2024, Vol. 48
表1(Table 1)
不同形态金藻对菲律宾蛤仔幼虫生长发育的影响
文章信息
- 刘雨佳, 唐保军, 魏涛, 吕小康, 苏志星, 杨立国, 徐加元. 2024.
- LIU Yujia, TANG Baojun, WEI Tao, LYU Xiaokang, SU Zhixing, YANG Liguo, XU Jiayuan. 2024.
- 不同形态金藻对菲律宾蛤仔幼虫生长发育的影响
- Effects of different forms of Isochrysis galbana on the growth and development of Ruditapes philippinarum larvae
- 海洋科学, 48(9): 44-51
- Marine Sciences, 48(9): 44-51.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240507001
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文章历史
- 收稿日期：2024-05-07
- 修回日期：2024-07-29
引用本文
刘雨佳, 唐保军, 魏涛, 吕小康, 苏志星, 杨立国, 徐加元. 2024. 不同形态金藻对菲律宾蛤仔幼虫生长发育的影响[J]. 海洋科学, 48(9): 44-51.
LIU Yujia, TANG Baojun, WEI Tao, LYU Xiaokang, SU Zhixing, YANG Liguo, XU Jiayuan. 2024. Effects of different forms of Isochrysis galbana on the growth and development of Ruditapes philippinarum larvae[J]. Marine Sciences, 48(9): 44-51.
不同形态金藻对菲律宾蛤仔幼虫生长发育的影响
1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306;
2. 中国水产科学研究院东海水产研究所, 上海 200090;
3. 宁海渔业创新研究中心, 浙江 宁波 315600
2. 中国水产科学研究院东海水产研究所, 上海 200090;
3. 宁海渔业创新研究中心, 浙江 宁波 315600
摘要：为了评估不同形态的球等鞭金藻(Isochrysis galbana)对菲律宾蛤(Ruditapes philippinarum)仔幼虫生长发育的效果, 本研究选择人工培养的球等鞭金藻3011、金藻粉和金藻泥作为饵料, 投喂菲律宾蛤仔D形幼虫, 测定了幼虫的密度、相对生长率以及淀粉酶(AMY)、丝裂原活化蛋白激酶1 (MAPK1)和胰岛素样生长因子(IGF)的基因表达水平。结果显示, 投喂活体球等鞭金藻的菲律宾蛤仔幼虫在生长速度和存活率方面均优于投喂金藻粉和金藻泥的幼虫, 表明干燥处理和浓缩冷冻会影响金藻的营养价值; 投喂藻泥的蛤仔幼虫存活率高于藻粉组, 但生长率低于藻粉组; 饥饿的蛤仔幼虫生长速度、存活率、淀粉酶和生长发育相关基因的表达均处于较低水平。本研究表明, 合适的饵料供给对菲律宾蛤仔幼虫的生长发育至关重要, 金藻粉和金藻泥还不能完全替代活体金藻, 在生产中可以作为添加剂部分替代活体金藻。本研究可为菲律宾蛤仔幼虫营养需求和工厂化人工育苗技术研究提供参考。
关键词：菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum) D形幼虫 壳长 密度 基因表达
Effects of different forms of Isochrysis galbana on the growth and development of Ruditapes philippinarum larvae
1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China;
3. Ninghai Fisheries Innovation Research Center, Ningbo 315600, China
2. East China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China;
3. Ninghai Fisheries Innovation Research Center, Ningbo 315600, China
Abstract: The effect of different forms of Isochrysis galbana on the growth and development of D-shaped Ruditapes philippinarum larvae was evaluated by feeding them with artificially cultured I. galbana 3011, dried I. galbana powder, and concentrated liquid I. galbana. The larval density, relative growth rate, and expression levels of amylase (AMY), mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), and insulin-like growth factor (IGF) genes were determined. The results showed that larvae fed with live I. galbana outperformed those fed with I. galbana powder or concentrated liquid I. galbana in terms of growth rate and survival, indicating that drying and concentration freezing affected the nutritional value of I. galbana. The survival rate of larvae fed with concentrated liquid I. galbana was higher than that of larvae fed with algal powder, but the growth rate was lower. Decreased growth rate, survival, AMY, MAPK1, and IGF expression were observed in starved larvae. This study demonstrated that a correct food supply is essential for the growth and development of R. philippinarum larvae and that dried I. galbana powder or concentrated liquid I. galbana is not a complete substitute for live I. galbana and can be used as additives during production. This study provides a reference for the nutritional requirements of R. philippinarum larvae and large-scale artificial reproduction technology.
Key words:
Ruditapes philippinarum D-shaped larvae shell length density gene expression
菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)隶属双壳纲(Bivalvia)、帘蛤目(Venerida)、帘蛤科(Veneridae)、蛤仔属(Ruditapes), 俗称花蛤、杂色蛤、蛤蜊等, 是广温、广盐的海水贝类, 主要生活在潮间带至水深20 m的浅海泥沙底质中, 在中国南北沿海均有分布[1-2]。菲律宾蛤仔生长迅速、养殖周期短, 是一种适合人工高密度养殖的优良贝类, 是中国四大养殖贝类之一[1, 3]。
优质苗种的稳定供应是贝类养殖产业可持续发展的重要前提。随着养殖面积的扩大, 对菲律宾蛤仔苗种的需求量也越来越大。目前, 中国北方地区菲律宾蛤仔养殖苗种主要依靠南方土池育苗获得, 俗称“南苗北养”[4-5]。受全球气候变化、种质退化等原因影响, 近年来菲律宾蛤仔土池育苗死亡率升高, 产量不稳定, 严重制约了产业的发展, 养殖用苗种对室内工厂化育苗的依赖性越来越大。因此, 建立稳定、可靠的室内工厂化育苗技术体系对菲律宾蛤仔养殖产业健康发展具有重要意义。
室内工厂化育苗包括藻类培养、亲贝促熟、催产、幼虫培育、中间培育等不同阶段[6], 其中幼虫培育是决定工厂化育苗成败的重要环节。菲律宾蛤仔不同的生长时期的营养需求也有所差异, 金藻(Isochrysis galbana)是双壳贝类幼虫发育的重要开口饵料, 广泛应用于海洋双壳贝类工厂化育苗中[7-8]。但是金藻的培养受天气和设施条件影响较大, 且培养过程中易受细菌和原生动物污染, 常因藻类供应不足导致育苗失败。为了解决贝类工厂化育苗过程中单胞藻饵料的不足, 已开展了代用饵料或人工配合饲料的研究[9]。随着藻类浓缩技术的进步, 近年来, 国内企业陆续开发出了藻粉型和藻泥型金藻饵料, 但这些饵料在工厂化育苗中的效果尚未开展系统评估。
本研究选择人工培养的金藻液、金藻粉和金藻泥作为饵料, 投喂菲律宾蛤仔D形幼虫, 通过测定壳长、密度和消化、发育相关基因的表达变化, 评估不同形态的金藻饵料对菲律宾蛤仔幼虫生长发育的效果。本研究可为菲律宾蛤仔工厂化育苗和金藻的浓缩制备技术研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用的菲律宾蛤仔亲贝采集自广东饶平, 运至东海水产研究所宁海研究中心, 经高锰酸钾浸浴消毒后, 于室内阴干约6 h[10], 然后放入30 m3水泥池催产, 海水温度25.5~26.0 ℃, 盐度19.0。受精卵孵化至D形幼虫后, 显微镜计数密度, 用350目筛绢网收集用于实验。
实验用的金藻饵料分别为3种: 人工培养的球等鞭金藻3011藻液、金藻粉和金藻泥。球等鞭金藻于5 L三角瓶中室温培养, 采用f/2培养基, 气温24~30 ℃, 盐度19.0, 光照强度3 000 Lx, 每天光照15 h, 不通气培养, 每天定时摇动4次。培养5 d后, 以血球计数板统计藻液浓度用于实验。金藻粉和金藻泥购自生物公司, 以泡沫箱加冰袋运输, 运至实验基地后–20 ℃保存。
1.2 实验设置实验在50 L的塑料桶中进行, 每种饵料设3个平行, 另设不投饵的饥饿组。实验用海水经砂滤和400目滤网过滤, 每桶加30 L的海水。从培养大池中将刚孵化的D形幼虫转移至塑料桶中, 每桶幼虫初始密度约9个/mL, 海水温度25.5~26.0 ℃, 盐度19.0, 水体持续充气。金藻液按20 000个/mL投喂, 每日早晚八点各投喂1次。按照说明书, 金藻粉称取1g溶于1 L过滤海水, 金藻泥称取15 g溶于1 L海水, 经350目滤网过滤投喂幼虫, 考虑到滤洗过程中的损失, 投喂的藻液浓度高于活体金藻液, 每次投喂50 mL。每日换水1/2, 前3 d用350目滤网换水, 之后用300目滤网换水。实验持续7 d。
1.3 测定指标 1.3.1 幼虫密度和生长每天固定时间从每个塑料桶中取水样5 mL, 置透明胚胎皿内, 显微镜下计数D形幼虫密度, 同时用目镜测微尺测定幼虫的壳长, 参照田园等[11]的方法计算相对生长率。
相对生长率= (lnSn – lnS0) / (tn – t0),
式中: Sn是第n天幼虫的平均壳长(μm), S0是实验开始时幼虫的平均壳长(μm), t0和tn分别是两次取样的时间点(d)。
1.3.2 幼虫消化和发育基因表达特征按上述实验设置, 另设基因表达样品取样组。在实验的第0、1、3、5、7天用350目滤网从各塑料桶收集幼虫, 用过滤海水冲洗后, 加入RNA保存液。使用Biospin总RNA提取试剂盒(博日)提取幼虫组织样本RNA。采用Thermo公司的NanoDrop ND-2000C分光光度计测定RNA浓度和纯度。用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性, 使用Prime ScriptTM RT Master Mix试剂盒(TaKaRa)进行反转录。
使用Real PCR EasyTM Mix-SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒(Foregene)在Quant Studio实时荧光定量PCR系统上进行实时PCR, 反应程序为: 94 ℃下预变性5 min, 94 ℃下变性30 s, 55 ℃下退火30 s, 72 ℃下延伸1 min, 共进行35个循环。测定α-淀粉酶(AMY)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)和胰岛素样生长因子(IGF)的基因表达水平。选用β-actin作为内参基因[12], 荧光定量PCR中AMY基因引物使用Primer Premier 5.0设计, 其他引物序列根据NIE[13]合成, 引物序列如表 1所示。实时荧光定量PCR的结果采用2–△△Ct方法计算目的基因的相对表达量。
表 1 实验中所用的引物序列 Tab. 1 Primer sequences
| 基因 | 序列 |
| AMY-F | ACTTGGATTTGGGAACCTTCAC |
| AMY-R | TCGTCGCTCCATATATAATCAAAG |
| MAPK1-F | GGTTCCCCAAAATCAGTTGAAGGC |
| MAPK1-R | CTCTTAGCCAACCACAGCCACTG |
| IGF-F | TGGCGGATTGTGCGGTTGTTG |
| IGF-R | TGAAGGCTGTCCCCACTCTCAC |
| β-actin-F | CCTTGAGAAGAGCTACGA |
| β-actin-R | GATACCAGCAGATTCCATACCC |
使用Excel2016软件整理测得的幼虫生长发育数据并绘图, 所有试验数据均以平均值±标准差表示(mean±S.D.)。利用SPSS 26.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA), 采用Duncan法进行多重比较, 显著性水平设为0.05。
2 结果 2.1 不同金藻饵料的形态及幼虫摄食情况不同金藻饵料的形态如图 1所示。100倍显微镜下显示, 球等鞭金藻细胞长约5~7 μm, 在水中活泼运动, 摄食球等鞭金藻的菲律宾蛤仔幼虫胃部金黄色, 表明幼虫摄食正常。藻粉为黄褐色粉末, 溶于海水过滤后为黄褐色液体, 显微镜下为直径5~30 μm的颗粒, 投喂藻粉的菲律宾蛤仔幼虫胃部略带金黄色, 但颜色较藻液组浅。冷冻的藻泥为块状, 融化过滤后为黄色液体, 显微镜下为直径5~100 μm的黄色颗粒, 投喂藻泥的菲律宾蛤仔幼虫胃部颜色较浅, 与饥饿组幼虫胃部颜色无明显差异。
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| 图 1 不同形态金藻饵料及在海水中的形态照片 Fig. 1 Different forms of Isochrysis galbana A.培养的金藻液; B.干金藻粉; C.金藻泥; 其中金藻粉和金藻泥溶在海水中后用350目筛绢过滤。 |
实验期间, 各处理组的菲律宾蛤仔D形幼虫密度逐渐下降(图 2)。投喂活体金藻的D形幼虫密度高于其他各处理组。投喂藻泥组幼虫密度高于藻粉组和饥饿组。至第7天时, 未再采集到藻粉组和饥饿组幼虫。
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| 图 2 投喂不同形态金藻的菲律宾蛤仔幼虫培养密度变化 Fig. 2 Density of R. philippinarum D larvae fed with different forms of I. galbana |
实验第1天时, 各处理组D形幼虫的平均壳长无显著差异(图 3)。第2天, 投喂活体金藻的D形幼虫壳长显著高于藻泥和饥饿组(P<0.05), 与藻粉组无显著差异, 自第3天起投喂活体金藻的D形幼虫壳长显著高于其他处理组(P<0.05)。投喂金藻粉的D形幼虫壳长在第2、3、4天显著高于藻泥组和饥饿组(P<0.05)。投喂金藻泥的D形幼虫壳长在第4天显著高于饥饿组(P<0.05), 其他时间无显著差异。
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| 图 3 投喂不同形态金藻的菲律宾蛤仔幼虫壳长变化 Fig. 3 Shell length of R. philippinarum D larvae fed with different forms of I. galbana |
投喂活体藻液的D形幼虫相对生长率相对稳定, 保持在0.07~0.09(表 2)。投喂金藻粉的D形幼虫相对生长率在0.04~0.07, 前期较高, 后期下降; 投喂金藻泥的D形幼虫相对生长率较低。
表 2 投喂不同形态金藻的菲律宾蛤仔幼虫相对生长率 Tab. 2 Relative growth rate of R. philippinarum D larvae fed with different forms of I. galbana
| 金藻形态 | 相对生长率 | ||||||
| 时间(d) | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | |
| 藻液 | 0.07±0.02 | 0.08±0.02a | 0.09±0.02a | 0.08±0.00a | 0.08±0.01a | 0.07±0.00a | 0.08±0.00a |
| 藻粉 | 0.06±0.02 | 0.07±0.00a | 0.06±0.00b | 0.05±0.00b | 0.04±0.00b | 0.05±0.01b | |
| 藻泥 | 0.04±0.02 | 0.01±0.01b | 0.02±0.01c | 0.03±0.00c | 0.03±0.00b | 0.04±0.01b | 0.04±0.01b |
| 饥饿 | 0.02±0.03 | 0.02±0.02b | 0.02±0.01c | 0.02±0.00d | 0.02±0.00c | 0.04±0.00b | |
| 注: 不同小写字母表示在某个时间点不同处理组间具有显著性差异(P<0.05) | |||||||
随着培养时间延长, 投喂活体藻液的D形幼虫AMY基因表达量逐渐上升, 至第7天略有下降(图 4)。藻粉组D形幼虫AMY基因表达量波动较大, 与藻液组相比, 第1天显著上升(P<0.05), 第3天下降(P<0.05)。藻泥组D形幼虫AMY基因表达量第1天显著低于藻液组(P<0.05), 第5天显著高于藻液组(P<0.05), 第7天又显著下降(P<0.05)。饥饿组D形幼虫AMY基因表达量显著低于藻液组(P<0.05)。
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| 图 4 投喂不同形态金藻的菲律宾蛤仔幼虫AMY基因表达变化 Fig. 4 Expression of AMY in R. philippinarum D larvae fed with different forms of I. galbana 注: *表示同一时间点与活体金藻组相比差异性显著(P<0.05)。 |
随着培养时间延长, 投喂活体藻液的D形幼虫MAPK1基因表达量保持稳定(图 5)。与藻液组相比, 藻粉组D形幼虫MAPK1基因表达量显著上升(P< 0.05), 藻泥组D形幼虫MAPK1基因表达量在第1、7天显著上升(P<0.05), 饥饿组D形幼虫MAPK1基因表达量下降, 并在第3天显著降低(P<0.05)。
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| 图 5 投喂不同形态金藻的菲律宾蛤仔幼虫MAPK1基因表达变化 Fig. 5 Expression of MAPK1 in R. philippinarum D larvae fed with different forms of I. galbana 注: *表示同一时间点与活体金藻组相比差异性显著(P<0.05) |
随着培养时间延长, 投喂活体藻液的D形幼虫IGF基因表达量逐步上升, 至第7天略有下降(图 6)。与藻液组相比, 藻粉组和藻泥组D形幼虫IGF基因表达量在第1天显著上升(P<0.05), 其后显著下降(P<0.05)。饥饿组D形幼虫IGF基因表达量显著低于活体藻液组(P<0.05)。
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| 图 6 投喂不同形态金藻的菲律宾蛤仔幼虫IGF基因表达变化 Fig. 6 Expression of IGF in R. philippinarum D larvae fed with different forms of I. galbana 注: *表示同一时间点与活体金藻组相比差异性显著(P<0.05)。 |
大量的研究和生产实践已经表明, 金藻是双壳贝类幼虫的优质开口饵料[8, 9, 14]。研究发现, 长牡蛎(Crassostrea gigas)在变态附着1个月内主要以脂肪作为能源物质[15], 脂肪酸和碳水化合物对长牡蛎幼虫的生长非常重要[16], 尤其是DHA、EPA和ARA[8, 17-18]。球等鞭金藻具有较高的脂肪含量, 且富含不饱和脂肪酸[8, 19], 本研究中投喂活体球等鞭金藻的菲律宾蛤仔幼虫生长较快, 应该与此有关。
本研究结果显示, 投喂金藻粉和金藻泥对菲律宾蛤仔幼虫的生长具有一定的效果, 但与投喂活体金藻相比, 在生长率和存活率方面仍存在一定差距。在其他研究中也有类似报道, 刘括等[20]发现, 投喂叉鞭金藻(Dicrateria sp.)的菲律宾蛤仔幼虫生长速度高于投喂海带(Saccharina japonica)磨碎液、大蒜(Allium sativum L.)汁、硅藻(Diatom)和酵母(Rhodotorula benthica)的幼虫; ALBENTOSA等[21]发现以冷冻干燥的褐指藻(Phaeoductylum)投喂短颈蛤(R. decussatus)稚贝, 其生长速度远低于投喂活体金藻和扁藻(Platy monas)的; ARNEY等[22]以喷雾干燥的螺旋藻投喂象拔蚌(Panopea generosa), 发现养殖效果不如投喂活体微藻的对照组。造成生长差异的原因可能与金藻的处理和保存方式有关, 藻液中为活体金藻细胞, 幼虫可摄入全部细胞营养成份。微藻的收获主要有絮凝、沉降、过滤、离心、气浮等方法[23], 藻粉、藻泥的浓缩和加工过程会造成细胞破损, 造成营养物质流失, 藻粉的加工还需要增加干燥工艺, 加工工艺的差别也会造成藻粉和藻泥间的营养差异; 同时, 受保存条件限制, 藻粉和藻泥需冷冻保存, 冻融过程也会导致细胞破裂, 造成脂肪酸等关键营养成份的损失, 也容易造成水质败坏, 从而影响幼虫的生长和存活。
也有研究发现, 以90%的干扁藻(Tetraselmis suecica)粉和10%的活体中肋骨条藻(Skeletonema costatum)投喂菲律宾蛤仔稚贝, 其生长速度与投喂活体藻的无差异[24], 与本实验的结果不一致, 表明同一贝类在不同生长阶段对营养的需求也有差异[9]。本研究中, 饥饿条件下, 菲律宾蛤仔幼虫壳长仍有一定的增加, 表明除单胞藻外, 菲律宾蛤仔幼虫可吸收海水中的其他营养物质, 之前的研究也表明双壳贝类幼虫可部分吸收海水中的可溶性营养物质[17]。
3.2 不同形态金藻对菲律宾蛤仔幼虫消化和发育基因表达的影响消化酶活力的大小在一定程度上反映了贝类对营养物质消化吸收的能力。α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中, 是贝类的主要消化酶之一[25]。本研究中, 投喂活体金藻的菲律宾蛤仔幼虫AMY基因表达水平逐步上升, 表明随着幼虫生长, 其消化碳水化合物的能力逐渐增强。黄勃等[26]在翡翠贻贝(Perna viridis)中发现, 淀粉酶的活力随个体生长不断增大。摄食藻粉和藻泥的蛤仔幼虫AMY基因表达水平呈现较大的波动, 表明这两种形态的金藻利用不足, 这可能与藻粉和藻泥中细胞破损有关, 是哪些营养成分的流失造成了这种波动, 具体的机制还需要进一步开展研究。研究发现, AMY的基因表达受食物供给的调节和影响, 长牡蛎消化腺中AMY的基因表达水平与食物浓度呈正相关[27]。长时间饥饿的皱纹盘鲍消化腺中AMY基因表达量可降至非常低的水平[28], 这与本研究中饥饿组幼虫的AMY基因表达水平显著降低一致。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路是真核生物信号传递网络中的重要途径之一, MAPK1在细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程中起着关键作用。研究表明MAPK信号通路在快速生长的菲律宾蛤仔群体中显著富集[13]。本研究中, 第1~7天投喂活体金藻的菲律宾蛤仔幼虫MAPK1表达稳定, 而投喂藻粉和藻泥组的MAPK1表达则出现了显著升高, 这种过表达是否是导致蛤仔幼虫生长发育缓慢的原因, 有待进一步研究。饥饿组MAPK1表达量降低, 表明食物缺乏影响了蛤仔幼虫的生长发育。胰岛素样生长因子(IGF)是调控机体生长发育的重要生长因子。研究表明, 大个体的菲律宾蛤仔IGF和其下游信号通路基因的表达水平显著高于小个体的蛤仔[29]。本研究中, 随着壳长增加, 投喂活体金藻的菲律宾蛤仔幼虫IGF基因表达水平逐步升高, 也表明IGF参与了菲律宾蛤仔生长调控。投喂藻粉和藻泥的蛤仔幼虫IGF表达则大幅波动, 饥饿组IGF表达显著降低, 表明食物供给影响了IGF基因表达。长牡蛎中也有类似发现, 食物丰度可显著改变IGF及其下游信号通路基因的表达水平[30], 说明藻粉和藻泥对菲律宾蛤仔幼虫的营养供给不如活体金藻。
4 结论本研究分析了3种形态的金藻以及饥饿对菲律宾蛤仔幼虫生长发育的影响。投喂活体球等鞭金藻的菲律宾蛤仔幼虫在生长速度和存活率方面均优于投喂金藻粉和金藻泥的幼虫, 投喂藻泥的蛤仔幼虫存活率高于藻粉组, 但相对生长率低于藻粉组, 表明干燥处理和浓缩冷冻会影响金藻的营养价值, 金藻粉和金藻泥还不能完全替代活体金藻, 在生产中可以作为添加剂部分替代活体金藻。饥饿的蛤仔幼虫生长速度、存活率、淀粉酶和生长发育相关基因的表达均处于较低水平, 表明合适的饵料供给对蛤仔幼虫的生长发育至关重要。本研究可为菲律宾蛤仔幼虫营养需求研究提供参考。
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