2024, Vol. 48
文章信息
- 吴雨萌, 王晶, 张全斌. 2024.
- WU Yumeng, WANG Jing, ZHANG Quanbin. 2024.
- 多功能海藻多糖复合膜的制备及其对UVB诱导的光老化的保护作用
- Preparation of a multifunctional seaweed polysaccharide-based composite film and its protective effects against UVB-induced photoaging
- 海洋科学, 48(7): 33-46
- Marine Sciences, 48(7): 33-46.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20230410002
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文章历史
- 收稿日期：2023-04-10
- 修回日期：2023-04-17
2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋生物与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
皮肤是人体最大的器官, 同时也是覆盖整个人体最外层的器官, 由表皮层、真皮层和皮下组织构成[1]。它具有多种功能, 如覆盖内脏、维持体温、防止水分流失, 并作为一个保护性的物理屏障, 使机体免受外界环境刺激的损害。紫外线是其中一个常见的损害因素, 长期暴露在紫外线(UV)下会加速皮肤的老化, 称为皮肤的光老化[2]。紫外线根据波长可分为3种类型: UVA(320~400 nm)、UVB(280~320 nm)和UVC(100~280 nm)[3]。其中, UVB可以穿透皮肤的表皮层, 造成表皮细胞DNA的损伤和皮肤的氧化压力。UVB辐射也会增加炎症水平和基质金属蛋白酶(MMPs)的表达等[4]。由于臭氧层受到越来越多的破坏, 到达人类皮肤的UVB的比例逐渐增加。所以现在人们普遍认为, UVB是导致皮肤光老化的主要原因[5]。光老化的临床症状主要表现为粗糙的皮肤纹理, 缺水干燥, 皱纹的增多、斑点性色素沉着、蜡黄等[6]。随着人们生活水平的提高和对皮肤年轻化的需求, 光老化的治疗越来越受到关注。
目前, 有一些合成的活性物质用于抗光老化的产品, 但是, 因为其不稳定性和潜在的生物毒性使产品的安全性没有保证。因此, 天然、无毒、绿色、环境友好的抗光老化的活性物质受到越来越多的关注。与植物相比, 海藻由于生活环境的特殊性, 有些海藻长期接受强的紫外线照射, 为了保护海藻免受紫外损伤, 海藻会自动合成很多抗紫外损伤的物质。如海藻多糖、蛋白具有清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)的活性, 具有潜在的抗光老化的性能[7]。低分子量的多糖具有更易吸收、消化等特点, 具有更好的生物活性[8], 并且将多糖复合起来会使其发挥协同作用, 对光老化可以起到更好的修复效果。
褐藻多糖硫酸酯(fucoidan)是一种以岩藻糖为主要成分的硫酸化多糖, 还含有少量的半乳糖、甘露糖等其他单糖, 具有抗氧化和抗炎等多种活性[9]。Kim等[10]的研究发现, 低分子量的fucoidan(LMWF)可以抑制小鼠皮肤皱纹的形成, 减少皮肤炎症, 增加皮肤抗氧化能力, 抑制MMP的表达, 以及抗凋亡作用。我们以前的研究发现, fucoidan可以进一步纯化得到硫酸化杂聚糖(UF)和硫酸化半乳岩藻聚糖(DF)组分, 且具有较高岩藻糖和硫酸盐比例的组分DF可能表现出更强的生物活性[11], 添加DF的复合水凝胶具有促进伤口愈合的能力[12]。海藻酸钠是一种线性多糖, 由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)组成, 通过1, 4-糖苷键连接。海藻酸钠被广泛用于生物医学、化妆品原料和食品生产行业[13]。Hu等[14]发现, 从Sargassum fusiforme中制备的海藻酸盐纯化部分显示出强大的抗光老化活性。它可以减少胶原蛋白降解, 降低体外和体内的氧化应激和炎症反应。褐藻胶寡糖(AOS)是褐藻酸钠的降解产物。由于其分子量低、水溶性高、安全无毒, 具有多种独特的生物活性, 如免疫调节、抗菌、抗氧化、抗糖尿病等[15]。κ-卡拉胶(κ-Car)是红藻细胞壁的主要成分, 它常用于化妆品中, 作为增稠剂, 具有良好的凝胶性、保湿性[16]。因此, 我们猜测将上述3种多/寡糖复合起来会使其发挥协同作用, 对光老化可以起到更好的修复效果。
本研究以低分子量海藻多糖DF和AOS为活性成分, 以κ-Car为基质, 制备了多功能海藻多糖复合敷料——FAC膜, 通过体外理化性质表征及体内抗光老化活性研究来探究其对皮肤光老化的修复作用, 以期为海藻多糖及海藻多糖复合物抗光老化提供一定的理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料海带(Saccharina japonica)于2021年7月在中国荣成海岸采集。海藻酸钠购自青岛明月海藻集团有限公司。κ-Car购自北京华威锐科化工有限公司。HaCaT细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。
胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国Gibco公司; Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)高糖培养基购自美国Hyclone公司; 青霉素和链霉素双抗、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)、胰酶购自北京索莱宝科技有限公司; 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、噻唑蓝(3-(4, 5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-2, 5-di-phenytetrazoliumromide, MTT)试剂、L-岩藻糖标品购自美国Sigma公司; 聚丙烯腈(PAN)购自美国阿拉丁公司; 白介素-6(interleukin 6, IL-6)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α) 酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购自上海酶联公司; 基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3, MMP-3)抗体购自江苏亲科生物有限公司; 羟脯氨酸(HyP)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒购自南京建成生物科技有限公司。使用bicinchoninic acid (BCA)试剂盒测定皮肤组织中的蛋白质浓度。
DF的制备: Fucoidan根据王晶等人的热水提取的方法从Saccharina japonica(Laminariaceae)中提取获得[17]。随后使用抗坏血酸和过氧化氢(30 mmol/L, 1∶1)对fucoidan进行了氧化降解, 经透析、浓缩、乙醇沉降, 沉淀干燥后即得到LMWF。使用DEAE-Sepharose FF离子层析柱进一步纯化LMWF, 用不同浓度的NaCl进行分步洗脱, 其中1.0 mol/L NaCl洗脱得到的组分经透析、浓缩、冻干后得到DF[17-18]。
AOS的制备: 将1 g海藻酸钠溶于50 mL去离子水, 加入4 mg海藻酸钠裂解酶, 在45 ℃下反应20 h。反应结束后将反应液煮沸20 min, 离心, 将上清浓缩、冻干, 即得AOS。
40只雌性昆明小鼠, 5周龄, 体重(32.0±1.7) g。饲养环境: 温度20~25 ℃, 湿度50%~55%, 光照/黑暗周期为12 h, 每周更换3次垫料, 水和食物自由摄取。IACUC批准号为CTEC-2022(01-01)。
1.2 FAC膜的理化性质 1.2.1 κ-Car水凝胶的脱水收缩性质将不同质量的κ-Car溶于去离子水中, 在70 ℃下搅拌30 min使其完全溶解制备1%, 2%和3% κ-Car水凝胶溶液。为选择合适的制胶浓度, 测量它们的脱水收缩性质。分别吸取1 mL的不同浓度的κ-Car水凝胶溶液置于24孔板中, 冷却得到κ-Car凝胶, 将凝胶放在烧杯中, 置于室温下, 分别在不同时间吸取出它们渗出的水, 然后用电子天平称κ-Car水凝胶的质量, 实验重复3次并计算平均值, 根据下式计算其脱水收缩程度:
| $S=\left(W_0-W_t\right) / W_0, $ | (1) |
其中W0为κ-Car水凝胶的初始质量, Wt为κ-Car水凝胶在t时刻的质量。
1.2.2 κ-Car水凝胶的溶胀耐水性将1.2.1制备的1%, 2%和3% κ-Car水凝胶溶液, 分别迅速取出20 mL置于亚克力模具中, 室温下冷却。之后将它们于烘箱中, 45 ℃烘干12 h得到完全干燥的膜, 分别为1%, 2%和3% κ-Car膜。3种膜分别剪取1.0 cm×1.0 cm的大小, 称取质量记为W0, 浸泡在足量的去离子水中, 于25 ℃下静置, 并在不同的时间取出凝胶, 用滤纸轻轻擦干表面多余水分后测量凝胶质量, 记为Wt。根据以下方程计算溶胀比。
| $S=\left(W_t-W_0\right) / W_0, $ | (2) |
其中, W0为κ-Car凝胶的初始质量, Wt为κ-Car凝胶在t时刻的质量。
1.2.3 FAC膜的制备制备3% κ-Car (w/v)水凝胶溶液, 向其中加入1% DF (w/v)和1% AOS (w/v)加热搅拌得到均质的混合水凝胶溶液。迅速取出20 mL置于亚克力模具中, 于室温下冷却制得FAC水凝胶。之后将其置于烘箱中, 45 ℃烘干12 h得到完全干燥的膜, 为FAC膜。
1.2.4 FAC膜的SEM将1.2.3中制备的FAC膜浸于去离子水中0.5 h后, 切成1 cm×0.5 cm×0.5 cm大小置于冻存管中, 用液氮淬冷后将水凝胶掰开形成自然断面。之后冻干, 得到完全干燥的样品。对样品表面和断面喷金3次, 采用扫描电镜(SEM) (Hitachi-S-3400N, Japan)对其微观结构和形貌进行研究。
1.2.5 FAC膜的缓释将1.2.3中制备的FAC膜分别置于pH为4, 6, 8的PBS缓冲液(0.01 mol/L)中, 在37 ℃, 100 r/min摇床上测量FAC膜的缓释性质。分别在不同时刻取2 mL浸泡的溶液作为样品溶液, 并向原体系中补充2 mL相应pH的缓冲液。将样品溶液用0.22 μm的滤膜过滤除杂后测定岩藻糖质量来间接检测FAC膜释放DF的质量。根据下式计算药物的累计释放比。
| $R_c(\%)=\left(6 C_n+\sum C_{n-1} \times 2\right) / m_{\text {drug-loaded }}, $ | (3) |
其中, Cn为第n次取出的样品溶液浓度, mdrug-loaded为样品水凝胶中含有的总岩藻糖质量。
1.2.6 FAC膜的力学性能为了探究膜的使用条件, 对FAC膜进行弹性和黏性的测定。取完整并且厚薄均匀的膜, 裁剪为60 mm× 10 mm大小, 用电子万能拉力试验机测定。分别对膜进行不同的处理——不浸泡, 浸泡在去离子水中3 min和30 min——得到3种状态的膜, 分别命名为FAC膜, FAC膜-3 min, FAC膜-30 min。电子万能测试机设定上下探头间距设为50 mm, 拉伸速度为20 mm/min, 测定膜的断裂伸长率和最大拉力来表征膜的弹性大小。
通过体外的猪皮搭接剪切试实验测试FAC膜的黏性[19]。膜的处理以及电子万能测试机的参数设定与膜的弹性测试实验一致。
1.3 FAC膜对UVB诱导的小鼠皮肤光老化的体内评价 1.3.1 样品制备按照1.2.3制备FAC膜。阳性药选用绽妍(JUYOU)医用修复敷料, 其主要成分为透明质酸钠。
1.3.2 小鼠分组适应性饲养一周后, 将小鼠均分为5组, 分组情况如下。1)正常组: 无UVB照射, 无药物处理; 2)模型组: UVB照射和水处理; 3)JUYOU组(阳性对照组): UVB照射和JUYOU处理; 4)FAC组: UVB照射和FAC膜处理。
1.3.3 UVB照射小鼠腹腔注射1%巴比妥钠进行麻醉, 用脱毛膏脱毛, 脱毛面积为2 cm×2 cm。除正常组外, 其余各组均采用UVB紫外线灯对小鼠背部皮肤每日进行2.9 J/cm2剂量的照射。照射后在模型组、JUYOU组、FAC组小鼠的背部分别使用水、JUYOU敷料和FAC膜处理。FAC膜用药方式为将面积大小为2 cm×2 cm的FAC膜提前在水中浸泡3 min, 之后敷在小鼠背部脱毛区域的皮肤0.5 h。水和JUYOU用药剂量均为25 mg/cm2, 用药时间0.5 h。连续照射2周后模型组小鼠背部皮肤出现明显的发红、起皱、脱皮, 甚至出现局部溃疡, 证明UVB对皮肤的损伤造模是成功的。实验期间, 每3 d记录一次小鼠的体重并用数码相机对小鼠背部的皮肤拍照。最后1 d实验结束时, 用皮肤水分测试仪测量小鼠背部皮肤水分百分比, 基于皮肤的宏观评分表(表 1)[20]对小鼠皮肤宏观状态进行评分。之后小鼠全部脱颈处死, 取背部皮肤, 每一只小鼠的皮肤分为3部分处理。第1部分是用直径6 mm的人体皮肤活检器对皮肤打孔并称量所得皮肤质量。第2部分是用4%多聚甲醛中固定, 时间至少为24 h, 之后进行苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色以及MMP-3的免疫组化(IHC)染色。第3部分是匀浆, 以便进行病理学、抗氧化、抗炎和胶原蛋白形成的分析。
| 评分 | 皮肤外观状态 |
| 0 | 皮肤呈肉色, 皮肤光滑饱满 |
| 0.5 | 皮肤呈肉色, 皮肤轻度粗糙干燥 |
| 1.0 | 皮肤呈肉色, 皮肤轻度粗糙干燥, 少量皱纹 |
| 1.5 | 皮肤出现红斑, 皮肤中度粗糙, 轻度脱皮, 皱纹加深 |
| 2.0 | 皮肤出现红斑, 皮肤明显粗糙, 重度脱皮, 皱纹增多 |
| 2.5 | 皮肤出现红肿溃烂, 皮肤粗糙肥厚明显 |
使用BCA试剂盒测定皮肤组织匀浆中的蛋白质浓度。采用相应的ELISA试剂盒检测皮肤组织中IL-6、TNF-α、HyP、CAT和SOD的浓度。
1.3.5 HE染色和Masson染色对固定好的皮肤组织分别进行HE染色和Masson染色, 观察UVB照射对皮肤组织造成的病理学改变以及胶原沉积情况。对染色组织进行扫描, 从扫描图像中每组随机选取6张进行分析。
1.3.6 MMP-3免疫组化按照Kim等人的方法对固定好的皮肤组织进行MMP-3的IHC染色[10]。对染色组织进行扫描, 从扫描图像中随机选取6张进行分析。
1.4 数据处理采用GraphPad Prism 8.0.2软件对数据进行处理。数据以平均值±标准差(mean values±SD)表示, n≥3。采用方差分析, P < 0.05和P < 0.01分别表示数据具有显著和极显著差异。
2 实验结果 2.1 FAC膜的理化性质 2.1.1 κ-Car水凝胶的脱水收缩性能分析图 1结果中可以看到, 3个浓度的κ-Car水凝胶最后几乎都脱去全部的水分, 所以这种状态下的κ-Car水凝胶并不利于长期储存。但这3种浓度下的失水皱缩状态各不相同, 1%的κ-Car在68 h几乎失去全部水分, 2%和3%的κ-Car在95 h才失去全部水分。这说明2%和3%的κ-Car的保水性能更强, 更不容易脱水皱缩, 并且3% κ-Car在56 h之前的保水性要好于2% κ-Car。
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| 图 1 不同浓度κ-Car的脱水曲线 Fig. 1 Solvent released at different concentrations of κ-Car |
图 2显示的是不同浓度κ-Car的溶胀性结果。在3.3 h时, 3个浓度的κ-Car干膜基本都达到溶胀平衡。其中, 3% κ-Car干膜的溶胀比最小, 为(7.2±0.5) g/g, 1%和2% κ-Car干膜的溶胀比分别为(18.4±0.4) g/g和(14.2±0.6) g/g, 显著高于3% κ-Car干膜的溶胀比(7.2±0.5) g/g。这表明3% κ-Car干膜的抗溶胀性能最好, 更不容易被水破坏结构。实际上, 在1.5 h时, 1% κ-Car水凝胶部分结构已经开始瓦解。
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| 图 2 不同浓度κ-Car的溶胀耐水性曲线 Fig. 2 Swelling resistance curve of κ-Car at different concentrations 注: ** P < 0.01是相较于1% κ-Car; ## P < 0.01是相较于2% κ-Car |
FAC膜的SEM图像显示, 其表面呈现若干山丘状突起并有大小不规则的孔洞, 其内部则具有数量多且不规则的多孔结构(图 3)。小的孔洞直径在100~300 μm之间, 大的孔洞直径在1~3 mm, 孔壁较厚, 并且孔壁上能够观察到小孔。这表明其能够吸收大量的水分, 而这些水分可以提高皮肤的水分百分比。
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| 图 3 FAC水凝胶的SEM图 Fig. 3 SEM image of the FAC hydrogel |
如图 4显示, FAC膜在pH分别为4, 6, 8条件下的释放曲线基本重合, 在2.5 h以内释放较快, 到5 h时基本达到释放平衡。在大约1.7 h时, FAC膜在3个pH下的累计释放率基本都达到50%。在19.5 h时, 达到最大累计释放率, 释放率接近100%。在pH为6条件下, FAC膜有释放更快的趋势, 但3个pH下的释放率并无显著性差异。说明FAC膜在不同pH环境下具有释放稳定性, 其释放率大小受pH的影响较小。
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| 图 4 FAC膜在不同pH下的FPS缓释曲线 Fig. 4 FPS slow-release curve of the FAC film at diverse pH values |
为进一步探究FAC膜在水溶液中的释放机理, 选择一级模型(First-order models)、Higuchi动力学模型、Korsmeyer-Peppas动力学模型这3种模型对FAC膜释放曲线进行动力学的拟合[21]。不同pH下的FAC膜在水溶液中的释放动力学见表 2。由表 2可知, FAC膜在水溶液中的释放模型是Korsmeyer-Peppas动力学模型(r2为0.975 0~0.989 0)。其公式如下:
| $ M_t / M_{\infty}=k t^n, $ | (4) |
| 介质pH | R2 | n | ||
| Higuchi | First-order | Korameyr-Peppas | ||
| 4 | 0.755 6 | 0.770 6 | 0.987 6 | 0.235 4 |
| 6 | 0.796 8 | 0.820 3 | 0.975 0 | 0.252 8 |
| 8 | 0.772 9 | 0.766 8 | 0.989 0 | 0.243 0 |
其中, k指的是释放速率常数, n指的是扩散指数。
FAC膜在水溶液的释放指数n均小于0.5, 根据表 3推断出其缓释机理是符合Fick扩散定律的。
| 缓释机理 | R2 | ||
| 厚片模型 | 圆柱模型 | 球状模型 | |
| 溶蚀传质 | > 1.0 | > 0.89 | > 0.85 |
| 不规则扩散 | 0.5~1.0 | 0.45~0.89 | 0.49~0.85 |
| Fick扩散 | < 0.5 | < 0.45 | < 0.43 |
FAC膜的弹性和黏性结果如表 4。FAC膜浸泡在去离子水中的时间长短影响的是FAC膜中的水分百分比。FAC膜-3 min的断裂伸长率(202.50±32.19)%, 显著高于FAC膜, 但是能承受的最大拉力显著低于FAC膜, 说明一定的水分添加能够提高膜的弹性, 有利于膜在皮肤表面的伸展收缩, 但会降低膜能承受的最大拉力, 使得膜较易断裂。而FAC膜-30 min因为脆性大, 未测得断裂伸长率和最大拉力。黏性测试结果显示, FAC膜-30 min的黏性为(0.20±0.02) N, 显著低于水分百分比更少的FAC膜-3 min, 而FAC膜则几乎没有黏性, 说明, 一定量的水分有利于提高FAC膜的黏性。所以, FAC膜弹性和黏性结果来看, FAC膜-3 min, 即FAC膜在去离子水中浸泡3 min的黏性和弹性均表现较好的结果。
| 处理 | 测试项目 | ||
| 断裂伸长率/% | 最大拉力/N | 黏性/N | |
| FAC膜 | 159.30±14.35** | 4.91±0.44** | ND |
| FAC膜–3 min | 202.50±32.19 | 1.02±0.53 | 0.34±0.03 |
| FAC膜–30 min | ND | ND | 0.20±0.02** |
| 注: ND表示未测得; ** P < 0.01是相较于FAC膜–3 min | |||
小鼠14 d内的体重变化情况如图 5所示, 模型组、JUYOU组及FAC组的小鼠在第14 d的体重均显著低于正常组, 表明UVB照射可能会在一定程度上造成小鼠体重的下降。但UVB照射的各组小鼠之间体重无明显差异。
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| 图 5 小鼠的体重变化 Fig. 5 Changes in the body weight of mice 注: * P < 0.05和** P < 0.01均相较于正常组 |
第1 d各组的小鼠背部皮肤光滑、细腻、柔软, 呈浅粉色, 可见皮下血管。最后1 d正常组小鼠皮肤颜色变浅, 可见皮下血管但不清晰, 而模型组的背部皮肤硬化、干燥、颜色变浅、皱纹增多, 出现红斑, 甚至溃疡等光老化的相关症状。与模型组相比, JUYOU组以及FAC组小鼠背部皮肤状态明显改善, 泛红和皱纹明显减少, 皮肤呈现轻度干燥状态(图 6a)。
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| 图 6 皮肤宏观评价及水分测定 Fig. 6 Macro evaluation and determination of moisture percentage of the skin 注: ** P < 0.01是相较于正常组; ## P < 0.01是相较于模型组 |
皮肤宏观评分标准表对小鼠背部皮肤进行评分。得分越高, 表明皮肤状况越差, 受损程度越深。图 6b显示模型组评分显著高于正常组, 说明在UVB照射条件下, 小鼠背部皮肤屏障被破坏, UVB损伤模型成功建立。JUYOU组评分也显著高于正常组的且与模型组间无显著性差异, 说明JUYOU对皮肤整天状态的改善效果一般, 而FAC组评分显著低于模型组的且与正常组无显著性差异, 表明FAC膜的使用可提高皮肤屏障对UVB照射的抵抗能力。
2.2.3 小鼠皮肤质量取直径为6 mm的小鼠背部皮肤组织称量皮肤质量。UVB照射会引起皮肤组织厚度的增加[10]。正常组、模型组、JUYOU组及FAC组各组小鼠的皮肤质量分别为(26.4±7.8) mg、(41.4±6.2) mg、(35.1±3.8) mg、(30.7±3.6) mg和(31.7±3.8) mg。与正常组小鼠皮肤质量相比, 模型组的皮肤质量显著增加, 而分别使用JUYOU和FAC膜的小鼠皮肤质量则显著降低, 并且两组之间无显著性差异(图 6c), 说明FAC膜处理能减少UVB照射引起的皮肤组织的增厚且效果与阳性药无显著差异。
2.2.4 小鼠皮肤含水量皮肤含水量反映了皮肤的屏障能力。当皮肤暴露在UVB的伤害下, 皮肤水分百分比下降, 容易出现干燥、脱皮和皱纹的症状。UVB照射14 d后, 小鼠背部皮肤水分百分比测量结果如图 6d所示。正常组皮肤水分百分比为(27.2±4.4)%, 而模型组皮肤水分百分比下降至(13.7±2.8)%, 说明UVB照射后皮肤水分丧失严重。JUYOU组和FAC组的皮肤水分百分比分别为(20.6±0.5)%和(20.2±2.9)%且两者之间无显著差异, 说明JUYOU和FAC膜均能有效提高皮肤水分百分比, 缓解UVB照射引起的皮肤干裂问题。
2.2.5 皮肤抗氧化酶持续暴露于UVB照射下可导致细胞内ROS水平升高, 进而导致氧化还原系统的不平衡。图 7a显示, 正常组和模型组CAT浓度分别为(30.1±8.3) U/mgprot和(14.7±3.7) U/mgprot, 模型组较正常组CAT浓度显著下降。JUYOU和FAC膜处理后CAT浓度均显著升高, 约为模型组的1.3倍和2.1倍, FAC膜表现出比阳性药更好的提高抗氧化酶CAT的效果。图 7b显示, 正常组SOD浓度为(10.5±1.0) U/mgprot, UVB照射后的模型下降至(5.8±0.8) U/mgprot, 而JUYOU和FAC膜处理后SOD浓度均显著升高。实验结果说明UVB照射显著降低了皮肤中CAT和SOD两种还原酶的活性, 而FAC膜则可以显著提高两者的活性, 从而提高皮肤的抗氧化能力。
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| 图 7 小鼠背部皮肤组织中的抗氧化酶浓度 Fig. 7 Concentration of antioxidant enzymes in the dorsal skin tissue of mice 注: * P < 0.05和** P < 0.01是相较于正常组, ## P < 0.01是相较于模型组 |
UVB照射可引起皮肤炎症的增加。图 8显示, 正常组中IL-6、TNF-α两种促炎因子的表达量分别为(35.4± 1.5) pg/mgprot和(190±12.3) pg/mgprot, 模型组IL-6、TNF-α表达明显升高, 分别为(43.2±1.5) pg/mgprot和(224.4±9.7) pg/mgprot。JUYOU和FAC膜处理后均可显著降低这两种促炎因子的表达, 降低皮肤炎症反应, 且两者之间无明显差异。
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| 图 8 小鼠背部皮肤组织中的炎症因子浓度 Fig. 8 Concentration of inflammatory factors in the dorsal skin tissue of mice 注: ** P < 0.01是相较于正常组, ##P < 0.5和##P < 0.01是相较于模型组 |
对背部皮肤组织进行HE染色并测量表皮和真皮的厚度, 结果如图 9所示, 正常组小鼠表皮和真皮厚度分别为(22.0±3.9) μm和(104.1±10.4) μm, 经UVB照射后的模型组分别增加至(106.1±9.4) μm和(402.2±33.7) μm, 与正常组相比分别增厚约4.8倍和3.9倍。而JUYOU处理使得表皮和真皮厚度分别下降为(51.4±7.0) μm和(297.6±17.5) μm, FAC处理分别下降为(68.7±6.8) μm和(271.6±12.5) μm。两者相比, JUYOU对表皮层的厚度的降低有更明显的效果。总的来说, JUYOU和FAC膜都能显著的减少UVB照射引起的小鼠背部表皮和真皮的增厚。
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| 图 9 小鼠背部皮肤HE染色结果 Fig. 9 Results of HE staining of the mice dorsal skin 注: 背部皮肤表皮(黑色线)和真皮(红色线)厚度计算为6个不同部位的平均值。所有图像的比例尺均为50 μm。** P < 0.01是相较于正常组, ## P < 0.01是相较于模型组 |
皮肤真皮层胶原蛋白数量是光老化过程中皮肤损伤程度的重要指标。UVB照射导致MMP-3等MMPs的增加, 进而导致胶原蛋白的降解[22]。对小鼠背部皮肤进行免疫组化染色检测MMP-3变化, 并用Image J软件计算。图 10a所示, 正常组背侧皮肤可见MMP-3免疫反应性。与正常组比较, 模型组MMP-3免疫反应性升高。而JUYOU组、FAC组小鼠皮肤MMP-3免疫反应性降低。然后用Image J软件估算MMP-3相对数量, 结果如图 10b所示。模型组MMP-3相对表达量较正常组升高约2.5倍, 而JUYOU和FAC组仅分别升高约1.6和1.5倍。说明UVB照射可引起皮肤MMP-3相对表达量的升高, 而JUYOU和FAC膜可使其有效降低。
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| 图 10 小鼠背部皮肤MMP-3免疫组化染色结果及HyP浓度 Fig. 10 Results of MMP-3 immunohistochemical staining and HyP concentrations in the dorsal skin of mice 注: 图(a)中红色箭头指示被染色的MMP-3, MMP-3指基质金属蛋白酶-3。图(b)中胶原蛋白相对表达量为各组胶原蛋白表达量与正常组的比值。图(b)和图(c)中* P < 0.05和** P < 0.01是相较于正常组, # P < 0.05和## P < 0.01是相较于模型组, HyP为羟脯氨酸 |
如前所述, MMPs表达的增加会加速胶原蛋白降解。HyP是胶原蛋白的特征氨基酸, 其浓度可以间接反映胶原蛋白的数量, 进而显示皮肤光老化程度[23]。用ELISA试剂盒测定小鼠皮肤组织中HyP浓度, 结果显示UVB照射的确导致HyP浓度的显著下降, FAC膜处理能显著抑制UVB照射对HyP的降解(图 10c)且效果优于阳性对照组。
为了进一步直观地显示胶原蛋白的变化, 我们使用Masson染色对小鼠背部皮肤进行染色。结果如图 11a显示, JUYOU组和FAC组与模型组的染色图像相比, 蓝色更深, 说明胶原沉积更密集。Image J对其表达量进行估算结果如图 11b所示, 模型组小鼠皮肤胶原纤维相对表达量较正常组显著下降, 但在JUYOU和FAC膜处理的小鼠皮肤中显著增加, 两者无显著差异, 并且其在正常组与FAC膜处理组之间也无明显差异, 说明FAC膜的使用能很好地增加皮肤中胶原蛋白的相对表达量。
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| 图 11 小鼠背部皮肤胶原蛋白染色结果 Fig. 11 Results of collagen staining of the dorsal skin of mice 注: 图(a)中黑色尖箭头指示染色的胶原蛋白, 图(b)中胶原蛋白相对表达量为各组胶原蛋白表达量与正常组的比值, ** P < 0.01是相较于正常组, # P < 0.05和## P < 0.01是相较于模型组 |
光老化涉及皮肤屏障受损、炎症、氧化和胶原蛋白降解等多个方面, 导致皮肤粗糙、干燥、松弛、皱纹加深和色素沉着等各种问题。因此, 光老化需要一种多功能的复合产品。海藻多糖具有多种生物活性, 例如fucoidan, 一种存在于褐藻中的复杂硫酸多糖, 具有抗氧化、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗癌等多种药理作用[9, 24]。与分子量约为20 000 kDa的高分子量fucoidan不同, 分子量小于10 kDa的LMWF由于其高吸收和生物利用度而显示出更多的生物活性[24]。海藻酸盐是一种多醛酸糖, 由于其独特的理化性质和有益的保健作用, 已广泛应用于制药和食品工业。相与同单体的高分子量海藻酸盐相比, AOS通常具有更短的链长, 从而提高了水溶性。除此之外, AOS还具有独特的生物活性, 对健康具有积极的影响[15]。AOS也比海藻酸盐更容易被生物体吸收、消化和利用[8]。所以我们为了获得更好的活性, 基于fucoidan和褐藻酸钠, 通过氧化降解和酶解的方式获得了分子量更低的DF和AOS作为活性成分。
κ-Car常作为化妆品中的增稠剂, 具有良好的保湿性, 我们通过κ-Car水凝胶的脱水收缩和溶胀耐水性质测试选择不易脱水和耐水性强的3% κ-Car作为基质。添加1%的DF和AOS制备成均一的混合水凝胶。通过SEM观察FAC水凝胶的微观结构, 结果显示其具有大而不规则的孔洞, 壁厚, 表明其可能具有良好的吸水和保湿能力。为了方便储存和运输, 将FAC水凝胶进一步烘干得到FAC膜。通过缓释和力学性能的实验来检测FAC膜药物释放特性和与皮肤的黏合性。DF缓释表明FAC膜在不同pH环境下具有释放稳定性, 缓释机理符合Fick扩散定律。力学性能测定结果表明FAC膜-3 min, 即FAC膜在去离子水中浸泡3 min的黏性和弹性均表现较好的效果, 便于使用。
在动物实验中, FAC膜和JUYOU处理均显著增加了皮肤含水量, 减少UVB照射引起的表皮和真皮的厚度增加, 效果与阳性对照相当。JUYOU具有修复皮肤屏障的功效, 其主要成分为透明质酸钠, 它是一种黏多糖, 具有极好的保湿作用, 是目前化妆品中最常用的保湿成分。这说明FAC膜的使用能很好地改善UVB照射引起的皮肤水分丧失, 修复皮肤屏障。UVB可以通过促进嘧啶-嘧啶二聚体的形成和生成ROS来改变DNA[25]。人体拥有一个抗氧化防御系统网络, 以抵消抗氧化应激和维持细胞内氧化还原稳态。抑制抗氧化酶活性会降低人体内源性抗氧化能力, 一方面使得皮肤更容易受到ROS的攻击, 另一方面导致ROS在皮肤中进一步积累, 从而引起DNA、蛋白质和脂质受到严重的氧化损伤[26]。体内实验中, FAC膜处理后的小鼠皮肤具有更高的CAT和SOD活性, 且在提高CAT活性方面优于阳性对照。因此, 在抗氧化方面, FAC膜利于保护皮肤抗氧化系统, 可作为治疗光老化的潜在治疗剂。
ROS的产生和抗氧化防御系统之间的不平衡可以通过复杂的途径引起皮肤炎症。其机制是UVB照射引起皮肤自由基过量产生, 激活下游NF-κB通路, 诱导成纤维细胞和角质形成细胞产生促炎因子IL-6和TNF-α, 导致炎症反应增加[27]。因此, 抑制炎症因子IL-6和TNF-α等炎症信号通路是预防炎症的主要选择。本研究结果显示, 与正常组相比, UVB照射可使模型组TNF-α水平升高17%, 而IL-6水平升高高达22%。在相同的照射条件下, 用FAC膜处理后IL-6和TNF-α的表达降低至正常组水平, 效果与阳性药JUYOU无显著性差异, 而JUYOU具有修复皮炎湿疹的功效, 并且有研究结果表明, 透明质酸钠具有降低角质形成细胞中促炎因子IL-1α及TNF-α表达的作用[28]。所以这些结果表明, FAC膜可能作为一种新型抗炎治疗剂用于治疗光老化。
胶原蛋白是ECM和结缔组织中的主要不溶性纤维蛋白。它可以赋予皮肤弹性和力量。当皮肤暴露于UVB辐射时, 胶原蛋白的分解增加, 这与皱纹的形成密切相关[10]。本文通过Masson染色和HyP浓度测定也证实了这一点, 结果显示UVB促进皮肤胶原蛋白降解, 而FAC膜显著抑制胶原蛋白降解。UVB照射导致的MMPs分泌增加也与皱纹的形成密切相关。MMP-3是MMPs中的一种, 被称为基质溶血素-1, 可降解大量的ECM蛋白, 如明胶、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅸ型和Ⅹ型胶原蛋白、层黏连蛋白、纤连蛋白-1、纤维连接蛋白和蛋白聚糖。MMP-3的主要作用是促进MMP-1(Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原降解)、MMP-7 (弹性蛋白降解)和MMP-9(Ⅳ型胶原降解)的MMPs激活[29]。在本研究中, 我们发现经过UVB照射的小鼠背侧皮肤MMP-3表达比未经UVB照射的高约2.5倍, 而JUYOU和FAC膜处理仅分别升高约1.6和1.5倍。这些结果表明, FAC膜可以有效抑制胶原蛋白降解, 下调MMP-3的表达, 具有抗皱应用潜力。
总的来说, 从FAC膜的修复皮肤屏障、抗氧化、抗炎和抑制胶原蛋白降解特性来看, 它们可以作为一种潜在的光老化治疗方法, 而且它们具有良好的保湿性能。并且从患者依从性的角度来看, 该产品还具有易于使用, 依从性高的优点。
4 结论本文以fucoidan、海藻酸钠为原料制备了两种海藻多糖衍生物DF和AOS。以它们为活性成分, 以κ-Car为基质制备了海藻多糖复合敷料——FAC膜, 对其进行理化性质的表征及体内抗光老化活性的研究。理化性质研究结果表明, FAC膜具有较好的黏性和弹性, 便于其在皮肤表面的使用。活性成分DF在不同pH环境下可以稳定且缓慢地释放, 缓释机理符合Fick扩散定律, 有利于FAC膜发挥长效作用。体内实验结果表明, FAC膜能显著改善小鼠皮肤屏障功能, 增强小鼠皮肤抗氧化酶的活力, 抑制促炎因子的表达, 抑制胶原蛋白的降解。
综上所述, FAC膜具有良好的理化性质和生物活性, 并且能修复皮肤屏障, 从抗氧化、抗炎以及抑制胶原蛋白降解3个方面来修复皮肤的光老化损伤。研究结果为海藻多糖及海藻多糖复合物抗光老化研究提供了一定的理论基础。
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