2024, Vol. 48
表1(Table 1)
C6-HSL信号及群体淬灭对海洋聚球藻(Synechococcus)菌藻共栖体系的调控作用
文章信息
- 乔真, 李佳霖, 秦松. 2024.
- QIAO Zhen, LI Jialin, QIN Song. 2024.
- C6-HSL信号及群体淬灭对海洋聚球藻(Synechococcus)菌藻共栖体系的调控作用
- Regulatory effects of the C6-HSL signal molecule and quorum quenching on marine Synechococcus in the bacteria–algal system
- 海洋科学, 48(9): 52-62
- Marine Sciences, 48(9): 52-62.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240130004
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文章历史
- 收稿日期：2024-01-30
- 修回日期：2024-04-15
引用本文
乔真, 李佳霖, 秦松. 2024. C6-HSL信号及群体淬灭对海洋聚球藻(Synechococcus)菌藻共栖体系的调控作用[J]. 海洋科学, 48(9): 52-62.
QIAO Zhen, LI Jialin, QIN Song. 2024. Regulatory effects of the C6-HSL signal molecule and quorum quenching on marine Synechococcus in the bacteria–algal system[J]. Marine Sciences, 48(9): 52-62.
C6-HSL信号及群体淬灭对海洋聚球藻(Synechococcus)菌藻共栖体系的调控作用
1. 中国科学院烟台海岸带研究所 海岸带生物学与生物资源利用重点实验室, 山东 烟台 264003;
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. 中国科学院大学, 北京 100049
摘要：为探究细菌群体感应己酰-L-高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-Homoserine lactone, C6-HSL)信号和群体淬灭作用对海洋聚球藻(Synechococcus)生长及藻菌互作关系的调控作用, 以采集自南黄海中部表层海水的聚球藻富集样品进行培养实验, 使用流式细胞术、高通量测序检测培养体系的细胞丰度、群落组成; 构建共现性网络, 明确C6-HSL对培养体系中微生物的相互作用程度的影响。结果显示C6-HSL信号可以促进聚球藻生长, 7 d培养周期结束时实验组中聚球藻丰度约为对照组的1.83倍, 而对细菌生长无明显促进作用; C6-HSL信号改变了培养体系中的细菌群落组成, 其中α-变形菌中Rhodobacteraceae和Thalassospira属的占比升高, 而γ-变形菌中Marinobacter属的占比下降, 构建的共现性网络显示体系中微生物互作程度和网络紧密度均降低。分离聚球藻共栖细菌, 筛选获得具有C6-HSL群体淬灭活性的6株菌, 分别属于变形菌门(Proteobacteria, 5株)和厚壁菌门(Firmicutes, 1株), 可以通过胞内途径实现群体淬灭; 群体淬灭活性菌能够促进聚球藻生长, 且群体淬灭活性强的菌株促生作用更强。本研究论证了群体感应C6-HSL信号和细菌的群体淬灭能力对聚球藻和共栖细菌的互作关系有调控作用, 为后续深入探索基于群体感应信号分子作用的藻菌互作关系的研究提供了新的科学依据。
关键词：海洋聚球藻 群体感应抑制活性 藻菌相互作用 C6-HSL CV026
Regulatory effects of the C6-HSL signal molecule and quorum quenching on marine Synechococcus in the bacteria–algal system
1. Key Laboratory of Coastal Biology and Bioresource Utilization, Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China;
2. University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China
2. University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049, China
Abstract: This study aimed to explore the regulatory effects of N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C6-HSL) signal and quorum quenching on the growth and algal–bacterial interactions of marine Synechococcus. Enriched culture samples of Synechococcus were collected from surface waters of the central South Yellow Sea. Flow cytometry and high-throughput sequencing were used to analyze cell abundance and microbial community composition. Furthermore, microbial co-occurrence networks were constructed to assess the influence of C6-HSL on the extent of microbial interactions in the culture system. The results revealed that the growth of Synechococcus was significantly enhanced by C6-HSL, with its abundance in the experimental group being approximately 1.83 times higher than that in the control group after a 7-day cultivation period. However, no significant effect was observed on heterotrophic bacterial growth. C6-HSL signals altered the composition of bacterial communities within the culture system, thereby increasing the proportion of Rhodobacteraceae and Thalassospira in alpha-proteobacteria and decreasing the proportion of Marinobacter in gamma-proteobacteria. The addition of C6-HSL reduced microbial interactions and network tightness. Six strains exhibiting C6-HSL quenching activity were isolated from Synechococcus culture samples, of which five were identified as Proteobacteria and one as Firmicutes. These strains achieved quorum-quenching activity through the intracellular pathway. The bacteria displaying quorum-quenching activity promoted Synechococcus growth, with stronger effects observed for those with higher quorum-quenching activity. This study elucidated the regulatory effects of quorum-sensing C6-HSL signal and bacterial quorum-quenching ability on the interaction between Synechococcus and symbiotic bacteria, providing a scientific basis for further investigation into algal–bacterial interactions.
Key words:
marine Synechococcus quorum sensing inhibitory activity algal–bacterial interactions C6-HSL Chromobacterium violaceum 026
藻类与细菌共同构成海洋生态系统的重要组成部分, 二者之间复杂的相互作用关系决定着海水环境的动态平衡[1]。聚焦于藻菌相互作用关系, 人们从不同角度进行了深入的探索, 包括环境行为、理化特性和生物学过程等[2]。基于营养交流的互利共生是藻菌间相互作用的最基本形式, 藻类可以释放光合作用产物供细菌利用, 细菌可以同化和分解藻类释放的有机物, 并合成分泌微量元素等藻类必需营养物质, 藻菌间互补的代谢功能直接影响着两者的生长[3]。藻菌间还存在对环境营养物质的竞争作用和包括毒素释放和溶藻物质产生等在内的拮抗作用, 藻类和细菌能够调节自身的行为以适应或维持共生的环境[4]。近年来基于化学生态学理论, 研究人员发现藻菌间复杂的相互作用关系由多种化学信号介导, 群体感应信号分子是其中一类代表性的生物通讯信号[5]。
群体感应(quorum sensing, QS)是细菌进行交流的通讯方式, 细菌胞内酶催化合成信号分子并分泌到胞外, 当信号分子在胞外累积到一定浓度时, 感应分子对其识别进而引起受体蛋白的构象或基团变化, 最终激活靶基因的表达[6]。与之对应的是对群体感应任一环节的干扰都会抑制甚至阻断群体感应的发生, 即发生群体淬灭(quorum quenching, QQ)[7]。目前已发现了多种群体感应信号分子, 最常见的类型是在革兰氏阴性菌中发挥作用的酰基高丝氨酸内酯类信号(AHLs), 这类信号分子具有相同的环状结构, 差异在于酰基链的长度[8]。细菌具有很强的群体属性, 细菌功能的体现依赖于一定群体数量的形成和群落结构的建立, 细菌的群体感应和群体淬灭现象是其中的重要推动力[9]。
通过在藻际环境中检测及回补外源AHLs信号, 研究人员已明确了AHLs信号与藻菌关系间的相关性, AHLs信号既能够实现细菌的种内交流, 也能影响藻菌间的种间关系, 参与维持藻菌相互作用的平衡与稳定[5]。低浓度的AHLs信号分子(≤200 nmol/L)能够激活藻细胞的防御性反应, 显著促进小球藻(Chlorella vulgaris)的生长速率, 在AHLs物质的量浓度大于等于400 nmol/L时, 小球藻光合作用和生长速率受到抑制, 抗氧化系统也受到一定程度的损伤[10-11]。分离培养微囊藻共生菌群发现, AHLs介导的群体感应系统能够正向调控细菌胞外聚合物的产生, 促进形成细菌聚集体, 在微囊藻藻华生消过程中起到关键的调控作用[12]。一些弧菌属(Vibrio sp.)、亚硫杆菌属(Sulfitobacter sp.)细菌合成的AHLs分子能够减缓大型藻类石莼(Ulva sp.)孢子的游动速度, 并在不改变孢子游动定位方向和对光刺激反应的条件下, 抑制孢子后续的萌发与生长, 降低孢子的代谢速率[13]。红藻(Acrochaetium sp.)生活史的完成和幼体的释放受到藻共生菌分泌AHLs的严格调控, AHLs能够诱导藻孢子的产生与释放[14]。但目前的研究多局限于微藻和大型藻类的藻菌关系, 对于海洋中微微型藻类的研究还未广泛开展, 且目前的研究多集中于藻际环境中AHLs信号分子的识别以及藻类对AHLs信号的生理生化响应, 针对AHLs对藻际微生物群落结构调控能力的相关研究较少。
聚球藻(Synechococcus)是海洋中代表性的微微型藻类, 在海洋真光层中广泛分布, 贡献着海洋中约16.7%的初级生产力; 根据估算, 聚球藻在全球海洋中的年平均总丰度约为7×1026 cells, 高丰度、高固碳速率决定了聚球藻是全球海洋, 特别是近岸海域中重要的初级生产者[15-16]。对聚球藻和异养细菌间相互作用的研究发现, 同微藻和大型藻类一样, 聚球藻的共生环境中也存在特定的细菌类群, 聚球藻与异养细菌间同样存在互利共生、竞争拮抗等复杂的相互作用[17-19]。但在聚球藻与异养细菌间的相互作用关系中, AHLs信号是否同样发挥作用还未可知。生物检测法是目前最常用的检测细菌群体感应和群体淬灭能力的手段[20]。紫色杆菌(Chromobacterium violaceum 026, CV026)是一种兼性厌氧革兰氏阴性菌, 当有外源短链AHLs信号分子存在时群体感应系统CviR-CviI被激活, 分泌紫色菌素[21]。在本研究中, 以实验室富集培养的海洋聚球藻为研究对象, 针对短链AHLs信号分子中常见的己酰-L-高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-homoserine lactone, C6-HSL)分子, 探究了外源C6-HSL信号对藻菌生长及共生微生物群落结构和互作网络的影响; 以紫色杆菌CV026为检测菌株, 分离并检测了聚球藻培养体系中具有C6-HSL信号淬灭能力的异养细菌及其群体淬灭活性和途径, 揭示了C6-HSL信号分子和细菌的群体淬灭能力对聚球藻和共栖异养细菌间相互作用的影响作用。
1 材料与方法 1.1 聚球藻及生物检测菌株培养本实验所用聚球藻富集样品采集自黄海中部表层海水(国家自然基金委共享航次-NORC2021-01, 13 894站位, 122.36 °E, 33.03 °N)。采用SNAX培养基培养, 培养条件为光照强度22 μmol/m2·s, 温度25 ℃, 光照周期光∶暗=12 h∶12 h[22]。指示菌株紫色杆菌CV026购于宁波明舟生物科技有限公司, 使用LB培养基培养[23]。
1.2 添加C6-HSL对培养体系中藻菌生长及微生物群落结构影响的测定取处于对数生长期的聚球藻藻液, 添加终浓度为25 nmol/mL的C6-HSL信号分子标品(上海麦克林公司), 设置3个平行, 培养7 d; 对照组不添加C6-HSL, 同样设置3个平行, 培养条件相同。实验中每24 h取1 mL聚球藻培养液, 加入终浓度0.8%的4%多聚甲醛经液氮速冻后, 采用流式细胞仪(BD FACSAriaTM)测定培养体系中聚球藻和细菌的细胞丰度。通过测定前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)以及488 nm(藻红蛋白, PE)和640 nm(藻蓝蛋白, PC)的荧光信号强弱, 确定聚球藻细胞丰度; SYBR Green I核酸染料染色后, 根据绿色荧光信号测定异养细菌丰度[24]。
在实验0 d和7 d分别取藻液过滤至孔径为0.22 μm的聚碳酸酯滤膜(Millpore)上, 提取样品DNA, 采用RNA聚合酶16S rRNA基因V4区通用引物515F和806R进行DNA片段扩增。扩增产物经电泳、回收后, 由美吉生物科技有限公司(中国, 上海)完成高通量测序。测序结果提交至NCBI数据库(OR905713-OR905719)。
1.3 聚球藻共栖异养细菌的分离及群体淬灭活性检测取阻滞期聚球藻培养液0.45 μm滤膜过滤, 梯度稀释并涂布于LB固体培养基和TCBS培养基[25], 涂布接种后30 ℃恒温培养, 3~7 d后划线纯化至单菌落30 ℃、180 r/min恒温振荡培养48 h。紫色杆菌CV026活化后培养至对数生长期(OD600 nm≈0.7)。LB琼脂培养基平板中分别涂布CV026菌液和C6-HSL水溶液(200 μmol/mL)500 μL, 放置无菌滤纸片, 向滤纸片上滴加5 μL待测菌液, 以LB空白培养基作为空白对照, 根据滤纸片外是否产生色素抑制圈判定待测菌液的C6-HSL信号分子群体淬灭活性[26]。
1.4 群体淬灭菌株的鉴定提取待测菌株的基因组DNA, 采用细菌16S rRNA通用引物27F和1 429R, 对提取到的细菌基因组DNA进行PCR扩增[23]。PCR产物琼脂糖凝胶电泳后切胶后进行胶回收, 纯化后的DNA片段TA克隆至18-T质粒(TaKaRa公司), 转化导入DH5α大肠杆菌感受态细胞。提取阳性克隆质粒后送至青岛睿博兴科生物科技有限公司测序。将所测得的序列与模式菌株基因序列进行比对, 根据比对结果, 选择相近的菌株使用Mega11软件采用邻接法(neighbor joining)绘制系统发育树[27]。
1.5 菌株群体淬灭途径的辨别取对数期待测菌株菌液, 离心后分别收集上清液和沉淀菌体。上清液经0.22 μm滤膜过滤后使用乙酸乙酯萃取3次, 旋转蒸发仪真空浓缩后加入少量二甲基亚砜(DMSO)充分溶解备用[28]。沉淀菌体重悬于无菌MM培养基。参照1.3中方法分别检测待测菌株代谢物粗提物和菌体重悬液的群体淬灭活性, 以无菌MM培养基和DMSO作为空白对照。
1.6 菌株群体淬灭活性的定量测定紫色杆菌CV026活化后培养至对数生长期, 添加终浓度为10 μmol/mL的C6-HSL, 按表 1所示添加各组分。30 ℃、180 r/min振荡培养24 h后, 取1 mL培养液离心弃上清, 加入1 mL DMSO振荡溶解沉淀, 离心取上清液至96孔板中, 检测OD590 nm值[23]。
表 1 紫色菌素定量分析各组分添加量(单位: mL) Tab. 1 Amounts of components added to each group in the quantitative analysis of violacein (unit: mL)
| 组分 | 对照组 | 组1 | 组2 | 组3 | 组4 |
| LB培养基 | 3.89 | 3.89 | 3.89 | 3.89 | 3.89 |
| CV026 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 己酰-L-高丝氨酸内酯 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 细菌代谢物粗提物 | — | 0.01 | — | — | — |
| 二甲基亚砜 | — | — | 0.01 | — | — |
| 菌体重悬液 | — | — | — | 0.01 | — |
| MM培养基 | — | — | — | — | 0.01 |
| 注: “—”表示未添加该组分 | |||||
使用GraphPad Prism v9.0绘制聚球藻和异养细菌细胞丰度曲线。高通量测序由Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA)平台完成, 原始序列经FASTP v0.20.0质控后, 分别使用FLASH v1.2.7和UPARSE v7.1组装连接及去除嵌合体序列。利用Mothur v1.30.2按照97%的相似度将处理得到的序列合并为不同的操作分类单元(operational taxonomic units, OTU), 与silva 138/16S数据库进行16S rRNA参考比对。去除相对丰度低于总序列数0.01%的OTU后, 使用R语言中reshape2和ggplot2包绘制聚球藻相对丰度柱状图; psych包计算OTU间Spearman相关矩阵, 选取Spearman系数|ρ| > 0.6, P < 0.05的相关性矩阵, 使用Gephi v0.9.2构建共现性网络, 选用Fruchterman-Reingold布局算法连接和绘制网络的各个节点[29]。
2 结果与分析 2.1 聚球藻及共栖异养细菌生长对C6-HSL信号的响应培养过程中聚球藻和异养细菌的细胞丰度变化如图 1所示。添加C6-HSL促进了聚球藻的生长。空白对照组中聚球藻的细胞丰度在1 d达到峰值, 大约为9.5×106 cells/mL, 之后逐渐降低, 最终保持在3× 106 cells/mL左右。添加C6-HSL后聚球藻细胞丰度在第3 d达到峰值, 大约为1.2×107 cells/mL, 之后同样逐渐降低, 但与空白对照组相比总体下降趋势平缓。培养结束时实验组中聚球藻丰度约为空白组的1.83倍。添加C6-HSL对培养体系中异养细菌丰度的影响较小。在培养过程前期, 两组中异养细菌的丰度变化趋势基本相同, 从0 d开丰度逐渐升高, 在第2 d进入平稳期。实验结束时空白组中细菌丰度陡升, 实验组则相反。
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| 图 1 添加C6-HSL后聚球藻和异养细菌的丰度变化 Fig. 1 Changes in the abundance of Synechococcus and heterotrophic bacteria after the addition of C6-HSL |
实验中共筛选得到6株具有C6-HSL群体淬灭活性的菌株, 分别命名为B01-B06(图 2)。对比筛选得到的不具有群体淬灭活性的阴性对照菌, B01-B06菌株平板中的白色滤纸片上未出现紫色, 且滤纸片外均形成不透明白色菌圈, 表明B01-B06菌株具有对C6-HSL信号分子的群体淬灭活性, 且均未抑制紫色杆菌CV026的生长。6株细菌代谢物粗提物均不具有群体淬灭活性, 而菌体重悬液显示群体淬灭活性, 表明B01-B06菌株均通过胞内酶途径实现群体淬灭。根据6株16S rDNA的BLAST结果, 除B02菌株属于厚壁菌门(Firmicutes)外, 其余5株菌均属于变形菌门(Proteobacteria)。其中, B01和B03属于Citrobacter属; B02属于Bacillus属; B04属于Acinetobacter属; B05和B06属于Enterobacter属。
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| 图 2 菌株的群体淬灭活性检测及其系统发育树 Fig. 2 Detection of quorum-quenching activity of bacteria and bacterial phylogenetic tree |
不同菌株的菌体重悬液对紫色菌素产量的影响如图 3所示。6株菌对紫色菌素产生的抑制作用强弱不同, B01和B04菌株的抑制作用最强, B06菌株的抑制作用最弱。以无群体淬灭活性的菌株作为阴性对照, 结果未显示明显的抑制活性。以仅添加等量C6-HSL溶液的CV026培养液作为空白对照, B01-B06菌株的对紫色菌素产生的抑制率分别为79.19%、60.78%、48.87%、68.58%、41.16%和15.85%。
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| 图 3 菌株的菌体重悬液对紫色杆菌CV026紫色菌素产量的影响 Fig. 3 Effect of bacterial suspension of quorum-quenching strains on the production of violacein 注: **P < 0.01, 表示与对照组的差异 |
添加B01和B06菌株对聚球藻的生长均有不同程度的促进作用(图 4)。在添加两株群体淬灭菌的作用下, 聚球藻细胞丰度增量显著高于其他各处理组。同时添加C6-HSL和群体淬灭菌的处理组中聚球藻细胞丰度变化趋势与仅添加C6-HSL的处理组类似, 但同时添加B01菌株和C6-HSL的处理组中藻细胞丰度始终稍高于C6-HSL处理组; 而在添加B06菌和C6-HSL的处理组中则与之相反, 始终稍低于C6-HSL处理组。添加菌液后聚球藻藻液中异养细菌的丰度始终高于空白组, 并分别在实验第2 d和实验周期结束时出现较大增长。同时添加了菌液和C6-HSL的两个处理组中异养细菌的丰度均在第2 d明显增高, 从第3 d开始缓慢下降, 最终保持平稳。
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| 图 4 添加群体淬灭菌株后聚球藻和异养细菌的丰度变化 Fig. 4 Changes in the abundance of Synechococcus and heterotrophic bacteria after the addition of quorum-quenching bacteria |
聚球藻培养系统中共栖细菌DNA样品共获得高质量基因序列544 853条, 平均序列长度255 bp, 基于OTU划分, 除了聚球藻外, 共检出101种细菌。它们隶属于10个门, 全部为异养细菌, 分别为变形菌门、拟杆菌门(Bacteroidota)、浮霉菌门(Planctomycetota)、厚壁菌门、放线菌门(Actinobacteriota)、黏菌门(Myxococcota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、热脱硫杆菌门(Desulfobacterota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)和匿杆菌门(Latescibacterota) (图 5a), 其中变形菌门和拟杆菌门为优势菌门。在属水平上, 优势菌属为Marinobacter、Rhodobacteraceae和Thalassospira(图 5b)。实验中不同处理下聚球藻共栖细菌群落结构不同。变形菌门在不同处理组中均占绝对优势, 但从属水平上来看变形菌门中的不同类群的优势地位发生了变化。与实验初始时相比, 实验结束时空白组中α-变形菌纲中的Rhodobacteraceae和Thalassospira属相对丰度增大, 而γ-变形菌纲中的Marinobacter属的相对丰度减小。与空白组相比, 加入C6-HSL后浮霉菌门的相对丰度升高, 从属水平上看α-变形菌纲部分类群的比例升高。实验中加入的B01和B06菌株分别属于Enterobacteriaceae属和Escherichia属, 与仅加入菌株的处理组相比, 加入C6-HSL显著提高了两个属的相对丰度, 并改变了γ-变形菌中Marinobacter属的优势地位。
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| 图 5 聚球藻培养体系中共栖细菌的群落组成 Fig. 5 Commensal bacterial community composition in the culture sample of Synechococcus |
添加C6-HSL前后培养体系中的微生物共现性网络如图 6所示, 按门水平划分, 细菌网络中的节点占比最高的归属于变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门, 占所有节点的70%以上。网络节点平均度体现了细菌网络中各组分的连接度, 平均度越高, 网络互作程度越高; 网络平均路径长度表示网络各组分紧密度, 平均路径长度越小则网络紧密度越高。在两组样品中, 添加C6-HSL降低了微生物网络的互作程度和网络的紧密度。2个处理组中细菌网络中正相关边数菌大于负相关边数, 表明主要细菌群落之间的协同作用较大, 拮抗作用较少, 添加C6-HSL减弱了细菌的协同作用, 正相关边数占比超过78.98%, 而未添加C6-HSL的组中正相关边数占比则为81.89%。网络模块化系数反映了微生物共现性网络结构的模块化程度, 添加C6-HSL增强了网络的模块化。
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| 图 6 聚球藻培养体系中的微生物共现性网络 Fig. 6 Microbial co-occurrence networks in the culture sample of Synechococcus |
聚球藻是南黄海中主要的蓝细菌类群, 在海域初级生产中发挥重要作用。本研究中, 向富集培养的海洋聚球藻藻液中添加终浓度为25 nmol/mL的C6-HSL信号分子, 促进了聚球藻的生长, 对培养体系中异养细菌的生长无明显促进作用。在培养过程中, 聚球藻的细胞丰度较异养细菌丰度始终低1~2个数量级, 与研究组先前进行的研究结果一致。AHLs信号对藻类的促生作用已有相关报道, 小球藻共栖细菌农杆菌(Agrobacterium sp.)分泌的AHLs对小球藻生长有促进作用, 在毕相东[10]等的研究中, 外源添加50、100及200 nmol/mL的C6-HSL同样显著促进了小球藻的生长。然而在富集培养条件下, 聚球藻表面吸附有难以去除的细菌, 很难分离藻株实现无菌培养[29], 而且聚球藻和共栖异养细菌同属于原核生物, 聚球藻自身可能也具有识别C6-HSL的信号受体, 能够对C6-HSL识别并做出应答, 因此需要进一步探索C6-HSL对聚球藻的促生作用机制。
利用生物检测菌株检测细菌群体感应或群体淬灭活性是目前常用的手段, 本研究利用紫色杆菌CV026作为检测菌株, 采用平板扩散法筛选得到6株具有C6-HSL淬灭活性的聚球藻共栖异养细菌, 6株菌均通过胞内途径实现C6-HSL信号群体淬灭。6株菌分布在两个门: 变形菌门(5株)和厚壁菌门(1株), 其中5株变形菌均属于γ变形菌纲。近年来有多项研究从海洋不同生物和非生物来源中分离具有群体淬灭活性的细菌, Romero等[30]从166株海洋微生物中检测得到了24株具有短链AHLs群体淬灭能力的细菌; Chen等[31]通过高通量方法筛选海洋中具有短链AHLs降解能力的菌株, 结果显示群体淬灭活性菌株在海洋中十分普遍, 在所有研究中, 变形菌门细菌是报道最多的类群[32]。但目前取得的研究结果大多为细菌的代谢产物具有群体淬灭功能, 对细菌胞内酶途径降解AHLs的机制还需进一步探索。对于藻际环境中的群体淬灭现象, 藻类对细菌群体感应系统的抑制作用已得到初步探索, 发现莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)能够分泌AHLs结构类似物[33]、鱼腥藻(Anabaena sp. PCC7120)能够通过酰化酶作用降解AHLs[34], 藻类能够通过干扰细菌的群体感应通路抑制有害菌的定殖, 促进自身生长[4]。但对于藻际环境中细菌的淬灭机制, 以及机制造成的生态效应还没有相应研究进行解释。本研究中分别选择群体淬灭活性最强的B01菌株和最弱的B06菌株为对象, 发现2株群体淬灭菌均能够促进聚球藻的生长, 群体淬灭活性更强的B01菌株对聚球藻的促生作用更强, 结果表明共栖菌对聚球藻的促生作用可能受到自身群体淬灭功能的调节, 细菌的群体淬灭活性可能通过促进聚球藻生长进而利于聚球藻的生态位竞争。但相比于细菌群体感应通路能够产生的明确的群体功能, 群体淬灭的实际作用机制和生态意义还有待探索。
分析聚球藻培养体系中的细菌群落组成, 培养体系内共有101种细菌, 属于10个门类, 体系中优势菌门为变形菌门和拟杆菌门, 与之前对海洋聚球藻共栖细菌群落结构特征的研究结果一致[18]。外源C6-HSL信号的添加影响了培养体系中细菌群落组成, 提高了培养体系中α-变形菌纲中Rhodobacteraceae的占比, 降低了γ-变形菌纲中Marinobacter的相对丰度。Rhodobacteraceae是海洋中典型的机会主义菌, 生长快速, 能够对环境变化做出快速响应[35]; Marinobacter是聚球藻生长过程中的稳定共栖细菌类群, 具有反硝化能力, 在聚球藻培养体系氮元素循环中起重要作用[36]。根据培养体系中的微生物共现网络, 添加C6-HSL降低了培养体系中微生物的相互作用程度和微生物共现性网络的紧密度, 降低了网络的稳定性。外源C6-HSL的添加打破了不同细菌类群在培养体系中的平衡机制, 部分类群可以识别信号分子做出行为调节来适应环境变化, 从而更有利地竞争生态位; 与此同时, 细菌类群间的竞争和拮抗作用导致了部分类群生态位的丧失。在聚球藻的长期培养过程中, 体系中的共栖菌群能够在环境条件变化后经历一段适应期, 最终建立稳定的共栖群落[37]。因此C6-HSL信号对共栖菌群中稳定和非稳定细菌群落的影响还需进行长期培养实验验证。
研究中尝试对分离得到的聚球藻共栖菌株进行了群体感应活性筛选, 但未筛选得到具有短链AHLs合成能力的群体感应菌株。群体感应现象在藻际环境中十分普遍, 但在本研究中未筛选到群体感应活性菌株的原因可能有2个: 一方面根据Rolland等[20]的研究, 海洋藻际环境中多为长链AHLs分子(酰基侧链中超过8个碳), 短链AHLs分子极少, 而本研究中选用的生物检测菌株紫色杆菌CV026的检测范围是C4~C8的AHLs分子[38], 聚球藻共栖细菌分泌的AHLs信号类型可能不在检测范围内; 另一方面细菌分泌的AHLs分子浓度极低, 对菌株代谢物粗提物的提取纯度要求较高。未来可以在本研究的基础上, 选取更广范围的检测菌株, 利用色谱质谱联用技术, 结合多组学分析手段, 更加深入地探索海洋聚球藻藻际环境中细菌的群体感应和群体淬灭对藻菌互作关系的调控作用。
4 结论本研究通过向富集培养的聚球藻藻液中添加25 nmol/mL的C6-HSL信号分子, 发现C6-HSL信号分子能够促进聚球藻生长, 改变聚球藻共栖异养细菌的群落结构, 并降低微生物的互作程度和共现性网络的紧密度。利用生物检测菌株紫色杆菌CV026鉴定分离自聚球藻培养体系的细菌中共有6株具有C6-HSL信号群体淬灭能力, 6株菌均通过胞内途径降解C6-HSL分子。此外, 发现共栖菌对聚球藻的促生作用受到群体淬灭功能的调节。从藻际细菌的群体感应和群体淬灭现象入手, 是进一步理解细菌通讯机制调控海洋藻菌互作关系的新思路。未来的研究可以在本研究的基础上, 采用更广范围的检测菌株和更深入的化学检测手段, 联合多组学分析进一步探索海洋聚球藻藻菌环境中异养细菌的群体感应和群体淬灭对藻菌互作关系的影响作用。
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