2024, Vol. 48
表1(Table 1)
单环刺螠(Urechis unicinctus)刚毛结构与成分分析
文章信息
- 董浩淼, 栾利鑫, 王方轶, 黄栋, 许淑超, 刘晓玲, 焦绪栋. 2024.
- DONG Haomiao, LUAN Lixin, WANG Fangyi, HUANG Dong, XU Shuchao, LIU Xiaoling, JIAO Xudong. 2024.
- 单环刺螠(Urechis unicinctus)刚毛结构与成分分析
- Analysis of the structure and composition of the chaetae of Urechis unicinctus
- 海洋科学, 48(7): 111-117
- Marine Sciences, 48(7): 111-117.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20231016005
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文章历史
- 收稿日期：2023-10-16
- 修回日期：2023-12-22
引用本文
董浩淼, 栾利鑫, 王方轶, 黄栋, 许淑超, 刘晓玲, 焦绪栋. 2024. 单环刺螠(Urechis unicinctus)刚毛结构与成分分析[J]. 海洋科学, 48(7): 111-117.
DONG Haomiao, LUAN Lixin, WANG Fangyi, HUANG Dong, XU Shuchao, LIU Xiaoling, JIAO Xudong. 2024. Analysis of the structure and composition of the chaetae of Urechis unicinctus[J]. Marine Sciences, 48(7): 111-117.
单环刺螠(Urechis unicinctus)刚毛结构与成分分析
1. 中国科学院烟台海岸带研究所, 山东 烟台 264003;
2. 中国科学院大学, 北京 100043;
3. 烟台大学, 山东 烟台 264005;
4. 北部湾大学, 广西 钦州 535011;
5. 潍坊市渔业技术推广站, 山东 潍坊 261061
2. 中国科学院大学, 北京 100043;
3. 烟台大学, 山东 烟台 264005;
4. 北部湾大学, 广西 钦州 535011;
5. 潍坊市渔业技术推广站, 山东 潍坊 261061
摘要：单环刺螠(Urechis unicinctus)具有腹刚毛和尾刚毛。为探究单环刺螠刚毛结构与成分, 本文采用扫描电镜对其刚毛的内外形态进行了观察; 利用傅里叶红外光谱、X-射线衍射分析了其主要成分; 基于现有的转录组数据分析了与其代谢相关的基因种类和潜在通路; 初步分析了刚毛结构特点与其年龄的关系。结果表明, 单环刺螠一般具有2根腹刚毛, 8~13根尾刚毛; 腹刚毛细长, 弧度较大; 尾刚毛粗短, 弧度平缓; 随年龄增长, 刚毛长度和直径均有所增加; 且年龄越大, 刚毛表面的结节状特征越为明显。刚毛由直径约1 μm的微纤维组成, 呈倾斜的层状结构纵向排列, 每层平均宽度为(172±27) μm; 成分分析发现其主要由α-几丁质构成, 还含有蛋白质成分。通过生物信息学分析发现单环刺螠体内存在与几丁质代谢相关酶, 并推测了其潜在的代谢通路; 研究结果为判断单环刺螠的年龄及生长状态提供了一定的理论基础。
关键词：单环刺螠 刚毛 几丁质 成分分析
Analysis of the structure and composition of the chaetae of Urechis unicinctus
1. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Yantai University, Yantai 264005, China;
4. Beibu Gulf University, Qinzhou 535011, China;
5. Weifang Fisheries Technology Extension Station, Weifang 261061, China
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Yantai University, Yantai 264005, China;
4. Beibu Gulf University, Qinzhou 535011, China;
5. Weifang Fisheries Technology Extension Station, Weifang 261061, China
Abstract: Urechis unicinctus has ventral and caudal chaetae. To explore the structure and composition of the chaetae of U. unicinctus, the internal and external morphology of the chaetae were observed via scanning electron microscopy. The main components were analyzed via Fourier transform infrared spectroscopy and X-ray diffraction. Based on existing transcriptome data, the gene types and potential pathways related to their metabolism were analyzed. The relationship between the structural characteristics of chaetae and age was preliminarily analyzed. The results showed that U. unicinctus usually had 2 ventral chaetae and 8–13 caudal chaetae. The ventral chaetae were slender, and their curvature was large; conversely, the caudal chaetae were thick and short, and the curvature was gentle. With increasing age, the length and diameter of the chaetae increased. In addition, the older the age, the more obvious the nodular features on the surface of chaetae. The chaetae were composed of chitin microfibers approximately 1 μm in diameter, which were longitudinally arranged in an inclined layered structure. The average width of each layer was (172±27) µm. Component analysis showed that the chaetae were mainly composed of α-chitin and contained protein components. Through bioinformatics analysis, enzymes related to chitin metabolism were found in U. unicinctus, and the potential metabolic pathways were speculated. The results of this study provide a theoretical basis for determining the age and growth status of U. unicinctus.
Key words:
Urechis unicinctus chaeta chitin composition analysis
单环刺螠(Urechis unicinctus)俗称海肠, 是一种生活在潮间带沉积物中的典型底栖生物, 分布在俄罗斯、日本、朝鲜半岛、北黄海和中国渤海湾沿岸[1]。其营养价值较高, 同时含有丰富的降压、降糖、抗菌和抗氧化等生物活性物质[2], 具有很高的食用和药用价值[1]。但近年来由于过度捕捞和栖息地破坏, 单环刺螠自然种群数量急剧下降[3]。苗种人工繁育和增养殖技术的突破为开展单环刺螠规模增养殖提供了必要条件, 相关配套技术及生物学基础的研究逐步引起研究人员的重视[4]。
大部分昆虫和部分海洋动物体表都具有刚毛, 分别具备触觉传感、固定支撑、辅助运动等功能[5-6]。单环刺螠腹部前端近肾孔处有1对腹刚毛, 围绕肛门具呈单环排列的尾刚毛[7]。单环刺螠刚毛的结构特征和功能目前尚未有报道。部分水生动物可通过其身体硬组织中的生长纹理鉴定年龄, 如鱼类的耳石[8-10]、鳍条[11-13]和脊椎骨[14-15], 头足类的耳石[16-17]、角质颚[18-19]和内壳[20]等。但单环刺螠类身体内无硬组织的海洋生物仍缺乏判断年龄的有效方法。
本文采用扫描电镜对单环刺螠刚毛的内外形态进行了观察, 利用傅里叶红外光谱、X-射线衍射分析了其主要成分, 同时基于现有的转录组数据分析了与其代谢潜在通路, 初步探讨了刚毛结构特点与其年龄的关系。为单环刺螠的年龄的判断及育苗育种提供了理论基础。
1 材料与方法 1.1 样品处理及统计分别取6、12、18、24月龄的健康无损伤的单环刺螠各20只, 冰面麻醉后用镊子拔取其腹刚毛与尾刚毛。统计刚毛数量, 测量刚毛的宽度和长度。
1.2 刚毛结构观察利用石蜡对刚毛包埋, 超薄切片机切片, 经脱蜡、烤片后, 制备刚毛切片, 在加速电压3 kV下, 用扫描电镜观察刚毛的显微结构。
1.3 刚毛成分分析 1.3.1 傅里叶红外光谱(FTIR)分析采用KBr压片法, 将刚毛冷冻干燥并研磨成粉末, 取质量比为100∶1的溴化钾与刚毛粉末样品于研钵中充分混合研磨后压制成圆片, 用傅里叶红外光谱仪进行检测, 扫描范围4 000~400 cm–1, 扫描速度6 595张光谱/s[21]。
1.3.2 X-射线衍射(XRD)分析取冷冻干燥并研磨后的刚毛粉末1 g用X-射线衍射仪进行分析检测。X射线光管为Cu靶, 电压40 kV, 电流30 mA, 扫描速度5 °/min, 扫描范围2θ=0°~40°[21]。
1.3.3 蛋白成分分析取适量刚毛粉末, 加入SDT裂解液中超声破碎1 min(功率80 W, 间隔5 s)。100 ℃水浴15 min, 12 000 r/min离心30 min取上清, 0.22 μm滤膜过滤后−80 ℃保存[22]。取适量样品用超微量分光光度计测量并计算蛋白质浓度[22]。
1.4 单环刺螠几丁质代谢通路预测根据已知的几丁质代谢通路, 基于实验室现有单环刺螠转录组数据库(登录号: PRJNA603659)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/603659), 查找与几丁质代谢相关的关键基因。利用DNAman对比筛选得到的基因序列, Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)检索类似功能基因, ProcessOn绘制代谢通路图。
1.5 数据处理采用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析, P < 0.05表示差异显著, P > 0.05表示差异不显著。
2 结果与讨论 2.1 单环刺螠刚毛观察和统计由于6月龄单环刺螠(幼螠)刚毛较为柔弱, 实验获取过程中容易出现折断、拉长等问题。为避免人为因素对结果的干扰, 仅统计了12、18、24月龄单环刺螠刚毛的数量、长度、宽度(表 1)。结果表明, 该年龄段内单环刺螠腹刚毛数量均为2根; 12月龄单环刺螠尾刚毛数量为(10±1)根, 18月龄单环刺螠尾刚毛数量为(8±1)根, 24月龄单环刺螠尾刚毛数量为(9±1)根。不同年龄间及不同个体间尾刚毛的数量无显著性差异。同时发现单环刺螠的腹刚毛和尾刚毛有自然脱落的现象。
表 1 不同年龄单环刺螠腹刚毛及尾刚毛的长度、直径及长度/直径 Tab. 1 Length, diameter, and length–diameter ratio of ventral and caudal chaetae of Urechis unicinctus at different ages
| 年龄 | 腹刚毛 | 尾刚毛 | |||||
| 长度/mm | 直径/mm | 长度/直径 | 长度/mm | 直径/mm | 长度/直径 | ||
| 1.0 | 4.18±0.56b | 0.15±0.03b | 29.67±6.04b | 2.75±0.39b | 0.12±0.03c | 23.80±6.07a | |
| 1.5 | 6.04±0.62a | 0.17±0.03a | 36.58±9.45a | 4.42±0.62a | 0.19±0.03b | 24.16±5.21a | |
| 2.0 | 6.11±0.88a | 0.18±0.04a | 35.34±8.73a | 4.34±0.86a | 0.20±0.04a | 22.00±5.14b | |
| 注: 同一列数据上标相同字母表示差异不显著(P > 0.05), 不同字母表示差异显著(P < 0.05) | |||||||
单环刺螠的腹刚毛较为细长, 长度为4.18~6.11 mm, 直径为0.15~0.18 mm; 尾刚毛较为粗短, 长度为2.75~ 4.34 mm, 直径为0.12~0.20 mm。单环刺螠的年龄与刚毛的长度和直径存在一定关系。12月龄和18、24月龄对比显示, 随年龄增长, 刚毛长度和直径均显著性增加。而18~24月龄对比显示, 腹刚毛的长度、直径无显著性差异, 但尾刚毛的宽度、长宽有显著性差异。提示随年龄增长, 单环刺螠刚毛的长度和直径均有所增加; 18月龄后增加幅度放缓, 尾刚毛的直径有所增加, 但长度变化不明显。
2.2 单环刺螠刚毛结构研究 2.2.1 刚毛外部特征观察单环刺螠的刚毛整体呈实心圆柱或不规则棱柱状(图 1)。后端(体内端)较为平直, 前端(体外端)较为尖细; 腹刚毛的弯曲程度明显大于尾刚毛; 刚毛表面常有横向纹, 间隔不一; 靠近身体端分布密集, 远离身体端分布稀疏; 部分横向纹形成膨大凸起, 凸起处时有裂纹产生; 尾刚毛比腹刚毛更为明显。
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| 图 1 不同年龄单环刺螠刚毛电镜图片 Fig. 1 Electron microscopy images of chaetae of Urechis unicinctus at different ages 注: Ⅰ: 腹刚毛; Ⅱ: 尾刚毛; A: 6月龄; B: 18月龄; C: 24月龄; D: 突起 |
横纹或凸起在6月龄单环刺螠刚毛的表面数量较少, 主要分布在刚毛的后1/3端; 而12和24月龄刚毛表面横纹的数量明显增多, 分布范围从后端向前延伸。推测横纹与刚毛的形成有关, 与单环刺螠的生长发育、生活环境等存在一定相关, 或可根据横纹的密度、大小、位置等信息研判其生理年龄或生长状态。
2.2.2 刚毛内部结构观察刚毛横切面如图 2a所示: 刚毛外围无明显表皮结构, 内部是由直链纤维并行堆积而成, 部分堆积纤维间存在不规则的空隙。纤维粗细较为均匀, 直径约(1±0.005) µm。刚毛纵切面如图 2b所示: 纵向呈倾斜的层状结构; 断裂处较整齐, 每层长度较均匀, 宽度约为(172±27) µm。推测该种断裂形态可能与刚毛的生长方式相关。与昆虫表皮中, 也存在以氢键连接的几丁质微纤维[23], 微纤维与蛋白质交联平行排列形成几丁质片层[24]。因此推测单环刺螠的刚毛为几丁质微纤维构成的片层结构堆叠而成, 片层和纤维之间是否存在黏结物质未知。
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| 图 2 单环刺螠刚毛切面扫描电镜图 Fig. 2 Scanning electron microscopy image of section of chaetae of Urechis unicinctus |
图红外光谱(图 3)显示出典型的几丁质结构: 其中3 401.30 cm–1处的峰为缔合-OH伸缩振动吸收峰, 2 933.40 cm–1处的峰为-CH3的对称伸缩振动吸收峰, 酰胺Ⅰ谱带上1 660.93 cm–1处的峰为-NHCOCH3的C=O伸缩振动吸收峰, 酰胺Ⅱ谱带上1 530.32 cm–1处的峰为-NHCOCH3的N-H弯曲振动吸收峰, 1 441.57 cm–1处的峰C-H弯曲振动吸收峰, 酰胺Ⅲ谱带上1 238.65 cm–1处的峰为-NHCOCH3的C-N伸缩振动吸收峰, 1 160.27 cm–1处的峰为C-O-C伸缩振动吸收峰, 1 067.04 cm–1处的峰为二级醇羟基, 1 032.73 cm–1处的峰为一级醇羟基, 617.61 cm–1处的峰为CH环伸缩振动吸收峰。
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| 图 3 傅里叶红外光谱图 Fig. 3 Fourier transform infrared spectrogram 注: a: 无齿相手蟹(Sesarma dehaani); b: 单环刺螠(Urechis unicinctus) |
与成年无齿相手蟹(Sesarma dehaani)脐部刚毛几丁质的FTIR谱图做对比[21], 峰的位置和峰值类似。因此推测单环刺螠刚毛主要由几丁质构成。
2.3.2 X-射线衍射结果X-射线衍射结果如图 4所示, 单环刺螠几丁质在2θ=20.2°附近处有一个较强的主衍射峰, 在2θ=26.7°附近处有一个较弱的衍射峰。单环刺螠刚毛内的几丁质与根肿菌(Plasmodiophora brassicae)几丁质的衍射结果相近[25], 与α-几丁质(sigma-aldrich C9213) FTIR光谱进行对比, 单环刺螠几丁质(Chitin of U. unicinctus)和α-几丁质(Commercial chitin)衍射峰位置和形状基本一致。推测单环刺螠刚毛内的几丁质为α-几丁质。但其衍射峰较少, 与常见α-几丁质略有差异。
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| 图 4 X-射线衍射图谱 Fig. 4 X-ray diffraction pattern 注: a: 根肿菌几丁质; b: α-几丁质; c: 单环刺螠刚毛几丁质; d: 单环刺螠去杂质峰后的XRD图 |
经分光光度测量并计算得出单环刺螠刚毛中蛋白质的平均浓度为9.611 mg/mL, 蛋白质在干物质中占比约16%, 因此单环刺螠刚毛内还含有蛋白质成分。参考昆虫表皮中几丁质微纤维与蛋白质交联平行排列形成片层结构[23], 推测该类蛋白质具有类似功能。
2.4 单环刺螠几丁质代谢通路预测根据已知的几丁质代谢通路, 基于实验室现有单环刺螠转录组数据库, 查找筛选出47个可能参与几丁质代谢相关的关键基因。包含1个海藻糖酶(trehalase)、9个己糖激酶(hexokinase)、8个葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase)、3个磷酸乙酰氨基葡萄糖变位酶(phosphoacetylglucosamine mutase)、2个几丁质合成酶(chitin synthase)、9个几丁质酶(chitinase)、2个β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase)、1个N-乙酰氨基葡萄糖激酶(N-acetylglucosamine kinase)、12个几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase)。参考飞蝗、桑螟体内几丁质代谢通路[24, 26], 推测单环刺螠体内参与几丁质代谢的通路如图 5所示。
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| 图 5 预测的几丁质代谢通路图 Fig. 5 Chitin metabolism pathway diagram 注: 图中实线处为已找到的基因, 虚线处为未找到的基因, 点画线处为几丁质分解途径所需基因 |
单环刺螠是中国黄渤海近海海区一种特殊的底栖穴居经济类无脊椎动物[27-29]。随着单环刺螠苗种繁育和增养殖技术的不断突破和实施, 有望成为新的海水养殖品种[7]。部分海洋动物的体表具有刚毛, 具备触觉传感、固定支撑、辅助运动等功能[5-6]。本文对单环刺螠刚毛的结构和成分进行了分析。结果表明其腹部前端近肾孔处有1对细长的腹刚毛, 围绕肛门具呈单环排列的8~13根粗短的尾刚毛, 与前述结果一致[7]; 随着年龄增加, 单环刺螠刚毛的长度和直径均有所增加。
通过身体中的硬质结构如鱼类的耳石[8-10]、鳍条[11-13]、脊椎骨[14-15], 头足类的角质颚[18-19]、内壳[20]等研判生物体的生理年龄是常用方法。但针对体内无硬质结构如单环刺螠、方格星虫等生物体仍缺乏判断其生理年龄的有效方法。本文发现单环刺螠刚毛中存在横向纹路, 即类似结节的结构; 对不同年龄段的刚毛样品分析发现, 随年龄的增长横向纹路数量有所增加, 分布范围也由近体端向远体端延伸。推测或与单环刺螠的生理年龄、生长状态、生活环境等存在一定的相关性。研究还发现单环刺螠的刚毛特别是尾刚毛存在脱落和再生现象, 同一个体的不同刚毛间在长短、粗细、横纹等结构特征上存在一定差异, 因此在做统计分析时需要做好辨别。
研究发现单环刺螠刚毛主要由α-几丁质和某些未知蛋白质以片层堆叠的形式构成, 其结果与部分陆地昆虫的表皮结构类似[23], 对单环刺螠转录组的分析, 发现其体内存在与几丁质代谢相关的关键酶类, 并推测了其潜在的代谢通路。研究结果为分析单环刺螠的年龄及生长状态提供了条件, 也为研判单环刺螠等螠虫动物的进化起源提供了一定的理论基础。
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