牡蛎隶属软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、珍珠贝目(Pterioida), 牡蛎科(Ostreidae), 具有很高的经济价值^[1]。牡蛎物种鉴定是开展牡蛎研究和产业应用的前提。牡蛎壳型可塑性高, 栖息环境多样, 导致基于形态特征的牡蛎物种传统分类存在着严重的同物异名和异物同名等^[2]。一系列分子标记技术的开发与应用解决了牡蛎种名混乱现象, 为牡蛎物种鉴定提供了有力的工具。

线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因是真核生物的核外遗传因子, COI基因序列因其具有高拷贝、片段保守、引物通用性高等特点, 已在物种鉴定等方面得到广泛应用。在FOLMER^[3]对COI通用引物设计的基础上, 王海艳等^[4-5]开发了基于COI序列的牡蛎多重属和多重种的特异性PCR标记, 用于鉴定不同物种的牡蛎。但是于诗奇等^[6]在采用WANG设计的多重种特异性引物对福建沿海巨蛎属(Crassostrea)牡蛎进行鉴定时发现, 大部分福建牡蛎(Crassostrea angulata)样品会产生与熊本牡蛎种特异性一致的第三条条带, 从而对福建牡蛎的鉴定造成干扰, LIU等^[7]在对浙江沿海牡蛎分类鉴定中也发现了此现象。因此, 需要另外一种简便可靠的方法对牡蛎物种进行鉴定。

聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)具有操作简单、快捷、可靠、成本低等特点, 广泛应用于物种的分类鉴定。在牡蛎物种鉴定方面, BOUNDRY等^[8]利用RFLP方法鉴别了长牡蛎(C. gigas)和葡萄牙牡蛎(C. angulata)(福建牡蛎同种异名); PIE等^[9]通过PCR-RFLP技术成功区分了巴西沿海养殖的3个牡蛎种类(西非红树林牡蛎(C. brasiliana)、红树林牡蛎(C. rhizophorae)和长牡蛎); 喻子牛等^[10]对华南沿海存在的7种巨蛎属牡蛎开发了基于此技术的鉴定方法; 刘凯凯等^[11]也通过此技术首次从分子水平上鉴定了岩牡蛎(C. nippona)与长牡蛎等。已报道的牡蛎物种PCR-RFLP鉴定方法都采用双酶切或多酶切的手段进行鉴定, 且酶切位点在牡蛎物种的COI序列上存在着碱基位点的突变, 部分突变位点位于COI序列的中间, 改变了牡蛎物种的特定酶切带型, 干扰牡蛎物种的准确鉴定。因此, 有必要开发一种单酶切的PCR-RFLP鉴定方法, 且对常见牡蛎物种不存在酶切位点的突变, 提高PCR-RFLP方法在牡蛎物种鉴定的可靠性与简便性。

1 材料和方法 1.1 样品采集及基因组总DNA提取

本实验所需牡蛎取自福建沿海自北向南的17个地点(福鼎FD、竹江ZJ、盐田YT、吉璧JB、廪尾LW、东沃村DWC、中灵ZL、后海HH、平海PH、青山湾QSW、洛阳桥LYQ、深沪湾SH、水头ST、鳌园AY、厦漳XZ、九龙江闸门ZM、沙西SX), 此外, 由于本实验室之前研究并未在福建沿海发现近江牡蛎自然群体的存在, 因此近江牡蛎样本由中国科学院海洋研究所(青岛)提供。对牡蛎样本进行解剖, 取其闭壳肌和外套膜并置于75%乙醇中固定。采用DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)对牡蛎样品进行DNA提取, 提取的样本DNA经电泳检测质量, 并通过超微量分光光度计(Aurora-900)测量其浓度, 最终稀释至50 ng/μL, 保存于4 ℃冰箱中。

1.2 PCR扩增及测序

参考FOLMER^[3]设计的通用引物LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198 (5′-AAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′), 以提取的牡蛎DNA样本为模板, 对牡蛎样本的线粒体COI基因进行扩增。PCR反应体系为10 μL, 包括0.5 μL模板DNA, 0.25 μL每个上下游引物, 5 μL 2 × Taq PCR MasterMix II, 4 μL灭菌超纯水。PCR反应条件为: 94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性45 s, 48 ℃退火45 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环; 72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。取PCR扩增产物1 μL, 2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 RFLP限制性内切酶筛选

从GenBank中下载已知的4种巨蛎属牡蛎的COI片段福建牡蛎(KU933400)、熊本牡蛎(C. sikamea, MG450355)、香港牡蛎(C. hongkongensis, KP976208)和近江牡蛎(C. ariakensis, FJ743514), 并使用SnapGene软件对序列进行酶切位点分析, 筛选在4种牡蛎COI序列产生特征性酶切片段且无酶切位点突变的限制性内切酶。

1.4 PCR-RFLP分析

用筛选出的限制性内切酶对4种巨蛎属牡蛎的PCR产物进行酶切。RFLP反应体系为10 μL, 包括4 μL PCR

扩增产物, 0.5 μL限制性内切酶Msp I(3 000 U; Takara), 1 μL 10 × T Buffer, 1 μL 0.1% BSA以及3.5 μL的灭菌超纯水。反应在37 ℃孵育5 min, 孵育结束后每个反应体系中加入1 μL 10 × Loading Buffer以终止反应。酶切产生的片段经2%的琼脂糖凝胶电泳检测, 用1 000 bp Marker(艾科瑞生物)作为电泳后片段大小的参照。

1.5 COI序列测定及酶切突变位点分析

为确保PCR-RFLP结果的准确性, 将1.2的COI扩增产物送至生工生物工程股份有限公司测序, 测序结果使用UGENE软件进行多重序列比对, 并与GenBank中注册的4种牡蛎的COI基因序列进行比对, 以确定所测样品的物种。使用SnapGene软件对测序结果进行酶切位点分析。

2 结果与分析 2.1 PCR扩增结果

福建牡蛎、熊本牡蛎、香港牡蛎、近江牡蛎等4种巨蛎属牡蛎样本的PCR扩增产物经2% 琼脂糖凝胶电泳检测, 均显示出单一的一条基因片段, 未发现其片段长度多态性, 且所得的片段大小均在680 bp左右, 碱基片段长度相差较小(图 1)。

2.2 限制性内切酶的筛选

对牡蛎的COI基因序列进行比对, 结果发现: 4种牡蛎的COI序列片段上存在多种酶的特异性酶切位点。其中, 甲基转移酶(Msp I)能够特异性识别CCGG的碱基片段并在CC碱基之间进行酶切, 4种巨蛎属牡蛎的序列比对结果及酶切位点如图 2所示, 香港牡蛎的线粒体COI序列中不存在Msp I的特异性酶切位点; 熊本牡蛎的COI扩增产物中存在1个特异性酶切位点, 位于第97、98位碱基之间; 福建牡蛎的扩增产物中存在2个特异性酶切位点, 分别位于第97、98位碱基和第422、423位碱基之间; 近江牡蛎扩增的COI基因序列存在3个酶切位点, 分别位于第163、164位, 第538、539位以及第576、577位碱基之间。Msp I在不同种的牡蛎中存在着不同个数的酶切位点, 因此, 选取Msp I作为4种牡蛎COI序列的限制性内切酶。

2.3 PCR-RFLP酶切结果

4种巨蛎属牡蛎的COI扩增产物经限制性内切酶Msp I酶切后, 产生了不同的特异性带型, 能够对彼此进行有效区分。香港牡蛎的COI基因序列酶切后产生了大小为677 bp的1个片段; 熊本牡蛎的COI基因序列酶切后产生了大小分别为98和582 bp的2个片段; 福建牡蛎COI基因序列酶切后产生了大小分别为98、258、324 bp的3个片段; 近江牡蛎的COI基因序列酶切后产生了大小为38、98、164和375 bp的4个片段, 如表 1、图 3所示。由于长度较小的酶切片段会与引物二聚体产生混淆, 所以本方法只选用80 bp以上的片段。

2.4 COI序列测定验证及酶切突变位点分析

采用Msp I作为限制性内切酶的PCR-RFLP所得到的牡蛎物种鉴定结果与COI测序鉴定的结果一致, 并且在所有送测牡蛎的COI序列上不存在着酶切位点的突变, 准确率达到100%(表 2)。

3 讨论

对牡蛎的种类进行有效鉴别是贝类养殖业、种质资源管理、科学研究等的基本要求。迄今, 许多分子手段已应用于牡蛎的物种鉴定中, 包括HRM、多重种特异性PCR、线粒体COI测序等。其中COI测序是目前牡蛎物种鉴定最为准确且运用较为广泛的方法, 但其价格较贵且需要具备测序条件^[6]。PCR-RFLP技术由于其操作简单、费用低等特点, 成为实际应用中常用的物种鉴定手段。

在限制性内切酶的选择上, 夏建军^[12]曾对华南沿海存在的7种巨蛎属牡蛎(熊本牡蛎、香港巨牡蛎、近江牡蛎、长牡蛎、福建牡蛎、易氏牡蛎(C. iredalei)和湛江牡蛎(C. zhanjiangensis sp.))的线粒体COI序列采取Nis I+Alu I和Nis I+Dde I结合的双酶切方法, 成功地对它们进行区分。但是所选取的限制性内切酶组合并不适用于所有样本, 在COI单倍型中, 有一些在Alu I限制性位点存在碱基突变。本研究对牡蛎样本的COI测序结果进行分析时发现, 以上4种限制性内切酶的酶切位点存在着许多碱基突变, 在641个牡蛎样本的多重序列比对中, 福建牡蛎、熊本牡蛎、香港牡蛎和近江牡蛎的COI扩增序列在Nis I的酶切位点(ATGCAT)上存在6个碱基突变个体; 在Alu I的酶切位点(AGCT)上存在11个碱基突变; 在Dde I的酶切位点(CTNAG)上存在9个碱基突变, 并且这些突变位点大多位于COI序列的中间, 会使得待测牡蛎的酶切结果产生非特异性条带, 从而干扰判断。本研究在此基础上进行了进一步的优化, 筛选出单一的限制性内切酶Msp I(CCGG)对牡蛎物种的COI基因序列进行酶切, 并以COI测序结果作为参考并对测定序列进行酶切位点的分析, 结果表明本方法的鉴定结果与COI测序的鉴定结果相一致, 并且在641个牡蛎样本COI序列上不存在酶切位点的突变, 准确性达到了100%。

本研究以福建沿海为背景, 福建沿海的巨蛎属牡蛎物种组成主要包括: 福建牡蛎、熊本牡蛎、香港牡蛎和近江牡蛎, 并无长牡蛎的存在, 因此本研究在牡蛎物种的选取上并未涉及长牡蛎。在样本的取材上, 本方法选取来自福建及山东沿海18个地区的牡蛎样本, 以保证实验材料不具有特殊性, 并且使得牡蛎样本之间的亲缘关系较远, 从而确保实验结论的可靠性。此外, 本团队成员也曾用此方法对采集到的幼贝样品进行物种鉴定, 发现幼贝COI序列的Msp I酶切产物同样呈现出特异性的酶切带型。因此本方法除成贝以外, 同样适用于牡蛎幼贝的物种鉴定。

4 结论

本研究采取了基于线粒体细胞色素氧化酶I的PCR-RFLP方法, 对沿海常见的4种巨蛎属牡蛎进行鉴定。仅需要利用限制性内切酶Msp I对4种牡蛎的COI序列进行酶切, 通过观察酶切后所产生的特异性带型即可对4种巨蛎属牡蛎进行快速可靠的鉴定。