, A是棕囊藻丰度, r₀和γ分别是当A足够大时, 指数下降或上升逐渐趋于稳定的极值[最小值, 模型(1)；最大值, 模型(2)], β和δ分别描述了曲线下降和上升变化情况。同时, 使用非线性拟合方法将上述所获得的衍生数据进行拟合, 应用Marquardt-Levenberg算法确定参数(及其标准误差SE)。

2 结果 2.1 存活

盐度和食物丰度对轮虫的存活时间没有显著的交互作用(表 1), 但低食物丰度和高盐度条件的组合会对轮虫的存活时间产生显著影响, 而随着食物丰度的增加, 这种影响会逐渐减弱(图 1a)。高盐度(S=45)下轮虫的存活时间显著高于其他4个盐度下轮虫的存活时间。在不同的盐度下, 轮虫的存活曲线变化趋势存在差异: 在盐度20和30时, 随着球形棕囊藻丰度的增加, 轮虫存活时间逐渐降低；在其他3个极低和极高盐度下, 随着球形棕囊藻丰度增加, 轮虫的存活时间则先增加后降低。食物丰度大于1×10⁵个/mL时, 各盐度下轮虫的存活时间趋向于稳定；且随着食物丰度的增加, 盐度为3、5、20和30四组轮虫的存活时间逐渐趋于一致(图 2)。

2.2 发育

双因素方差分析表明, 盐度和食物丰度对轮虫的发育(首次怀卵和首次产幼时间)有显著的交互作用(表 1)。在所有盐度下, 棕囊藻丰度较低时, 轮虫发育成熟时间延长, 随着棕囊藻丰度的增加, 轮虫的首次繁殖时间呈指数下降, 随后趋向于稳定的正常值。在20盐度条件下, 轮虫的首次繁殖时间最短, 其次为盐度5和30；在盐度3及45条件下, 轮虫的首次繁殖时间有所延迟。食物限制显著影响了低盐度(S=3)和高盐度(S=45)下轮虫的首次繁殖时间, 且这种限制在高盐度下体现得更明显(图 1b、c)。具体表现为: 在低食物丰度(如1×10⁴个/mL)时, 45盐度下轮虫的首次怀卵和首次产幼时间分别为116 h和145 h, 比盐度20组的轮虫延迟了78 h和87 h；而在充足的食物条件(如3.6×10⁵个/mL)下, 两者的首次怀卵和首次产幼时间差值缩短为16 h和22 h。对于低渗(S=3)条件, 虽然在低食物丰度时, 轮虫的首次怀卵和首次产幼时间与盐度20组相比延迟了40 h和43 h, 但随着食物丰度的增加, 两者的首次繁殖时间逐渐接近并趋于一致, 表明食物资源的增加可以一定程度上缓解低渗和高渗条件对轮虫发育带来的负面影响(图 3a, b)。另外, 在不同盐度和棕囊藻丰度下, 轮虫首次产幼体时体长无显著差异(图 4)。

2.3 繁殖

双因素方差分析表明, 盐度和食物丰度对轮虫的繁殖有显著的交互作用(表 1)。在所有盐度下, 随着食物丰度的增加, 轮虫的总后代数呈指数上升, 随后趋于最大值, 即稳定的正常值(图 1d)。在低于1×10⁵个/mL食物条件时, 轮虫的总后代数会随着食物丰度的增加急剧上升；而在高于1×10⁵个/mL食物条件时, 各盐度下轮虫的总后代数逐渐趋于稳定。在盐度20时, 轮虫的总后代数最高, 其次为盐度30, 在其他3个盐度下, 轮虫总后代数下降更为显著。在极低食物丰度时, 所有盐度下轮虫的繁殖均受到抑制。例如: 在1×10⁴个/mL的低食物丰度条件下, 盐度20和30组轮虫的总后代数平均分别仅为5只和3只左右, 比充足食物条件(如3.6×10⁵个/mL)下轮虫的总后代数各减少了大约10只(图 5a)。另外, 3和45盐度下的轮虫不仅表现为总后代数显著降低, 能够产后代的轮虫数量也相应减少。在1×10⁴个/mL的低食物丰度条件下, 45盐度组的轮虫仅有约一半的母体可以产生后代(图 5b)。相关的结果在图 1d中也得到了体现: 轮虫的最高总后代数出现在盐度为20和高食物丰度的组合条件下。极低的食物丰度不仅会给各盐度下的轮虫带来显著的负面影响, 甚至会掩盖盐度效应, 对轮虫的繁殖起决定性作用。但这种负面影响会随着食物丰度的增加逐渐减轻, 且随着食物丰度的增加, 20和30盐度下轮虫的总后代数与其他3组轮虫的总后代数相比, 差值逐渐增大(图 5a)。

2.4 同一盐度不同食物丰度下轮虫的繁殖和存活状态

直线拟合轮虫五个盐度下各食物水平的繁殖和存活数据, 结果显示: 在同一盐度不同食物丰度下, 轮虫在存活和繁殖之间存在权衡, 且这种权衡在适宜盐度(S=20、S=30)下表现的最明显(P < 0.05)。具体表现为: 同一盐度下, 当面临食物不足时, 轮虫会通过降低繁殖来延长寿命；而随着食物丰度的增加, 轮虫的繁殖会显著增加, 存活时间则相对降低(图 6)。

2.5 极值和相对变化率

基于数据拟合所获参数分析可知, 随着盐度的增加, 轮虫的发育成熟时间先下降后上升, 在盐度11左右轮虫发育最快(图 7a, c)；方差分析结果表明, 不同盐度对轮虫首次带卵和首次产幼体时间随食物丰度逐渐增加而趋向的理论最小值有显著影响, 但对随食物丰度拟合曲线的变化趋势无显著影响(图 7b, d)。

就繁殖而言, 随着盐度的增加, 每只轮虫的总后代数则呈先增加后降低的趋势, 且在盐度25左右轮虫的总繁殖量达到最大(图 7e)；不同处理下得到的理论最大值具有显著性差异, 且在盐度20时, 轮虫趋向理论最大值的速率显著升高(图 7f)。此外, 虽然能够产后代的轮虫数量的理论最大值之间无显著性差异(图 7g), 但该指标拟合的指数变化率之间有显著性差异(图 7h)。

就存活而言, 随着盐度的增加轮虫的存活时间也相应增加, 盐度45处理下得到的存活时间的理论最大值与其他4个盐度相比显著增加(图 7i), 且不同盐度对轮虫存活时间随食物丰度拟合的指数变化率有显著影响(图 7j)。

3 讨论

褶皱臂尾轮虫作为世界性分布的广盐性轮虫, 有关其对盐度耐受性的研究已有不少报道^[19]。在复杂多变的海洋环境中, 浮游植物的丰富度及多样性往往发生着一系列变化, 这将影响初级消费者对各类生态因子的耐受性。在本研究中, 我们发现, 食物丰度和盐度的不同组合会对轮虫的关键生活史参数(生存、发育和繁殖)产生显著的影响, 且这两个因素有显著的交互作用。食物限制会显著影响高盐环境下轮虫的存活时间, 但这种影响会随着食物资源的补充而逐渐减轻。在繁殖方面, 所有盐度下, 随着棕囊藻丰度的增加, 轮虫的总后代数均相应增加且随后趋于各自稳定的正常值, 最高总后代数出现在20盐度与高食物丰度条件下。极低的食物条件会掩盖盐度的影响, 从而对轮虫的生存繁殖起决定性作用。就发育而言, 食物限制显著延缓了低渗(S=3)和高渗(S=45)环境下轮虫的首次繁殖时间, 但食物资源的增加在一定程度可缓解低渗和高渗环境对轮虫发育带来的负面影响。

不管食物条件如何, 高盐度(S=45)条件下轮虫的存活时间均要显著高于其他4个盐度下轮虫的存活时间。就繁殖情况而言, 轮虫的总后代数最高出现在盐度20条件下, 其次为盐度30, 在盐度45和3下则降低最显著。结合拟合的结果看, 随着盐度升高, 轮虫的寿命延长, 但总繁殖量在25盐度时达到最大后逐步降低。综合生存与繁殖的情况可知, 面对盐度变化, 轮虫的寿命和繁殖之间存在着一定的权衡。这种现象往往出现在生物体面对环境压力时^[20], 例如, 与较高温度(29 ℃)相比, 在16 ℃时萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)的寿命会延长而繁殖力下降^[21]。同样地, 朝鲜臂尾轮虫(Brachionus koreanus)在35盐度下, 轮虫的种群增长显著降低, 但寿命却会有所增加^[22-24]。由此可见, 盐度变化有可能导致轮虫在自我维持的基础代谢率中能量的重新分配, 进而引起轮虫的生命周期参数变化^[24]。以上这种寿命和繁殖之间的权衡同样表现在同一盐度下轮虫面对不同食物丰度时, 且在适宜盐度下表现的更明显。如果外界水环境盐度在适宜范围内, 轮虫会优先将更多的能量分配给繁殖: 具体表现为在盐度20及30时, 随着食物丰度的增高, 轮虫的总后代数则显著增加, 而存活时间会降低。与此不同的是, 在另3个盐度下, 随着食物丰度的增加, 轮虫的寿命会先增加而后才开始降低, 表明在极低或极高盐度下, 轮虫会将能量首先用于生命的延续, 而后用于生殖。轮虫在盐度20及30条件下表现出的寿命和繁殖的高度负相关性, 可能与其在相对适宜盐度下无需过多的能量用于渗透调节有关。先前的研究表明, 尽管在食物良好的情况下, 桡足类Sulcanus conflictus可以在高盐度下存活, 但其生长速率仍会受抑制^[25]。对于像褶皱臂尾轮虫和桡足类S. conflictus这样的广盐性无脊椎动物来说, 其代谢需求往往会随着外界环境与最佳温度和盐度的偏离而逐渐增加, 然后在超出其生理耐受性后迅速下降^[26-27]。如果渗透调节的能量成本很高, 轮虫极有可能在低渗或高渗环境下, 将能量资源从生长转移到渗透调节, 因为其没有足够的能量来同时维持两者, 甚至在短期内, 用于渗透调节的生存会优于生长。此外, 生物体也有可能在生长、繁殖、存活以及渗透调节等方面进行能量的权衡和转移, 这也可以用来解释在应对渗透胁迫时, 所观察到的表观生活史数据的不一致性。

当食物资源限制时, 所有盐度下轮虫的发育成熟时间均明显延长且繁殖受到抑制。也就是说, 在极低的食物条件下, 食物会掩盖盐度的影响而对轮虫的生存繁殖起决定性作用。Hammock等^[18]的研究表明, 当食物充足时, 随着盐度从8升至15, 桡足类Eurytemora affinis的死亡率仅会增加7%, 而当食物丰度减少3.3倍, 其死亡率会从19%增加至65%, 表明食物供应不足会限制桡足类E. affinis的盐度耐受性。我们的研究结果与Hammock等^[18]的研究结果一致。尽管褶皱臂尾轮虫被认为是一种广盐性轮虫, 但低食物丰度仍给各盐度下的轮虫都带来了显著的负面影响, 这会影响其对盐度的耐受性, 但这种限制可随着球形棕囊藻丰度的增加逐步减轻直至恢复各自稳定的正常值。而且, 无论盐度如何, 轮虫的发育时间和总繁殖量在食物丰度达到1×10⁵个/mL后均趋向于最佳状态。也就是说, 即使暴露在次优盐度下, 轮虫发育时间和产后代数的最佳阈值也没有转移到更高的食物水平。由此可见, 当用球形棕囊藻投喂褶皱臂尾轮虫时, 1×10⁵个/mL对轮虫的发育和繁殖而言可能是一个关键的食物丰度。另外, 轮虫发育时间和产后代数的最佳阈值水平对食物丰度的依赖性, 可能主要与物种有关^[28-29]。

增加的食物丰度在一定程度上可以缓解盐度胁迫给轮虫带来的负面效应。例如, 与极低的食物丰度相比, 充足的食物条件使得轮虫在高盐度(S=45)与20盐度下两者的首次繁殖时间差值明显缩短。此外, 在极高和极低盐度下, 随着食物丰度的增加, 能产后代的轮虫数也明显增多。渗透调节所需要的额外能量分配, 会显著降低生物在生长和繁殖等过程中的能量投入^[30], 甚至会降低生物胚胎、幼体或成体的总体生存能力^[31-32]。而充足的食物条件有可能提供给生物部分能量以减轻渗透调节耗能给生物带来的负面影响^[17]。先前的研究已经证明, 充足的食物条件可以降低暴露在高盐环境中的桡足类的死亡率^{[17-18, 33]}, 表明食物资源增加在一定程度上可以增大生物对高盐度的耐受性。在低渗研究方面, 有报道指出^[34], 盐度是限制微咸水物种入侵淡水栖息地的一个主要限制因素, 但高食物丰度可减轻这种限制因素, 食物与盐度的相互作用(食物丰度对盐度的影响)极大地扩大了微咸水物种淡水栖息地的范围。在本研究中, 我们也观察到随着食物丰度的增加, 盐度3下轮虫的发育时间缩短, 总后代数增加。尽管与其他4个盐度相比, 该盐度下轮虫的寿命和繁殖都处于较低水平, 说明极端的低渗环境给轮虫带来了显著的负面影响, 使得轮虫无法通过有效的能量分配增强耐受, 因此, 生物体的寿命和繁殖都相对大幅度减少。与此同时, 也需要指出的是, 食物资源的增加对盐度胁迫的积极影响是有限度的, 食物资源的获得并不能完全掩盖渗透胁迫给轮虫带来的负面影响。例如, 即使是在食物过量的条件下, 处于高盐度环境中轮虫的首次繁殖时间和总后代数也始终要晚于和低于20盐度条件下, 这是由于当食物丰度达到轮虫的摄食饱和丰度时, 轮虫能够获取的食物资源并不会持续增加, 且用于自身生长、繁殖及存活的能量也是恒定的^[35-37]。因此, 鉴于食物资源变化对轮虫盐度耐受性存在复杂效应, 在未来需更全面地考虑其对轮虫耐受其他关键生态因子的影响。

4 结论

本研究表明, 当食物资源限制时, 所有盐度下轮虫的发育成熟时间均明显延长且繁殖受到抑制, 且在极低的食物条件下, 食物短缺会掩盖盐度效应而对轮虫的生存繁殖起决定性作用。盐度的限制效应可随着球形棕囊藻丰度的增加逐步减轻直至恢复各自稳定的正常值。食物资源的增加在一定程度上可以增大生物对低渗和高渗环境的耐受性, 但并不能完全掩盖盐度胁迫给轮虫带来的负面影响。不管食物条件如何, 低渗和高渗环境下轮虫的总后代数和首次繁殖时间均低于或晚于适宜盐度下。在适宜盐度时, 轮虫会优先将更多的能量分配给繁殖；而在极低或极高盐度下, 轮虫会将能量首先用于生命的延续, 而后才用于生殖, 表明面对环境胁迫, 轮虫的寿命和繁殖之间存在着权衡。综上所述, 盐度和食物丰度对轮虫的生活史参数有复杂且显著的交互作用。在进行轮虫的生态生理学相关研究时, 应充分考虑食物丰度对轮虫耐受相关生态因子能力的影响。