2024, Vol. 48
文章信息
- 王雪芹, 李帅欣, 王兴仁, 李开强, 李鹏程, 刘松. 2024.
- WANG Xueqin, LI Shuaixin, WANG Xingren, LI Kaiqiang, LI Pengcheng, LIU Song. 2024.
- 鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂的制备
- Preparation of a fish antimicrobial peptide-chitosan bacteriostatic preservative
- 海洋科学, 48(5): 72-80
- Marine Sciences, 48(5): 72-80.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20231128001
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文章历史
- 收稿日期：2023-11-28
- 修回日期：2024-02-01
2. 青岛科技大学 海洋科学与生物工程学院, 山东 青岛 266042;
3. 崂山实验室 海洋药物与生物制品功能实验室, 山东 青岛 266237;
4. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Qingdao University of Science & Technology, College of Marine Science and Biological Engineering, Qingdao 266042, China;
3. Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Laoshan Laboratory, Qingdao 266237, China;
4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
中国是渔业大国, 水产品总产量和出口量均居世界首位, 在国内渔业生产中, 鱼类产量占比最高。鱼糜制品作为一种新型的水产食品, 其营养丰富, 味道鲜美, 广受消费者喜爱。此外, 鱼糜制品是一类提升低值鱼附加值的产品, 已成为诸多国家水产品加工业的主流, 发展前景广阔, 近年来市场需求不断增长[1]。然而, 鱼糜制品因其温和的加工工艺, 在贮存和运输过程中易腐败变质, 其中微生物是导致腐败的主要因素[2]。因此, 人们研发了多种鱼糜制品保鲜技术, 如高温灭菌、高压技术[3]、脉冲光电技术[4]及冷冻离子技术[5]以达到灭菌的目的。
除上述技术外, 生产厂家还会在鱼糜制品中加入食品添加剂来达到常温保鲜的目的, 例如添加氯化钠、山梨酸钾[6]、苯甲酸钠[7]等保水剂来延长休闲食品的保质期。由于GB2760中未对该类食品添加剂的添加量做明确规定, 近年来关于食品添加剂过量的报道屡见不鲜[8]。例如市售的某品牌即食蟹柳产品, 其中钠含量高达1 520 mg/100 g, 营养素参考值(NRV)高达76%, 且该现象在休闲鱼糜食品生产加工中已成常态。过量添加食品添加剂, 不仅会导致鱼糜产品蛋白组织结构变粗糙, 严重影响产品的色泽和口感, 还会造成食品安全隐患, 危害人体健康[9]。因此, 随着经济发展和科技进步, 寻找安全的、天然的、高效的抑菌保鲜剂应用于鱼糜制品替代传统合成防腐剂的需求越来越大。
目前常见的生物保鲜剂可分为动物源保鲜剂、植物源保鲜剂、微生物源保鲜剂等, 其中动物源保鲜剂如抗菌肽、壳聚糖等都具有良好的抑菌效果[10]。抗菌肽是一种广泛存在于自然界中的具有抗菌活性的多肽, 其作为一种新型的生物防腐剂, 易被人体消化吸收, 且热稳定性强, 无毒副作用[11]。海洋生物因其生物多样性和特殊的生物活性, 成为发掘包括抗菌肽在内的许多生物活性物质的宝库[12]。目前, 研究发现的海洋生物抗菌肽主要来源于海洋鱼类、软体动物、甲壳动物、环节动物和刺胞动物等, 其中海洋鱼类种类繁多, 是抗菌肽的重要来源。海洋鱼类抗菌肽不仅具有广谱抗菌和抗病毒活性、生化稳定性以及不产生耐药性, 还具有独特的适应水生环境及微生物的特异性[13], 近年来, 越来越多的海洋鱼类抗菌肽被学者们发掘, 鱼类抗菌肽在农业、食品工业和医药领域具有成为抑菌剂和治疗剂的潜力。此外, 酶解法因其反应条件温和, 安全无毒副作用, 常用来制备鱼类抗菌肽, 采用酶解技术制备的蛋白酶解液, 因其含有特定的抗菌肽而呈现出较好的抗菌活性。例如, 李远慧等[14]采用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶解法从带鱼鱼糜中获得了抗菌肽, 研究发现其具有较强的抑菌活性和较好的稳定性; 王焙等[15]以鲣鱼暗色肉为原料, 采用酶解法制备了抗菌肽, 结果表明该鲣鱼抗菌肽对大肠杆菌具有较好的抑菌效果; 此外, 还有学者从黄姑鱼[16]、金鲳鱼[17]、黑鲈[18]中均提取到活性较高的抗菌肽。
壳聚糖是一种广泛存在于虾蟹壳中的海洋天然生物聚合物, 作为自然界中存在的唯一的天然阳离子多糖, 已被证实拥有多种生物活性, 如抗氧化活性、抗肿瘤活性、增强免疫力活性、抗菌活性、吸湿保湿性、生物相容性和生物降解性等。关于壳聚糖的抑菌机理理论, 一种说法认为壳聚糖游离的氨基被H+质子化后与菌类细胞壁上带负电荷的磷脂、糖蛋白等结合, 影响细胞正常代谢; 也有说法认为是壳聚糖可以穿透细菌、真菌等细胞壁, 与RNA结合, 干扰细胞新陈代谢[19]。近年来, 关于壳聚糖抑菌活性及其在肉质食品保鲜中的应用研究较多, 研究人员发现壳聚糖对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有较好的杀菌作用, 且壳聚糖在冷却肉中的保鲜效果宜佳。因此, 研究壳聚糖抑菌活性及其在肉类中的应用已成为目前的热点研究方向之一[20]。
综上所述, 本研究将抗菌肽和壳聚糖按一定比例复配, 研发一种新型的即食鱼糜制品抑菌保鲜剂, 并进一步将抑菌保鲜剂应用于新鲜鱼糜中替代传统防腐剂来延长鱼糜的保质期, 该研究在一定程度上满足了广大消费者对食品添加剂安全性的要求, 也为鱼糜制品新产品的研发提供了新思路。
1 材料与方法 1.1 材料新鲜安康鱼采自青岛市水产批发市场, 清洗后采肉搅碎获得鱼糜, 冷藏备用; 壳聚糖1号, 分子量30 kDa, 脱乙酰度≥85%; 壳聚糖2号, 分子量250 kDa, 脱乙酰度≥85%; 壳聚糖3号, 分子量500 kDa, 脱乙酰度=85%; 壳聚糖4号, 分子量1 000 kDa, 脱乙酰度= 70%, 4种壳聚糖均购自于上海麦克林生化科技股份有限公司; 胃蛋白酶(3.0×103 U/g), 木瓜蛋白酶(8.0×105 U/g), 菠萝蛋白酶(6.0×105 U/g), 胰蛋白酶(2.5×105 U/g)购自于索莱宝公司; 大肠杆菌(Escherichia coli)购自于中国科学院微生物研究所; LB肉汤购自于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司; 琼脂粉购自于索莱宝公司; 盐酸、氢氧化钠、冰乙酸均为分析纯。
1.2 仪器与设备高速组织匀浆机(Philips); 恒温水浴摇床, 上海捷呈实验仪器有限公司; 台式冷冻离心机, 上海天美科学仪器有限公司; 真空冷冻干燥机, 华辰仪器有限公司; DHG-9051A型干燥箱, 上海一恒科学仪器有限公司; 旋转蒸发仪, 上海医械专机厂; CBI-180型智能生化培养箱, 上海舍岩仪器有限公司; 超净工作台, 智城分析仪器制造有限公司。
1.3 实验方法 1.3.1 鱼类抗菌肽的制备取30 g安康鱼鱼糜, 按照液固比3∶1加入90 mL去离子水, 恒温水浴达到各蛋白酶最佳酶解温度, 调节pH值, 按照加酶量为1 200 U/g加入蛋白酶, 酶解4 h。之后将酶解液沸水浴灭酶, 调pH值至中性, 4 ℃低温离心(10 000 r/min, 15 min), 取上清液, 冷冻干燥即得鱼类抗菌肽。
1.3.2 菌种活化和传代大肠杆菌菌种(编号: 1.8723), 购买于中国科学院微生物研究所, 菌种经解冻后加入少量LB液体培养基制备菌种悬浮液, 取20 μL菌液至20 mL LB液体培养基, 置于37 ℃活化18~24 h。之后取活化的菌液接种于LB固体培养基, 37 ℃恒温培养24 h, 连续传三代。
1.3.3 抑菌活性的测定采用滤纸片琼脂扩散法测定样本对大肠杆菌的抑菌活性, 实验方法参照文献略作修改[21]。挑取固体培养基中的大肠杆菌菌种, 放入液体培养基中, 制备成浓度为106~107 CFU/mL的菌悬液。取0.1 mL菌悬液在固体培养基上涂布均匀, 用无菌镊子取直径6.0 mm灭菌滤纸片贴于培养皿中, 每皿贴3片, 在滤纸片上滴10 μL的样品溶液, 37 ℃恒温培养24 h, 测定抑菌圈直径大小, 同时用无菌蒸馏水做空白对照。
2 结果与分析 2.1 鱼类抗菌肽的筛选采用抑菌圈法分别测定4种蛋白酶: 胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的酶解产物在不同浓度下对大肠杆菌的抑菌活性, 从图 1可以看出, 在不同浓度下, 菠萝蛋白酶酶解产物对大肠杆菌的抑菌活性最高, 抑菌圈直径分别为(8.50±0.50) mm, (9.17±0.29) mm和(8.83±0.29) mm, 与空白组滤纸片直径6.0 mm相比, 抑菌活性分别提高了41.67%, 52.78%和47.22%, 且菠萝蛋白酶酶解产物在浓度为5.0 mg/mL时, 与其余3种蛋白酶酶解产物的抑菌活性相比较均达到了显著性差异(P<0.05)。何定芬等[22]采用多种蛋白酶水解带鱼鱼糜, 研究发现胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对大肠杆菌的抑菌活性最高, 胰蛋白酶酶解产物对大肠杆菌的抑菌活性最低; Atef等[23]选用多种商业酶水解鲟鱼皮胶原蛋白, 结果表明木瓜蛋白酶酶解产物对大肠杆菌的抑菌活性最高, 而胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解产物均未检测到抑菌活性。图 1结果表明不同蛋白酶酶解产物的抑菌活性不同, 推测可能原因为不同蛋白酶的酶切作用位点不同, 获得的酶解产物的氨基酸组成也不同, 其生物活性也千差万别。本研究将进一步以菠萝蛋白酶制备的鱼类抗菌肽作为研究对象进行实验。
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| 图 1 各蛋白酶酶解产物的抑菌活性 Fig. 1 Bacteriostatic activity of enzymolysis products of each protease 注: 不同字母之间表示差异显著(P<0.05) |
本研究选择了4种不同分子量和脱乙酰度的壳聚糖, 研究其不同浓度下对大肠杆菌的抑菌活性。从图 2可知, 分子量250 kDa, 脱乙酰度≥85%的壳聚糖2号对大肠杆菌的抑菌活性最高, 分子量30 kDa, 脱乙酰度≥85%的壳聚糖1号抑菌活性次之。在不同浓度下, 壳聚糖2号对大肠杆菌的抑菌圈直径分别为(7.87±0.23) mm, (8.17±0.29) mm和(8.33±0.29) mm, 与空白组滤纸片直径6.0 mm相比, 抑菌活性分别提高了31.11%, 36.11% 和38.89%, 且与壳聚糖3号和4号相比, 浓度为1.0 mg/mL的壳聚糖2号对大肠杆菌的抑菌活性达到了显著性差异(P<0.05)。在实验范围内, 脱乙酰度较高的壳聚糖, 抑菌活性较高, 推测可能因为壳聚糖脱乙酰度越高, 裸露的氨基越多, 与大肠杆菌的细胞壁最外层的类脂多糖类物质结合也多, 抑菌活性就越高[24]。程旺开等[25]将脱乙酰度>90%的壳聚糖与聚乙烯醇、柠檬醛复合制备了复合纳米纤维膜, 研究发现其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌作用; 郭雅靖[26]制备了平均分子量为86 kDa, 脱乙酰度>95%的壳聚糖, 与明胶、肉桂精油复配制备抗菌保鲜膜, 研究发现其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显。综上所述, 壳聚糖的分子量和脱乙酰度不同, 其抑菌活性不同[20]。本研究中, 将进一步选择壳聚糖1号和壳聚糖2号进行抑菌实验研究。
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| 图 2 不同种类壳聚糖的抑菌活性 Fig. 2 Bacteriostatic activity of different types of chitosan 注: 不同字母之间表示差异显著(P<0.05) |
分别配制浓度为0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0和5.0 mg/mL的壳聚糖1号和壳聚糖2号溶液, 研究两者在不同浓度下对大肠杆菌的抑菌活性。从图 3可知, 壳聚糖1号和2号对大肠杆菌的抑菌活性并未呈剂量依赖性, 壳聚糖1号在0.5 mg/mL浓度时, 对大肠杆菌有较高的抑菌活性, 抑菌圈直径为(8.33±0.29) mm, 之后随着质量浓度增加呈先降低后升高的趋势, 并最终在5.0 mg/mL浓度时, 抑菌活性达到较高值; 壳聚糖2号在0.25 mg/mL浓度时, 对大肠杆菌有较高的抑菌活性, 抑菌圈直径为(8.40±0.36) mm, 之后随着浓度的增加, 呈不规则变化趋势, 最终也在5.0 mg/mL浓度时, 抑菌活性达到较高值, 本研究中, 两种壳聚糖的抑菌活性均未随着质量浓度的增加而增加, 但也有学者研究发现, 壳聚糖的抑菌活性与质量浓度呈正相关, 随着壳聚糖浓度的升高, 其抑菌活性增加[27]。综上所述, 本研究最终选择0.5 mg/mL壳聚糖1号和0.25 mg/mL壳聚糖2号进行后续实验。
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| 图 3 不同质量浓度壳聚糖的抑菌活性 Fig. 3 Bacteriostatic activity of different chitosan concentrations 注: 不同字母之间表示差异显著(P<0.05) |
前期研究确定了鱼类抗菌肽、壳聚糖1号和壳聚糖2号的最佳抑菌浓度, 为了获得一种新型的抑菌保鲜剂, 我们进一步采用响应面优化实验研究鱼类抗菌肽和壳聚糖的复配浓度, 实验设置每个因素3个水平, 实验因素和水平设计见表 1。
| 实验因素 | 代码 | 编码水平 | ||
| −1 | 0 | 1 | ||
| 鱼类抗菌肽/(mg·mL–1) | A | 2 | 5 | 8 |
| 壳聚糖1号/(mg·mL–1) | B | 0.2 | 0.5 | 0.8 |
| 壳聚糖2号/(mg·mL–1) | C | 0.1 | 0.25 | 0.4 |
响应面实验设计与结果见表 2, 实验结果表明, 在17组实验中, 鱼类抗菌肽-壳聚糖的复配复合物对大肠杆菌的抑菌圈直径范围为7.00~9.67 mm, 不同因素水平下对大肠杆菌的抑菌活性有较大差异。通过Design Expert 12.0软件分析, 得出二次多项回归方程如下:
| $\begin{aligned} Y= & 8.634+0.208\;8 A-0.292\;5 B+0.541\;3 C+1.042\;5 A B \\ & -0.040\;0 A C+0.207\;5 B C+0.163\;0 A^2-0.169\;5 B^2 \\ & +0.243\;0 C^2 .\end{aligned}$ | (1) |
| 编号 | 鱼类抗菌肽 | 壳聚糖1号 | 壳聚糖2号 | 抑菌圈直径/mm |
| 1 | 2 | 0.2 | 0.25 | 9.67 |
| 2 | 8 | 0.2 | 0.25 | 8.17 |
| 3 | 2 | 0.8 | 0.25 | 7.00 |
| 4 | 8 | 0.8 | 0.25 | 9.67 |
| 5 | 2 | 0.5 | 0.1 | 8.50 |
| 6 | 8 | 0.5 | 0.1 | 8.83 |
| 7 | 2 | 0.5 | 0.4 | 9.33 |
| 8 | 8 | 0.5 | 0.4 | 9.50 |
| 9 | 5 | 0.2 | 0.1 | 8.50 |
| 10 | 5 | 0.8 | 0.1 | 7.50 |
| 11 | 5 | 0.2 | 0.4 | 9.50 |
| 12 | 5 | 0.8 | 0.4 | 9.33 |
| 13 | 5 | 0.5 | 0.25 | 8.67 |
| 14 | 5 | 0.5 | 0.25 | 8.50 |
| 15 | 5 | 0.5 | 0.25 | 8.67 |
| 16 | 5 | 0.5 | 0.25 | 8.50 |
| 17 | 5 | 0.5 | 0.25 | 8.83 |
式中Y(mm)代表复配复合物对大肠杆菌的抑菌圈直径, A、B、C分别代表鱼类抗菌肽、壳聚糖1号和壳聚糖2号的编码值。
进一步采用F检验来判定回归方程中各变量对响应值影响的显著性(表 3), 结果表明, 整体模型的“Prob>F”值小于0.000 1, 模型F值等于18.39均表示该二次方程模型高度显著。同时A、B、C、AB对响应面值均有显著性影响(P<0.05), 说明鱼类抗菌肽、壳聚糖1号和壳聚糖2号3个因素及鱼类抗菌肽与壳聚糖1号交互作用对响应面值均有显著性影响。此外, 模型失拟项不显著(P>0.05), 模型决定系数R2 = 0.959 4, 说明该模型方程的拟合程度较好, 预测值与实测值之间具有高度的相关性; 校正决定系数RAdj2= 0.907 2, 表明回归方程(1)有90.72%的抑菌圈直径变异分布在这3个因素中, 说明该模型能够较好地预测和解释实验结果。
| 方差来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 | 显著性 |
| 模型 | 8.37 | 9 | 0.930 3 | 18.39 | 0.000 4 | ** |
| A | 0.348 6 | 1 | 0.348 6 | 6.89 | 0.034 2 | * |
| B | 0.684 4 | 1 | 0.684 4 | 13.53 | 0.007 9 | * |
| C | 2.34 | 1 | 2.34 | 46.32 | 0.000 3 | ** |
| AB | 4.35 | 1 | 4.35 | 85.93 | < 0.000 1 | ** |
| AC | 0.006 4 | 1 | 0.006 4 | 0.126 5 | 0.732 6 | |
| BC | 0.172 2 | 1 | 0.172 2 | 3.4 | 0.107 5 | |
| A2 | 0.111 9 | 1 | 0.111 9 | 2.21 | 0.180 6 | |
| B2 | 0.121 | 1 | 0.121 | 2.39 | 0.166 | |
| C2 | 0.248 6 | 1 | 0.248 6 | 4.91 | 0.062 2 | |
| 残差 | 0.354 1 | 7 | 0.050 6 | |||
| 失拟项 | 0.277 2 | 3 | 0.092 4 | 4.81 | 0.081 8 | |
| 纯误差 | 0.076 9 | 4 | 0.019 2 | |||
| 总和 | 8.73 | 16 | ||||
| 注: *表示差异显著(P<0.05), **表示差异极显著(P<0.01); R2=0.959 4, RAdj2=0.907 2 | ||||||
通过方差分析结果可以看出, 鱼类抗菌肽及壳聚糖1号和2号的添加量对于研究复配复合物对大肠杆菌的抑菌活性均有显著性影响, 此外, 鱼类抗菌肽和壳聚糖1号的交互作用对抑菌活性的影响也达到了显著性。因此, 本研究进一步采用响应面图形来充分说明鱼类抗菌肽、壳聚糖1号和壳聚糖2号3个因素间的两两交互作用, 更直观反映出各个因素变量对抑菌活性的影响。
由图 4可知, 壳聚糖1号添加浓度为0.2 mg/mL时, 随着鱼类抗菌肽浓度的增加, 复配复合物对大肠杆菌的抑菌活性呈下降的趋势, 然而随着壳聚糖1号质量浓度从0.2 mg/mL增加至0.8 mg/mL, 复配复合物的抑菌活性随着鱼类抗菌肽浓度的增加呈显著升高的趋势; 同理, 在鱼类抗菌肽低浓度时, 随着壳聚糖1号浓度的增加, 复配组合物的抑菌活性呈下降的趋势, 然而在鱼类抗菌肽质量浓度为8 mg/mL时, 复配复合物的抑菌活性随着壳聚糖1号浓度的增加呈显著升高的趋势。通过响应面图形分析, 可以看出鱼类抗菌肽和壳聚糖1号的质量浓度高低对复配复合物的抑菌活性影响较大, 两者的交互作用形成的响应曲面起伏较大, 交互作用显著, 与方差分析中AB差异显著的结果相符。
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| 图 4 鱼类抗菌肽和壳聚糖1号对抑菌活性影响的响应面图 Fig. 4 Response surface plot showing the effects of fish peptide and chitosan 1 on bacteriostatic activity |
图 5反映了鱼类抗菌肽和壳聚糖2号的添加浓度对大肠杆菌抑菌活性的影响, 固定壳聚糖2号的浓度, 随着鱼类抗菌肽浓度的增加, 复配复合物的抑菌活性升高, 且在壳聚糖质量浓度为0.4 mg/mL时, 呈显著升高趋势。同理, 固定鱼类抗菌肽的浓度, 复配复合物的抑菌活性随着壳聚糖2号浓度的增加呈显著升高的趋势。通过响应面图形的变化可明显看出鱼类抗菌肽和壳聚糖2号这两个因素在高浓度交互处表现出更高的抑菌活性, 表明两者的交互作用提高了复配复合物的抑菌活性。
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| 图 5 鱼类抗菌肽和壳聚糖2号对抑菌活性影响的响应面图 Fig. 5 Response surface plot showing the effects of chitosan 1 and chitosan 2 on bacteriostatic activity |
图 6反映了两种壳聚糖的添加浓度对大肠杆菌抑菌活性的影响, 壳聚糖2号的添加浓度为0.1 mg/mL时, 随着壳聚糖1号浓度的增加, 复配复合物的抑菌活性缓慢升高, 而在壳聚糖2号质量浓度为0.4 mg/mL时, 复配复合物的抑菌活性随着壳聚糖1号浓度的增加呈显著升高趋势; 同理, 在高浓度的壳聚糖1号添加量时, 复配复合物的抑菌活性随着壳聚糖2号浓度的增加呈显著升高的趋势。图 6的响应面图形变化说明两种壳聚糖的添加量对大肠杆菌的抑制活性具有重要影响, 两者的交互作用促进了复配复合物的抑菌活性。
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| 图 6 壳聚糖1号和壳聚糖2号对抑菌活性影响的响应面图 Fig. 6 Response surface plot showing the effects of chitosan 1 and chitosan 2 on bacteriostatic activity |
通过Design Expert 12.0所建立的数学模型进行参数最优分析, 得到鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂的最佳添加量为: 鱼类抗菌肽7.796 mg/mL, 壳聚糖1号0.716 mg/mL, 壳聚糖2号0.389 mg/mL, 复配得到的抑菌保鲜剂对大肠杆菌的抑菌圈直径为10.19 mm。在此条件下, 重复3次实验, 得到的实际抑菌圈直径为(9.77±0.35) mm, 实际结果与回归模型基本吻合, 具有良好的拟合度, 优化实验结果可靠, 复配得到的抑菌保鲜剂的抑菌活性有较大幅度提高。
2.5 鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂的应用生物保鲜技术是将天然原料中提取的物质应用于食品保鲜中, 是目前最健康、安全和环保的食品保鲜技术。天然生物保鲜剂来源广泛, 且不同的生物保鲜剂其抑菌效果和作用机制也不同。植物源保鲜剂主要通过破坏细胞膜的脂质结构, 膜的完整性和通透性改变, 进而导致细胞死亡。顾伊榕等[28]研究了植物源茶多酚对冷却牛霖肉的保鲜效果, 结果表明, 茶多酚组的菌落总数和挥发性盐基氮含量低于对照组, 说明茶多酚对冷却牛霖肉具有较好的保鲜效果。微生物源保鲜剂主要通过调节细胞膜内的pH值影响细胞活性和通透性, 酸化条件抑制了酶促反应, 导致内部细胞代谢物的泄露, 进而减少微生物增殖[29]。郭瑞等[30]研究了乳酸菌对冷鲜牛羊肉品质的影响, 结果表明, 乳酸菌及其代谢产物可以抑制羊肉中腐败菌的生长繁殖, 羊肉的货架期可延长3 d。
本研究中, 基于响应面优化实验的结果, 我们复配鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂并应用于新鲜鱼糜的抑菌保鲜实验中。以1.0% 的氯化钠为对照, 同时按照壳聚糖与鱼类抗菌肽的复配比例为1∶7制备鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂, 分别将两者添加到新鲜鱼糜中, 观察添加鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂和氯化钠数天后, 新鲜鱼糜的变化情况(图 7)。
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| 图 7 各组鱼糜制品的变化示意图 Fig. 7 Changes in surimi products with each treatment 注: A: 空白无添加组, B: 氯化钠添加组, C: 鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂添加组 |
实验结果表明, 实验第1 d, 添加鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂组和氯化钠组的鱼糜与空白组无差别, 鱼糜颜色均为白色, 无异味。在实验第5 d, 空白组和添加氯化钠组鱼糜颜色变浅黄, 具有明显腐败特性的气味, 添加鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂组鱼糜颜色未有明显变化。在实验第10 d, 各组鱼糜颜色均有明显变化, 其中空白组和添加氯化钠组鱼糜颜色变黄, 有明显质变现象且鱼糜分散, 添加鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂组鱼糜颜色则变浅黄, 具有明显腐败特性的气味, 但鱼糜未见分散现象。综上所述, 依据响应面实验结果复配制备的鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂, 对新鲜鱼糜具有抑菌保鲜作用, 该实验结果也为后续即食鱼糜制品抑菌保鲜剂的研发提供理论依据。
3 结论本研究以安康鱼为研究对象, 采用定向酶解制备鱼类抗菌肽, 研究发现菠萝蛋白酶酶解产物、分子量为30 kDa, 脱乙酰度≥85%的壳聚糖1号和分子量为250 kDa, 脱乙酰度≥85%的壳聚糖2号对大肠杆菌的抑菌活性较高, 采用响应面优化实验确定鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂的最佳添加量为: 鱼类抗菌肽7.796 mg/mL, 壳聚糖1号0.716 mg/mL, 壳聚糖2号0.389 mg/mL, 复配得到的抑菌保鲜剂对大肠杆菌的抑菌圈直径为9.77 mm。将鱼类抗菌肽-壳聚糖抑菌保鲜剂应用于新鲜鱼糜中, 研究发现该抑菌保鲜剂能够延长新鲜鱼糜发生质变的时间, 具有明显的抑菌保鲜作用, 后续可应用于即食鱼糜制品抑菌保鲜剂的开发。
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