溶解有机质(DOM)是一种复杂的脂肪族和芳香族混合物, 广泛存在于各种自然水体中^[1]。DOM的生产、消耗、运输对全球海洋碳循环具有重要影响。同时, DOM具有丰富的官能团, 可以与金属离子配位形成配位化合物, 影响金属离子的形态^[2-3], 而金属离子的毒性、迁移转化和生物利用性受其形态控制^[4]。金属离子在环境中具有持久性和不可降解性, 能通过海洋生物, 在食物链累积、富集, 对人类健康造成危害^[5-6]。因此研究水体中DOM和金属离子的配位对理解金属离子在水体中的生物地球化学行为, 以及防范金属离子的环境危害都具有重要意义。

目前对DOM与金属离子配位的研究主要集中在不同环境中DOM与金属离子配位, 通过红外光谱、核磁共振分析等技术揭示DOM与金属离子配位的分子机制^[7-8]。但这些方法对目标金属和DOM的浓度要求较高且制样过程中会改变DOM的结构, 而DOM的化学组成和结构是决定其与金属离子配位的关键因素^[9]。三维荧光光谱结合平行因子法(EEM-PARAFAC)能将复杂的DOM识别成独立的荧光组分, 同时操作简单, 对DOM的结构没有损害。Zhao等^[10]利用三维荧光光谱和紫外可见光谱研究了城市土壤中DOM与金属离子Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺的配位作用; 于振亚等^[11]研究了道路雨水径流DOM与重金属离子Cu²⁺、Pb²⁺、Cd²⁺的配位。另外, 环境因素对配位作用产生较大的影响, 如pH^[12]、温度^[13]、共存离子^[14]等。现有研究结果表明, 不同环境来源的DOM所含的官能团不同, 地下水DOM^[15]、湖水DOM^[16]以及河水DOM^[17]与金属离子配位目前已有相关研究报道, 但海水DOM与金属离子配位的研究仍未见报道。

作为人类重要的活动聚集区和海洋渔业分布集中地, 近岸海域DOM含量丰富且来源途径多样^[18-19]。人类的活动能造成水体中的金属污染, 并和海洋渔业一起能导致水体中缺氧现象的出现^[20]。缺氧能造成鱼类死亡, 导致海洋生物多样性的丧失^[21]。但目前的研究中, 缺乏水体中溶解氧对DOM与金属离子配位影响的研究。舟山海域临近长江口和杭州湾, 是人口聚集地和著名的渔业养殖地。Cu²⁺、Fe³⁺、Pb²⁺是水体中常见的重金属离子。因此本文通过紫外可见光谱、三维荧光光谱结合平行因子法, 以及荧光猝灭滴定研究舟山近岸海域DOM与Cu²⁺、Fe³⁺和Pb²⁺三种金属离子的配位机制, 并深入研究海水中溶解氧对配位作用的影响。为沿海人类聚集地的金属污染防治以及海洋渔业的重金属控制提供指导意义。

1 材料与方法 1.1 实验材料和仪器

海水(取自浙江舟山); FeCl₃(购于阿拉丁试剂公司, 分析纯); CuSO₄(购于上海振欣试剂厂, 分析纯); PbCl₂(购于阿拉丁试剂公司, 分析纯); 0.7 μm GF/F滤膜(购于沃特曼公司); 超纯水; 超纯氧气; 超纯氮气。

电子天平; 超声波清洗器; SCJ-10真空抽滤泵; 氮吹仪; YSI多参数水质分析仪; 雷磁PHS-3E pH计; Apollo SciTech总溶解性无机碳分析仪; 岛津TOC-L总有机碳分析仪; Thermo Fisher离子色谱; Thermo Fisher离子特异性测量仪; Thermo Fisher Evolution-300紫外可见分光光度计; 日立F-7100三维荧光仪。

1.2 样品采集及测定

海水样品于2023年3月1日取自浙江舟山本岛(29°59'37.7"N, 122°09'39.6"E)。采样过程中, 所有玻璃器皿均在450 ℃灼热5 h进行预清洁。

样品使用抽滤泵经预先灼烧(450 ℃, 5 h)过的0.7 μm GF/F滤膜过滤, 所得滤液即为实验用海水, 然后保存至4 ℃冰箱里。

海水样品基本理化参数如表 1所示。实验样品均来自同一批水样, 各参数在实验中保持一致。

海水样品的DIC使用Apollo SciTech总溶解性无机碳分析仪测定, DOC使用岛津TOC-L总有机碳分析仪测定, Ca²⁺、Mg²⁺浓度使用Thermo Fisher离子色谱测定, Fe³⁺、Cu²⁺、Pb²⁺使用Thermo Fisher离子特异性测量仪测定。

1.3 荧光猝灭滴定

分别将CuSO₄、FeCl₃、PbCl₂与超纯水配置成浓度为6×10^–2 mol/L、6×10^–3 mol/L、6×10^–3 mol/L的离子母液保存。

将过滤后海水注入65 mL规格棕色试剂瓶中, 棕色试剂瓶同样经过预清洁(450 ℃, 5 h), 每瓶注入海水60 mL。

用移液枪分别量取0~0.1 mL间隔0.01 mL的离子母液以及0.1~1 mL间隔0.1 mL的离子母液注于呈有海水的棕色试剂瓶中, 配成不同离子浓度的混合液, 共计20瓶。因海水体积远大于滴加离子溶液体积, 因此滴入的离子溶液体积忽略不计。

将加入离子后的溶液用密封膜封口盖好, 置于避光条件下振荡24 h, 待配位完成。富氧条件的海水需在离子滴加前用氮吹仪向海水中通入超纯氧气20 min, 缺氧条件的海水需在离子滴加前用氮吹仪向海水中通入超纯氮气20 min, 常氧条件海水不做通气处理。

使用水质分析仪测得富氧条件的氧浓度高于40 mg/L, 常氧条件的氧浓度范围为: 6.96~7.16 mg/L, 缺氧条件的氧浓度范围为: 1.63~1.81 mg/L。

配位完成后, 分析样品的紫外吸光度及三维荧光光谱。

1.4 紫外和三维荧光测量

紫外可见光谱的测定使用Thermo Fisher Evolution-300紫外可见分光光度计, 扫描范围为200~800 nm, 用超纯水作为背景值。通过减去700~800 nm处吸光度的平均值来进行基线校正^[22]。

使用日立F-7100三维荧光仪扫描样品的三维荧光图谱。激发波长范围200~450 nm, 间隔5 nm, , 发射波长范围210~600 nm, 间隔2 nm, 激发电压700 V, 激发光、发射光狭缝宽度5 nm。通过减去超纯水的背景值进行拉曼光谱校正^[23]。

1.5 条件稳定常数计算

本实验通过修正的Stern-Volmer荧光猝灭模型来拟合DOM与金属离子配位的条件稳定常数。该模型假设金属离子与配体以1︰1的比例相结合形成配位化合物, 并根据荧光强度变化与金属离子浓度的非线性关系估计未猝灭荧光团的相对比例。

修正的Stern-Volmer碰撞猝灭理论方程:

$\frac{F_0}{F_0-F}=\frac{1}{f \cdot K_{\mathrm{M}} \cdot C_{\mathrm{M}}}+\frac{1}{f} .$

(1)

F为离子浓度为C_M时的荧光强度, F₀为初始荧光强度, C_M为滴加离子浓度, K_M为条件稳定常数, f为参与配位的荧光团的比例^[24]。

1.6 数据处理及计算

荧光组分识别使用EEM-PARAFAC方法通过Matlab中的DOMFluor工具包进行^[25]。该方法将三维荧光数据建模为一组三线性项和一个残差数组:

$ x_{i j k}=\sum\limits_{f=1}^F a_{i f} b_{j f} c_{k f}+\varepsilon_{i j k} i=1, \ldots, \mathrm{I} ; j=1, \ldots, \mathrm{~J} ; k=1, \ldots, \mathrm{K}, $

(2)

其中x_ijk为第i个样品在发射波长为j, 激发波长为k处的荧光强度, f为模型中的组分数。ε_ijk是模型无法解释的残差项。a_if与第i个样品中荧光团的的浓度呈线性相关, b_jf与发射波长为j的荧光量子效率呈线性相关, c_kf与激发波长为k的比吸收系数呈线性相关。通过使用交替最小二乘法将三维数据的残差平方和最小化, 得到最合适的组分数, 并将所得荧光组分与OpenFlour中的对比^[26]。

腐殖化指数SUVA₂₅₄是吸收系数a₂₅₄与DOC的比值, 单位为L·mg^–1·m^–1[27]。吸收系数a₂₅₄通过以下公式计算^[28]:

$ a_\lambda=2.303 A_\lambda / L, $

(3)

其中A为吸光度, L为光程, λ为对应光的波长。

荧光指数FI、BIX、HIX分别通过以下公式计算^[29-31]。

$ \mathrm{FI}=\frac{F_{E_{\mathrm{x}}=370 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=450 \mathrm{nm}}}{F_{E_{\mathrm{x}}=370 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=500 \mathrm{nm}}},$

(4)

$ \text { BIX }=\frac{F_{E_{\mathrm{x}}=310 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=380 \mathrm{nm}}}{F_{E_{\mathrm{x}}=310 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=430 \mathrm{nm}}}, $

(5)

$ \mathrm{HIX}=\frac{S_{E_{\mathrm{x}}=255 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=434 \sim 480 \mathrm{nm}}}{S_{E_{\mathrm{x}}=255 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=300 \sim 346 \mathrm{nm}}}. $

(6)

E_x代表激发光波长, E_m代表发射光波长, $F_{E_{\mathrm{x}}=370 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=450 \mathrm{nm}}$为激发光波长370 nm发射光波长450 nm时的荧光强度, $F_{E_{\mathrm{x}}=370 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=500 \mathrm{nm}}$为激发光波长370 nm发射光波长500 nm时的荧光强度, $ F_{E_{\mathrm{x}}=310 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=380 \mathrm{nm}}$为激发光波长310 nm发射光波长380 nm时的荧光强度, $F_{E_{\mathrm{x}}=310 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=430 \mathrm{nm}}$为激发光波长310 nm发射光波长430 nm时的荧光强度, $ S_{E_{\mathrm{x}}=255 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=434 \sim 480 \mathrm{nm}}$为激发光波长255 nm发射光波长434~480 nm的荧光强度积分值, $S_{E_{\mathrm{x}}=255 \mathrm{nm}, E_{\mathrm{m}}=300 \sim 346 \mathrm{nm} }$为激发光波长255 nm发射光波长300~346 nm的荧光强度积分值。

K_M值的计算使用Matlab中的Curve Fitting APP进行拟合。

相关性分析图及荧光猝灭曲线使用origin 2023b绘制。

2 结果与讨论 2.1 近岸海域DOM荧光组分

通过三维荧光结合平行因子法(EEM-PARAFAC)对舟山近岸海域海水样品进行分析, 其DOM中区分出4种荧光组分, 包括2种类腐殖质组分(C1, C2), 2种类蛋白质组分(C3, C4), 如图 1所示。C1组分荧光峰的位置为E_x/E_m: 325nm/398 nm, 位于C峰和M峰交叉区域, 是一种类腐殖质溶解有机质, 其来源与海洋微生物活动有关^[32]。C2组分荧光峰的位置为E_x/E_m: 360 nm/454 nm, 属于典型的C峰, 是紫外-可见光波段的类腐殖质溶解有机质, 来自陆源输入^[32]。C峰类的DOM通常被认为来源于植物降解, 因此具有较高的芳香度, 其存在也被认为与DOM中的苯环、羰基等官能团有关^[33]。陆源来源的腐殖质通常比海洋类腐殖质具有较高的芳香度^[34], 因此C2组分会比C1组分腐殖化程度更高。C3组分荧光峰的位置为E_x/E_m: 280 nm/320 nm, 位于B激发峰, 类蛋白质溶解有机质, 类酪氨酸组分, 来自海源自产^[34]。C4组分荧光峰的位置为E_x/E_m: 290 nm/348 nm, T激发峰, 类蛋白质溶解有机质, 类色氨酸组分, 来自海源自产或沉积物^[34]。类色氨酸组分和类酪氨酸组分可以存在于同一种蛋白质组分中, 它们之间的能量转移会影响彼此的激发/发射光波长^[35]。因此C3、C4组分激发峰的位置相较于典型的B峰、T峰会有所偏移。类色氨酸组分可能以游离的氨基酸形式存在, 或与其它蛋白质结合, 外界扰动能使其再次变成游离态^[36]。

2.2 DOM光学参数变化与金属离子浓度相关性

图 2为4种光学参数与金属离子浓度变化的相关性图, 光学参数能指示DOM的来源。SUVA₂₅₄能代表DOM的腐殖化程度, 有研究表明其与芳香化的羰基和碳碳双键有关^[37]。FI、BIX与生物活性有关, 而HIX代表着荧光组分的腐殖化程度^{[29, 38]}。本地自产DOM的FI值一般大于1.9, 外源输入DOM的FI值一般小于1.4, BIX的高值代表DOM以生物自产为主, HIX的高值代表DOM中腐殖化程度高。如图 2所示, SUVA₂₅₄、FI、BIX的变化与离子浓度成正相关, 而HIX的变化与离子浓度呈负相关。主要原因为DOM与金属离子的结合顺序为腐殖质类DOM优于蛋白质类DOM, 导致HIX下降, 而FI、BIX相对上升, 这也与他人的研究结论一致^[10]。而SUVA₂₅₄作为反映DOM腐殖化的参数随着离子浓度增加呈现正相关, 与HIX反映的结果相悖。主要是因为金属离子与DOM的配位与含有孤对电子和Π键的官能团有关联, 例如羰基和羟基^[39]。这种配位可能导致电子的错位, 进而提高吸光度^[40]。

从图 2还可以看出, Cu²⁺与SUVA₂₅₄的相关性最高, 对其提高效果最显著, 可能是由于Cu²⁺与DOM的配位程度最高, 导致的电子错位最多。FI与3种离子金属浓度的变化相关性均不大。BIX与3种金属离子浓度变化的相关性大小顺序为Fe³⁺ > Cu²⁺ > Pb²⁺, 但其数值分布分散不集中, 并不一定反映DOM与3种金属离子配位的规律。HIX与Fe³⁺和Cu²⁺的相关性均为–0.95, 但滴加Cu²⁺时的HIX更低, 说明相较于Fe³⁺, Cu²⁺更易与腐殖化DOM配位。观察图 3中4个光学参数与3种离子浓度变化的相关性能够发现, Pb²⁺与4个参数的相关性都不高, Fe³⁺和Cu²⁺与HIX的线性相关性比较显著, 且数值变化趋势一致, 无较大波动, 因此HIX的值能够作为反映腐殖化DOM与金属离子的配位程度的指示。

2.3 近岸海域DOM与金属离子配位机制

通过EEM和荧光猝灭滴定研究DOM与金属离子的配位机制, 见图 3。Cu²⁺对DOM四种荧光组分配位的荧光猝灭曲线如图 3a所示。C1、C2、C3组分均与Cu²⁺有较为完美的荧光猝灭滴定曲线, 且基本趋势一致。C3组分配位终点的相对荧光强度略高于C1、C2组分, 表明与类蛋白质组分比较, 类腐殖质组分更易与Cu²⁺配位。C4类色氨酸组分在离子浓度滴加初期相对荧光强度有上升的趋势, 到达一定浓度后随着离子浓度的增加呈现下降。

图 3b为Fe³⁺对DOM四种荧光组分的荧光猝灭曲线图, 出现荧光猝灭现象的起始离子浓度为1× 10^–5 mol/L, 比Cu²⁺荧光猝灭起始浓度高, 说明Cu²⁺比Fe³⁺对DOM更敏感。类腐殖质组分C1、C2比类蛋白质组分C3、C4荧光猝灭终点的相对荧光强度更低, 与Fe³⁺的配位程度更高, 这与Li等^[41]的研究结果一致。C3类酪氨酸组分与Fe³⁺配位比与Cu²⁺配位更难一些, 这是由于Cu²⁺易和酚羟基配位形成强配位化合物, 而Fe³⁺倾向于和苯环类官能团配位, 而酚羟基普遍被认为是优于苯环的强配位位点^[41-42]。这也在与C1、C2组分的配位中有所体现, C2组分比C1组分腐殖化程度更高, 含有更多的苯环^[34], 因此更易与Fe³⁺配位。C4组分的相对荧光强度仍呈现先上升后下降的趋势。

Pb²⁺对于DOM组分的荧光猝灭如图 3c所示, 4种组分随着Pb²⁺加入量的增加, 荧光强度变化很小, 说明配位作用比Cu²⁺和Fe³⁺弱。这可能与Pb²⁺与DOM的配位化合物以球外配位化合物的形式存在, 较不稳定有关, 在以前的研究结果中也有发现这一现象^[43-44]。而Pb²⁺对C3类酪氨酸组分的配位作用稍优于类腐殖质组分, 这和Fe³⁺、Cu²⁺的配位机制相反, 可能是因为Pb²⁺与官能团的优先配位顺序有关, 酰胺基与苯环等芳香类官能团相比, 更易于与Pb²⁺配位^[45]。

综上所述, 类腐殖质DOM相对于类蛋白质DOM更易与金属离子配位, 与HIX值随离子浓度增加而下降所得结论一致。这是由于类腐殖质DOM含有羰基、苯环等官能团, 能给金属离子提供丰富的结合位点^[46]。Cu²⁺、Fe³⁺与DOM的配位作用优于和Pb²⁺, 原因除与DOM官能团的亲和力有关外, 还有可能与金属离子的顺磁性和原子半径有关^[47]。C4类色氨酸组分与3种离子配位时, 相对荧光强度均出现先上升后下降的趋势, 推测可能的原因有二: 一是金属离子破坏了蛋白分子的空间结构, 导致蛋白荧光产率的改变^[48]; 二是色氨酸组分存在与其他成分的结合, 加入低浓度金属离子会将原本被猝灭的色氨酸组分置换出来, 而随着金属离子滴加浓度升高, 显现出来的色氨酸组分再次被金属离子猝灭^[36]。

2.4 溶解氧对DOM与金属离子配位影响特性

溶解氧浓度对DOM与金属离子配位的影响如图 4所示。对于DOM与Cu²⁺的配位, 4种组分均在常氧时的配位作用最好, 缺氧和富氧的配位作用较为接近。同时C4组分与Cu²⁺的配位, 相对荧光强度最大值对应的离子浓度因氧浓度条件改变而变大, 推测原因是前期实验的通气操作使得更多C4组分和水体中其他成分结合, 导致置换C4所需的离子增多。对于DOM与Fe³⁺的配位, 缺氧时配位作用明显低于常氧和富氧, 常氧和富氧时配位作用相差不大。这一现象在C3组分表现得特别明显, 推测可能是缺氧时, Fe³⁺易夺取电子还原成Fe²⁺, 而类酪氨酸组分C3比其他组分还原性更强^[49]。DOM与Pb²⁺的配位, 相对荧光强度随离子浓度变化波动较大, 无明显趋势, 且配位结果受溶解氧影响不明显, 原因可能是Pb²⁺本身原子构型的原因^[43-44], 导致Pb-DOM的稳定性较低, 并且其价态及与之配位的官能团均不受溶解氧影响。

利用修正Stern-Volmer荧光猝灭模型模拟溶解氧影响下的配位稳定常数, 结果如表 2所示, 常数的大小代表着配位化合物的稳定性。从表中可以看出, DOM中同一种组分在相同氧浓度条件下, 与Cu²⁺配位的lgK_M大于与Fe³⁺配位, 证明Cu-DOM稳定性优于Fe-DOM, 与前文所得结论一致。其中Cu-DOM的lgK_M与文献报道中的数值相近, 均在4.8~5.3^[50]。Cu²⁺和DOM的配位受氧浓度条件影响不大, 但与C1、C3组分配位的K_M在不同氧浓度条件下均大于C2, 原因可能是Cu²⁺主要与酚羟基结合^[42], C1、C3组分均与微生物来源有关, 酚羟基官能团的活性更高^[51], 而C2组分为陆源来源, 官能团以苯环为主^[33]。Fe³⁺与DOM的配位, 缺氧条件时lgK_M最小, 即配位化合物稳定性最低, 也与前文阐述结果一致。缺氧和常氧时Fe³⁺均未能与C3组分模拟出K_M, 但富氧时模拟出K_M, 说明氧浓度升高, 能改变Fe³⁺和C3类酪氨酸组分的结合状态。Fe-DOM的lgK_M远小于Da Sliva等^[8]的研究(5.4~5.9), 原因除与DOM的腐殖化程度有关外, 还与环境pH有关。海水pH较高, 碱性环境下铁离子与DOM的K_M较小^{[41, 52]}。C4组分与3种金属离子以及Pb²⁺与4种荧光组分的配位稳定常数均未能模拟出, 原因为C4组分存在与其它成分的互相作用, 不符合模型假定1︰1的配位条件, 而Pb-DOM的稳定性较低, 无法用模型拟合。

3 结论

以舟山近岸海域DOM为研究对象, 通过紫外可见光谱、三维荧光光谱、荧光猝灭滴定表征DOM与Cu²⁺、Fe³⁺和Pb²⁺三种金属离子的配位特征, 并通过修正Stern-Volmer方程计算配位化合物稳定常数, 以期为海水中金属污染的控制以及溶解氧对DOM与金属离子配位的影响提供指导。主要研究结论如下:

(1) 舟山近岸海域DOM含有4种荧光组分, 2种类腐殖质组分(C1, C2), 2种类蛋白质组分(C3, C4); 类腐殖质DOM比类蛋白质DOM更易与金属离子配位; HIX可作为金属离子与腐殖化DOM配位程度强弱的一个辅助信息。

(2) 金属离子和DOM配位化合物的稳定性大小顺序: Cu-DOM > Fe-DOM > Pb-DOM。

(3) 缺氧条件能抑制Fe³⁺与DOM的配位, 但Cu²⁺、Pb²⁺离子的配位能力则几乎不受溶解氧浓度的影响。这些结果将为海洋渔业的重金属控制提供科学依据。