海洋科学  2024, Vol. 48 Issue (9): 24-33   PDF    
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240130005

文章信息

宣益聪, 常广秋, 刘圣, 林志华, 薛清刚. 2024.
XUAN Yicong, CHANG Guangqiu, LIU Sheng, LIN Zhihua, XUE Qinggang. 2024.
基于线粒体DNA比较中国、日本与美国熊本牡蛎群体遗传多样性
A comparison of the mitochondrial DNA-based genetic diversity of Kumamoto oyster populations from China, Japan, and the United States
海洋科学, 48(9): 24-33
Marine Sciences, 48(9): 24-33.
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240130005

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收稿日期：2024-01-30
修回日期：2024-07-22
引用本文
宣益聪, 常广秋, 刘圣, 林志华, 薛清刚. 2024. 基于线粒体DNA比较中国、日本与美国熊本牡蛎群体遗传多样性[J]. 海洋科学, 48(9): 24-33.
XUAN Yicong, CHANG Guangqiu, LIU Sheng, LIN Zhihua, XUE Qinggang. 2024. A comparison of the mitochondrial DNA-based genetic diversity of Kumamoto oyster populations from China, Japan, and the United States[J]. Marine Sciences, 48(9): 24-33.
基于线粒体DNA比较中国、日本与美国熊本牡蛎群体遗传多样性
宣益聪1,2, 常广秋1,2, 刘圣1,2, 林志华1,2, 薛清刚1,2     
1. 浙江万里学院 浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室, 浙江 宁波 315100;
2. 浙江万里学院 宁海海洋生物种业研究院, 浙江 宁波 315100
收稿日期：2024-01-30；修回日期：2024-07-22
基金项目：宁波市重点研发计划(2023Z125); 国家自然科学基金(32073010; 32002428); 宁波市“泛3315”创新团队; 浙江万里学院基本科研业务费(SC1032080180110)
作者简介：宣益聪(1999—), 男, 浙江湖州人, 硕士研究生, 从事贝类遗传育种研究, E-mail: xyc18757208541@163.com.
通信作者：薛清刚(1962—), 通信作者, 男, 山东青岛人, 博士, 教授, 主要从事贝类遗传育种研究, E-mail: qxue@zwu.edu.cn.
摘要：为研究熊本牡蛎养殖群体与野生群体的遗传多样性, 采集来自中国(浙江、南通、福建、广西、广东)、日本的6个野生群体以及美国的养殖群体共188个熊本牡蛎。对每个牡蛎的细胞色素氧化酶C亚基I (COI)和线粒体非编码区(MNR)序列进行扩增并测序, 随后对其遗传多样性、遗传结构进行分析。结果表明中国的野生群体均有较高的遗传多样性, 并且在MNR序列中有更多的单倍型多样性, 而日本和美国群体则相对较少。在COI序列中, 中国5个群体间的遗传分化系数FST较小(−0.015 57~0.001 65), 而与美、日群体间的FST要高很多(>0.2), 而美国、日本群体间的FST较低(0.008 22)。在MNR序列中表现出了基本一致的结果, 但是美、日群体间也存在较大且显著的遗传分化(FST=0.109 68), 显示线粒体非编码区在群体遗传学研究中较大潜力。AMOVA分析以及单倍型网络图都揭示了中国群体与美、日群体间存在着遗传分化, 并且美、日群体间存在着一定的亲缘关系, 与引种历史一致。综上所述, 中国的熊本牡蛎野生群体有高水平的遗传多样性, 5个群体间也不存在遗传分化, 而日本的野生群体面临着种质资源衰退的问题, 美国的养殖群体也由于多代人工培育表现出较低的遗传多样性水平, 并且与中国群体有着明显的遗传分化。本研究为后续选择育种群体以及杂交育种群体组合提供了参考。
关键词：熊本牡蛎    COI    MNR    遗传多样性    遗传分化    
A comparison of the mitochondrial DNA-based genetic diversity of Kumamoto oyster populations from China, Japan, and the United States
XUAN Yicong1,2, CHANG Guangqiu1,2, LIU Sheng1,2, LIN Zhihua1,2, XUE Qinggang1,2     
1. Zhejiang Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resource, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China;
2. Institute of Mariculture Breeding and Seed Industry, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China
Received: Jan. 30, 2024
Foundation: Ningbo Key Research and Development Plan No. 2023Z125; National Natural Science Foundation of China, Nos. 32073010, 32002428); Ningbo “Pan-3315” innovation team; Basic Research Expenses of Zhejiang Wanli University, No. SC1032080180110
Abstract: A total of 188 Kumamoto oysters were collected from six wild populations in China (Nantong, Zhejiang, Fujian, Guangdong, and Guangxi), Japan, and the United States to study the genetic diversity of cultured and wild populations. The cytochrome oxidase C subunit Ⅰ (COI) and mitochondrial noncoding region (MNR) of each oyster were amplified and sequenced, and their genetic diversity and structure were analyzed. The results showed that the wild Chinese population had greater genetic diversity and more haplotype diversity in MNR sequences, whereas the Japanese and American populations had relatively lesser genetic diversity. Regarding the COI sequence, the genetic differentiation coefficient (FST) among the five Chinese populations was lower (−0.015 57–0.001 65), while the FST between the Chinese populations and the American, Japanese populations was much higher, and the FST between the American and Japanese populations was also lower (0.008 22). The results of the MNR sequences analysis were consistent, but with a large and significant genetic differentiation between the American and Japanese populations (0.109 68), indicating the great potential of MNR sequences in population genetics. AMOVA and haplotype network maps revealed genetic variations between the Chinese, American, and Japanese populations. However, a certain kinship occurred between the American and Japanese populations, which was consistent with their introduction history. The wild Chinese Kumamoto oyster population exhibited broader genetic diversity, with no genetic differentiation among the five populations. In contrast, the wild Japanese population is at risk of germplasm resource decline. Additionally, the cultured American population also exhibited narrow genetic diversity due to multiple generations of artificial selection and aquaculture, with obvious genetic variations from the Chinese population. This study provides a reference for the subsequent selection of breeding populations and the combination of crossbreeding populations.
Key words: Kumamoto oyster    COI    MNR    genetic diversity    genetic differentiation    

牡蛎, 又称生蚝、蛎黄、海蛎子等, 在世界范围内分布广泛, 因其肉质鲜美, 营养丰富, 经济价值高而成为世界水产养殖产量最高的贝类, 全球年产量可达600多万吨[1-2]。熊本牡蛎(Crassostrea sikamea)是一种在东亚沿海地区常见的物种, 分布范围从日本南部、中国南部到越南[3-4]。熊本牡蛎是一种生长相对缓慢的物种, 区别于其他牡蛎种, 其体型较小偏圆, 左壳呈深凹形, 有较明显的放射状肋脊。熊本牡蛎以其香甜的味道而受到青睐, 并被认为有更优质的口感, 且由于在每年的七八月份大部分牡蛎种类都到了繁殖期, 使其口感较差, 而熊本牡蛎的繁殖期较晚, 同时期的熊本牡蛎依旧保持良好的风味与口感, 填补了这一时期牡蛎市场的空白, 这使得熊本牡蛎具有更高的市场经济价值。熊本牡蛎较其他种类的牡蛎具有独特且更具生存优势的特性, 熊本牡蛎偏好潮间带的上部区域, 相对于其姊妹物种, 它能够耐受恶劣的潮间带环境。此外, 相对于长牡蛎, 熊本牡蛎对牡蛎疱疹病毒1(OsHV-1)更具耐受性, 在胁迫下表现出较低的死亡率[5]。

遗传资源的使用和交流在贝类养殖发展中发挥了重要作用[6]。约80年前, 熊本牡蛎从日本有明海引入到美国西北太平洋海岸[7], 当时普遍认为熊本牡蛎是长牡蛎的变种[8]。由于在美国没有形成野生种群, 引入的熊本牡蛎在孵化场和牡蛎养殖场中进行培育。由于有意(保留大型幼虫和种苗)或无意间的选择, 使得从日本引入的熊本牡蛎在美国经过数代培育, 与日本和中国熊本牡蛎群体区别明显, 其种群显示出驯化的迹象, 如快速生长和更大的体尺规格(平均30~40 g/个)[9], 以及显著减小的有效种群大小[10]。

遗传多样性作为评价物种种质资源现状的重要依据, 可通过对物种遗传多样性的研究来了解物种或种群的起源、进化、遗传变异等[11]。随着熊本牡蛎分类地位的提高, 关于其遗传多样性的研究也更加受到研究者的关注与重视, 2021年邓亚平[12]通过开发熊本牡蛎的多态性微卫星分子标记对9个熊本牡蛎群体进行了遗传多样性分析, 发现9个熊本牡蛎群体均有较高的遗传多样性, 并且野生群体要明显高于养殖群体。2020年黄飘逸[13]利用高通量测序对熊本牡蛎野生群体与养殖群体的遗传多样性进行了比较, 结果显示养殖群体的遗传多样性低于野生群体, 但也保持了较高的多态性水平。翁朝红等[14]利用10个微卫星标记对福建和广东的福建牡蛎养殖群体和野生群体的遗传多样性进行分析, 野生群体在期望杂合度值、等位基因数及基因多样性指数都是最高的。这说明在人工繁育过程中通常有较大几率的近亲繁殖, 原种个体数量少而形成的瓶颈效应的影响[15]。而在韩国, 通常会使用来自不同养殖场的大量牡蛎个体进行人工授精, 这也使得韩国长牡蛎的野生群体和养殖群体的遗传多样性并没有显著差别[16]。对熊本牡蛎野生及养殖群体的遗传多样性进行了解, 充分认识其变异遗传等信息, 发掘不同群体间的种群分化是非常有必要的。

COI基因(线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基, cytochrome oxidase subunit I), 是动物线粒体基因组中高度保守的蛋白质编码基因, 具有普遍性和高度保守性且其内富含系统发育等信号, 研究表明, COI基因含丰富的遗传信息, 十分适合用于种内研究, 是首选的遗传标记, 它们已被广泛用于软体动物和其他无脊椎动物的物种鉴定和遗传多样性评估。李咏梅等[17]基于COI基因序列认为广西钦州湾牡蛎的遗传多样性丰富; 杨聪慧等[18]基于COI基因对野生鲫和杂交鲫的遗传特征进行研究。在水生生物群体的遗传多样性及遗传结构的分析中COI基因都有着举足轻重的地位, 得到了广泛的应用[19]。MNR序列(线粒体非编码区, mitochondrial noncoding region), 位于甘氨酸和脯氨酸合成酶编码区域之间。尽管基于MNR序列对水生生物的研究较少, 但是非编码区在基因组中的突变速度相对较快, 并且具有区分不同牡蛎种群的潜力, 也被用于分析欧洲和亚洲的长牡蛎和福建牡蛎的遗传多样性、入侵生物学及种质来源分析[20]。

本研究中, 基于COⅠ基因和MNR序列对熊本牡蛎中国沿海5个野生群体、日本野生群体、美国养殖群体的遗传多样性以及遗传结构等进行研究比较, 为熊本牡蛎种质资源管理、良种选育、杂交组合筛选等提出科学依据。

1 材料与方法 1.1 实验动物及取样方法

2021年12月由广东阳江、广西钦州、福建厦门、浙江宁波、江苏南通分别采集熊本牡蛎野生群体。美国熊本牡蛎群体于2021年6月购自美国Taylor公司, 熊本牡蛎日本群体取自2021年12月, 由日本东京大学合作者于日本提取完DNA后邮寄至国内实验室。

1.2 DNA提取与物种鉴定

对熊本牡蛎个体分别随机采样, 剪取鳃组织用于DNA提取。使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(目录号: RT405-12; 天根生化科技有限公司, 北京)提取DNA; 利用1%琼脂糖电泳检测其完整性。经分子鉴定为熊本牡蛎的个体用于后续实验。

将获得的DNA进行PCR扩增, 引物为COⅠ通用引物: COⅠ-F(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATT GG-3′)和COⅠ-R(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAA AAATCA-3′)以及MNR通用引物: MNR-F(5′-TCACA AGTACATTTGTCTTCCA-3′)和MNR-R(5′-AACGTT GTAAGCGTCATGTAAT-3′); PCR反应体系为25 µL, 包括DNA模板1 µL、2×Taq Master Mix(上海生物生工工程股份公司)12.5 µL、COⅠ通用引物/MNR通用引物上下游各1 µL和ddH2O 7.5 µL; PCR反应程序为: 94 ℃预变性5 min; 再进行35个循环: 94 ℃、30 s, 50 ℃、30 s, 72 ℃、50 s; 最后72 ℃延伸10 min。采用琼脂糖电泳检测, 将检测合格的PCR产物送上海生工生物工程股份公司进行正向测序, 测序获得序列在SeqMan软件中去除前后不准确序列后, 在NCBI中进行比对。

1.3 遗传多样性分析处理

将确定为熊本牡蛎的序列在DNAstar-Seqman软件处理, 通过导入序列、组装、比对、处理等方法, 使两端长短不一且测序不准确的序列, 截取成长度一致的序列, 利用MEGA X中的CLUSRAL W进行比对并人工校正, 并将所有处理好的序列保存至一个文件中(文件后缀为nex)。使用DNASP软件将上述处理好的序列划分为不同群体(广东阳江GD、广西钦州GX、福建厦门FJ、江苏南通NT、浙江宁波ZJ、美国US、日本JAP), 统计其单倍型分布及频率。利用Arlequin 3.5计算每个群体单倍型数目(H)、多态位点数(s)等以及群体遗传分化指数(FST), 并对其进行通过10 000次重复置换检验分析显著性。利用分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)对群体内、群体间进行评估, 确定群体遗传变异的来源, 以10 000次重抽样进行Fu’s Fs检验; 选用Tamura&Nei模型对群体间遗传差异进行评估, 抽样次数设定为10 000次。将最终nex文件导入Popart 1.7软件中构建单倍型网络图。

2 结果与分析 2.1 熊本牡蛎物种鉴定

利用COI以及MNR通用引物对中国5个群体(江苏南通、浙江宁波、福建厦门、广东阳江、广西钦州)形似熊本牡蛎的个体进行鉴定, 并对美国和日本群体进行检测, PCR扩增后有一条约700 bp大小的亮条带, 将有条带的PCR产物送测(生工生物)。

测序结果去除前后不准确序列后在NCBI中比对。综合COⅠ序列和MNR序列比对, 共鉴定5个中国地理群体熊本牡蛎146个以及美国群体18个, 日本群体24个个体(表 1), 用于后续遗传多样性分析。

表 1 熊本牡蛎7个群体取样信息 Tab. 1 Sampling information of the seven populations of C. sikamea
群体 取样地点 群体编号 个体数目 纬度 经度
中国 江苏南通东灶港 NT 28 32.11°N 121.49°E
浙江宁波象山港 ZJ 30 29.48°N 121.42°E
福建厦门杏林湾 FJ 30 24.56°N 118.07°E
广东阳江阳西港 GD 28 21.65°N 111.78°E
广西钦州 GX 30 21.67°N 108.65°E
日本 熊本县鹿神河河口 JAP 24 32.6°N 130.6°E
美国 达波湾(Dabob bay) US 18 47.22°N 123.04°W
表选项
2.2 熊本牡蛎不同群体序列多样性分析

7个群体中序列对比后共得到188条熊本牡蛎长度为601 bp的COⅠ序列和长度为645 bp的MNR序列, 其中美国群体18条、日本群体24条、南通群体28条、浙江群体30条、福建群体30条、广东群体28条、广西群体30条。在熊本牡蛎COI序列中共检测到87个单倍型, 其中含有69个私有单倍型。结合基于COI的单倍型网络图可以看到网络图整体略显杂乱, 其中Hap_86是数目最多的单倍型(37个), 为浙江、福建、广东、广西、南通、美国群体共享单倍型, 位于该部分单倍型网络中间, 被外围低频单倍型连接, 向其他单倍型发散, 推测为古老单倍型。其次为Hap_81(22个)为美国、日本群体共享单倍型, 由Hap_78分化而来, 美国、日本群体基本汇为一支。福建、南通、美国群体与其他各群体间均有共享单倍型, 广东、广西、浙江群体与除日本群体外其余各群体间均有单倍型, 日本群体共享单倍型最少, 所有群体均拥有私有单倍型。在单倍型网络图的右边和下边大多为中国群体, 稍显杂乱, 基本以Hap_83为中心, 为中国5个地理群体共享(表 2, 图 1)。广西群体包含多态性位点最多(35个), 其次为浙江群体(28个), 美国群体所含多态性位点最少(6个), 所有多态性位点均含有不同数量的转换和颠换位点, 无插入和缺失的现象。所有群体均表现出了较高水平的核苷酸多样性(π=0.002 30~0.007 36), 在单倍型多样性上广西群体水平最高(0.979), 其次为福建群体(0.968), 美国群体最低(0.693)。平均核苷酸差异在不同群体中略有不同, 变化范围较小, 其中广西群体最高(4.421), 最小在美国群体中(1.382), 中国5个群体间平均核苷酸差异较小。

表 2 熊本牡蛎7个群体 COⅠ基因的遗传多样性参数和中性检验值 Tab. 2 Genetic diversity parameters and neutral test values for COⅠ in the seven populations of C. sikamea
群体编号 s H k h π/% Tajima’D Fu’s Fs
ZJ 28 20 3.713±1.929 0.894±0.053 0.618±0.357 −1.729* −13.028**
FJ 22 23 3.811±1.973 0.968±0.022 0.634±0.365 −1.130 −19.160**
GD 24 19 3.421±1.803 0.944±0.030 0.569±0.334 −1.622* −12.964**
GX 35 24 4.421±2.243 0.979±0.016 0.736±0.415 −1.847* −19.469**
NT 25 19 3.572±1.868 0.936±0.034 0.594±0.346 −1.625* −12.499**
US 6 5 1.382±0.891 0.693±0.086 0.230±0.166 −0.702 −0.457
JAP 20 10 2.068±1.199 0.707±0.100 0.344±0.223 −2.250** −3.757*
注: *表示显著性P<0.05; **表示显著性P<0.01; s为多态位点数; H为单倍型数目; k为平均核苷酸差异; h为单倍型多样性; π为核苷酸多样性
表选项

图 1 基于COⅠ序列构建7个群体熊本牡蛎单倍型网络图 Fig. 1 Haplotype network based on the COⅠ sequences in the seven populations of C. sikamea 注: 不同颜色代表不同的群体
图选项

在MNR序列中共检测到142个单倍型, 其中129个私有单倍型。Hap_2是数目最多的单倍型(为美国和日本群体共享), 其次是Hap_36(为南通、浙江、福建、广东、广西群体共享)。美国和日本群体与5个中国群体均没有共享单倍型, 而在中国的5个群体中至少在2个群体间出现共享单倍型, 所有的群体均出现私有单倍型。广西群体包含最多的多态性位点(114个), 其次为浙江群体(96个), 美国群体的多态性位点最少(16个), 7个群体的多态性位点多少的前后顺序大体与在COI序列中出现的结果一致。

所有群体均表现出较高水平的核苷酸多样性, 其中浙江群体的核苷酸多样性最大(π=0.014 9), 美国群体最小(π=0.003 47), 在MNR序列中检测到的核苷酸多样性总体水平大于在COI序列中检测到的核苷酸多样性。在单倍型多样性上5个中国群体都有着接近1的高水平, 而日本和美国群体相对较低, 分别为0.801和0.882。平均核苷酸差异在7个群体中存在较大的差别, 主要体现在中国群体要明显大于美国和日本群体, 其中浙江群体最高(9.490), 日本群体最低(2.199)(表 3)。

表 3 熊本牡蛎7个群体MNR序列的遗传多样性参数和中性检验值 Tab. 3 Genetic diversity parameters and neutral test values for MNR in the seven populations of C. sikamea
群体 s H k h π/% Tajima’D Fu’s Fs
ZJ 96 30 9.490±4.497 1.000±0.009 1.494±0.785 −2.236* −23.757**
FJ 71 26 6.657±3.232 0.988±0.013 1.045±0.568 −2.2064* −14.347**
GD 77 25 6.936±3.362 0.989±0.014 1.089±0.588 −2.171* −14.194**
GX 114 29 7.214±3.477 0.998±0.009 1.134±0.608 −2.318** −19.857**
NT 67 28 6.031±2.962 1.000±0.009 0.941±0.514 −2.196* −24.798**
US 16 9 13.671±1.947 0.882±0.051 0.581±0.345 −0.649 −1.089
JAP 29 14 2.199±1.259 0.801±0.087 0.347±0.221 −2.465** −3.757**
注: *表示显著性P<0.05; **表示显著性P<0.01; s为多态位点数; H为单倍型数目; k为平均核苷酸差异; h为单倍型多样性; π为核苷酸多样性
表选项
2.3 熊本牡蛎不同群体遗传结构特征分析

从基于COI序列分析来看, 中国5个野生群体两两间的FST值较低, 为−0.015 57~0.001 65, 其中广东群体与浙江群体间的FST值最小(−0.015 57), 中国5个群体除浙江群体与福建群体外, 其余两两群体间的FST值均为负值, 说明中国群体间基本不存在遗传分化, 而美国、日本群体与中国5个群体间的FST值均为正值且存在极显著的较高程度遗传分化(FST> 0.2, P<0.01), 而日本群体与美国群体间并不存在明显的遗传分化(表 4)。将日本、美国群体作为对照群体与中国5个群体进行比较, AMOVA结果显示组间的变异百分比(25.61%)要明显大于组内群体间(−0.48%), 说明美国、日本群体与中国的5个群体存在着极显著的较大程度的遗传分化(P<0.01), 而中国5个群体间则没有明显的遗传分化。浙江、福建、广东、广西、南通群体内个体间存在较为显著的遗传分化(P<0.05), 为主要的变异来源(74.87%)(表 6)。以美国的养殖群体作为对照, 发现中国、日本的野生群体也存在着极显著的遗传分化(P<0.01), 但与将美国、日本作为对照的分析结果不同的是对照组的变异百分比(10.58%)并不占绝对优势, 6个野生群体间也占据一定比重的变异百分比(8.58%), 这说明中国群体与日本群体也有着一定程度的遗传分化, 这可能与美国养殖的熊本牡蛎由日本引入有很大关系。以日本群体作为对照, 对比中国5个群体, 结果表明中、日群体间存在着极显著的遗传分化, 并且其变异百分比的构成(表 6, 组间: 26.42%, 组内群体间: −0.45%)与以日本、美国群体为对照的AMOVA结果(表 6, 组间: 25.61%, 组内群体间: −0.48%)非常相似, 由此可见在COI序列中美国与日本群体间有非常接近的亲缘关系。中性检验结果表明, 7个群体的Tajima’D值和Fu’s Fs值均为负值但是美国群体的结果并不显著(P>0.05), 这说明除美国群体外, 中国和日本野生群体极有可能均经历了历史扩张(P<0.01)。

表 4 基于 COⅠ的熊本牡蛎7个群体成对的FST值 Tab. 4 Paired FST values for COⅠ in the seven populations of C. sikamea
群体 ZJ FJ GD GX NT US JAP
ZJ 0
FJ 0.001 65 0
GD −0.015 57 −0.003 67 0
GX −0.009 09 −0.007 69 −0.008 26 0
NT −0.010 16 −0.007 35 −0.008 94 −0.010 65 0
US 0.243 13** 0.270 94** 0.272 07** 0.219 19** 0.245 53** 0
JAP 0.291 17** 0.311 47** 0.313 43** 0.270 75** 0.297 71** 0.008 22 0
表选项

表 5 基于 MNR的熊本牡蛎7个群体成对的FST值 Tab. 5 Paired FST values for MNR in the seven populations of C. sikamea
群体 ZJ FJ GD GX NT US JAP
ZJ 0
FJ −0.002 83 0
GD −0.008 00 −0.007 19 0
GX −0.001 01 −0.002 74 −0.007 61 0
NT −0.007 23 −0.011 62 −0.010 48 −0.008 47 0
US 0.100 49** 0.143 69** 0.131 81** 0.121 91** 0.123 92** 0
JAP 0.059 05** 0.085 88** 0.084 52** 0.075 99** 0.064 27** 0.109 68* 0
表选项

表 6 熊本牡蛎7个群体的COⅠ序列AMOVA分析 Tab. 6 AMOVA analysis of COⅠ sequences in the seven populations of C. sikamea
分组 变异来源 自由度 方差分组 变异百分比 P
(US)&
(FJ, GD, GX, NT, ZJ, JAP)		 组间 1 0.218 8 Va 10.58 0.000 0
组内群体间 5 0.177 7 Vb 8.58 0.000 0
群体内个体间 181 1.674 9 Vc 80.86 0.283 1
(JAP, US)&
(FJ, GD, GX, NT, ZJ)		 组间 1 0.572 9 Va 25.61 0.000 0
组内群体间 5 −0.010 6 Vb −0.48 0.748 4
群体内个体间 181 1.674 9 Vc 74.87 0.041 7
(JAP)&
(FJ, GD, GX, NT, ZJ)		 组间 1 0.634 3 Va 26.42 0.000 0
组内群体间 4 −0.010 7 Vb −0.45 0.786 7
群体内个体间 164 1.776 9 Vc 74.02 0.165 9
表选项

从基于MNR序列分析来看, 中国5个海区分布的熊本牡蛎两两群体间的FST值较低且均为负值, 其中南通群体与福建群体间的FST值最小(−0.011 6), 这与上述在COI序列中分析的结果一致, 表明中国5个群体间不存在明显的遗传分化(表 5)。而美国、日本群体与中国野生群体间存在较大的FST值, 其中美国群体与福建群体的FST值最大(0.143 7), 不同于在COI序列中分析的结果, 虽然美国、日本群体都与中国群体有着显著的遗传分化, 但分化程度不如在COI序列中分析的结果高。但是美、日群体间也存在着显著的中等程度分化(FST=0.109 68), 这说明MNR序列较之COI序列更灵敏, 更具有遗传多样性分析潜力。AMOVA结果显示3个不同的对比分组群体内个体间的变异百分比占据了变异来源的绝大部分(表 7, 分别为89.65%、92.37%、95.13%), 这与MNR序列更为灵敏有关, 并且组间的变异百分比都要大于组内群体间(8.98%>1.36%; 7.32%>0.30%; 5.12%>−0.24%), 其中以美国群体与6个野生群体进行比较时, 其组内群体间的百分比要稍大于另外两种不同的分类比较方式(1.36%>0.30%, −0.24%)并且有较高的显著性(P<0.05), 说明基于MNR序列, 日本群体与中国群体之间存在着一定程度的遗传分化, 同时也能说明中国5个群体间不存在遗传分化, 这与在COI序列中分析的结果大体一致。基于MNR序列的中性检验结果也同样反映了除美国群体外, 其他6个群体均可能经历过历史扩张。

表 7 熊本牡蛎7个群体的 MNR序列AMOVA分析 Tab. 7 AMOVA analysis of MNR sequences in the seven populations of C. sikamea
分组 变异来源 自由度 方差分组 变异百分比 P
(US)&
(FJ, GD, GX, NT, ZJ, JAP)		 组间 1 0.320 1 Va 8.98 0.000 0
组内群体间 5 0.048 5 Vb 1.36 0.015 9
群体内个体间 181 3.193 7 Vc 89.65 0.142 4
(JAP, US)&
(FJ, GD, GX, NT, ZJ)		 组间 1 0.253 2 Va 7.32 0.000 0
组内群体间 5 0.010 5 Vb 0.30 0.275 7
群体内个体间 181 3.193 7 Vc 92.37 0.049 2
(JAP)&
(FJ, GD, GX, NT, ZJ)		 组间 1 0.179 1 Va 5.12 0.0161
组内群体间 4 −0.008 5 Vb −0.24 0.880 1
群体内个体间 164 3.330 6 Vc 95.13 0.161 9
表选项
3 讨论

熊本牡蛎作为重要牡蛎资源, 了解其野生及养殖驯化群体遗传结构及遗传多样性显得尤为重要。动物线粒体基因DNA拥有结构简单、进化速度快、呈母系遗传的特点, 并且在基因组不同区域有着一定程度的进化速度的差别, 适合用于遗传多样性的研究[19]。本研究中, 利用COⅠ序列以及MNR序列比较了熊本牡蛎6个野生群体以及美国养殖群体遗传结构、特征和遗传多样性。发现养殖群体与野生群体的遗传多样性差异, 特别是基于MNR序列的分析发现美国养殖群体与其引种来源的日本群体产生了中等程度的遗传分化。研究结果为充分开发和保护熊本牡蛎种质资源, 辅助熊本牡蛎优质新品种培育提供了重要参考信息。

从整体上看, 无论是基于COI序列还是MNR序列, 美国养殖群体的多态性位点和单倍型数目都小于6个亚洲野生群体(表 4、表 5); 且所有中国群体单倍型多样性(>0.5)、核苷酸多样性(>0.005)均处于较高水平, 尤其是在MNR序列中体现出更高的水平。而单倍型多样性指数与核苷酸多样性指数是能够较为直接地反映出物种遗传多样性的指标。因此中国熊本牡蛎的野生群体遗传多样性普遍较高, 说明中国的熊本牡蛎群体处于一个稳定的大环境中, 彼此间可能存在较强的基因交流[14], 也可从中推测中国的野生熊本牡蛎经历了漫长的进化历史。相比之下, 美国群体与日本群体的熊本牡蛎的遗传多样性则要小很多。美国群体在遗传多样性上处于较低水平, 并且在COI序列的分析其低于野生的日本群体, 这可能是美国群体熊本牡蛎从日本流入并经过多代选育有关。例如经过驯化人工养殖的鲢鱼群体在遗传多样性上就呈现出较低水平[21]; 此外, 在经过三代选育后, 长牡蛎遗传多样性低于野生群体[22]。然而, 熊本牡蛎日本群体虽然也是野生群体, 但是其单倍型多样性以及核苷酸多样性都也出现了显著低于中国群体的现象, 呈现为高单倍型多样性, 低核苷酸多样性水平h>0.5, π<0.005)的情况说明该群体在历史上可能经历过瓶颈效应[23]。由一个较小有效群体向大群体快速扩张变异的过程, 从而导致单倍型多样性呈现较高水平而核苷酸多样性尚未扩大。这有可能是环境因素导致的, 熊本牡蛎偏好温暖海水环境, 相比之下日本纬度较高, 导致其适宜分布海域有限, 该海域的熊本牡蛎种群规模较小, 促使日本野生群体的遗传多样性水平较低。遗传多样性的高低不仅决定该群体的生存、繁殖能力, 同样反映出该群体适应环境的能力以及改良潜力。中国的5个野生群体均有着丰富的遗传多样性, 这表明中国的熊本牡蛎蕴含着较大的进化潜能和丰富的遗传改良基础[24], 这对中国的熊本牡蛎种质资源保护以及新品种创制具有积极意义。与之相对应的是美国的养殖群体, 较低的遗传多样性揭示了养殖过程存在着亲本数量较少而导致近亲繁殖, 使其生存能力降低。单倍型网络图中日本群体与美国群体单倍型聚为一群(图 1), 而美国群体与日本群体熊本牡蛎的亲缘关系相对于中国群体确实较近, 这与熊本牡蛎美国群体的引种历史相一致。

遗传分化指数(FST)是对2个群体间基因相关性的度量指标, 从两个不同区间的线粒体序列综合来看, 中国的5个野生群体两两间的FST都为负值这说明中国野生的熊本牡蛎不存在遗传分化, 群体间的亲缘关系较近, 基因交流较为频繁。在COI序列分析中中国群体与日本、美国群体的FST则较大, 存在着较大且极显著的遗传分化。有研究报道中、日、韩3个地理群体的熊本牡蛎存在着显著的遗传分化, 这与我们的部分研究结果一致, 并且地理隔绝应该是造成这种情况最主要的因素[25]。牡蛎幼虫的浮游时间为2~3周, 随着洋流的推动, 给同为中国南方的熊本牡蛎群体提供群体交流的机会, 而不足以扩张至日本与当地的熊本牡蛎进行基因交流。美国群体由日本引入, 无论从地理隔绝的角度还是从引种历史的角度, 都难以与中国群体产生有效交流。在MNR序列分析中中国群体与日本、美国群体的FST呈现中度的遗传分化, 这可能由于MNR序列位于非编码区, 具有较快的突变速率和更为丰富的多态性[26], 因此尽管美国的熊本牡蛎群体是由日本引进的, 但由于两个种群间并不存在基因交流, 所以体现出更为显著的种群分化。有研究利用MNR序列对入侵瓦登海的长牡蛎遗传多样性进行分析, 发现瓦登海北部的长牡蛎种群间具有较大程度的遗传分化, 并认为当地的养殖场繁育群体对物种入侵具有更强、更持久的影响[27]; 也有学者通过MNR序列对比欧洲和亚洲地区的福建牡蛎遗传多样性, 发现2个地区的福建牡蛎具有显著的遗传分化, 东北大西洋地区的福建牡蛎种群是独特的遗传资源, 具有重要的保护意义[28]。由此可见非编码区的MNR序列对于牡蛎的遗传多样性研究将发挥更为重要的作用。

AMOVA结果显示熊本牡蛎日本来源群体(日本、美国群体)与中国群体间存在极显著遗传分化(P<0.01); 而中国的5个群体间并不存在遗传分化, 这与在FST值中分析所得出的结果一致。而以美国养殖群体, 与亚洲6个野生群体比较, 结果显示美国养殖群体与野生群体间存在着极显著的遗传分化(P<0.01)。与此同时, 日本与中国野生群体间也存在显著的遗传分化, 但占了较小的变异百分比, 推测出日本群体由于与中国群体间存在着地理隔绝, 导致基因型的差异, 从而产生遗传分化。中性检验中, 中国群体和日本群体均发生历史扩张, 推测可能是冰川时期的气候寒冷使得海平面降低, 此时的熊本牡蛎群体生活在狭小海域, 而后随着冰期结束海平面上升, 多个狭小海域之间的屏障逐渐消失, 熊本牡蛎远古种群也因此向更广阔的海域扩张[25], 这使得牡蛎种群数量产生显著扩张, 在中性检验中得以体现。而美国群体未经历历史扩张的结果与熊本牡蛎不是美国本地种而是引进种的历史纪录相一致。各遗传多样性指标表明, 熊本牡蛎美国群体在经过人工选育后对其遗传多样性和遗传结构产生影响, 表现为生长速度快但遗传多样性有所下降, 这可能与人工选择压力和当地较温和的养殖环境有关。而中国沿海熊本牡蛎在生长性状上尚有很大的改良空间, 研究结果为今后熊本牡蛎新品种的创制中亲本选择及如何保持群体遗传多样性, 防止种质退化的发生提供了参考。

4 结论

总之, 基于MNR序列和COI序列对中国5个地理群体和美国、日本群体进行遗传多样性和遗传结构分析, 我们确定中国的野生群体在遗传多样性上具有较高水平, 尤其在MNR序列中有更多的单倍型多样性, 而与之相对应的是日本的野生群体也呈现出遗传多样性相对偏低的情况, 美国的养殖群体的遗传多样性水平更低, 存在着种质资源退化的风险。并且美、日群体间存在着显著的遗传分化, 这是美国群体从日本引进后经历漫长的人工养殖, 并且存在地理隔绝导致的。本研究为保护熊本牡蛎的遗传多样性并为后续选择育种群体以及选择杂交育种群体组合提供了参考。

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