2024, Vol. 48
文章信息
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- QIN Sishi, HE Qiuxia, LIU Yansong, JIN Yaobo, WANG Lijuan, YOU Feng, TAN Xungang. 2024.
- 斑马鱼早期胚胎血细胞分布特征
- Distribution characteristics of blood cells in early zebrafish embryos
- 海洋科学, 48(9): 85-93
- Marine Sciences, 48(9): 85-93.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240408001
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文章历史
- 收稿日期：2024-04-08
- 修回日期：2024-05-06
2. 青岛海洋科技中心海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266273;
3. 中国科学院大学, 北京 100049;
4. 齐鲁工业大学(山东省科学院)高新技术产业(中试)基地(山东省科学院留学人员创业园), 山东 济南 250353
2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266273, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 10049, China;
4. Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences) High-tech Industry (Pilot) Base (Shandong Academy of Sciences Overseas Students Pioneer Park), Jinan 250353, China
斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio)因其体外受精过程和早期胚胎的透明性, 生长周期短, 产卵量高, 而被广泛视为研究发育生物学的重要模式生物, 同时也是探索血液系统和心血管疾病机制的理想脊椎动物模型[1-4], 在斑马鱼的早期发育阶段, 造血活动首先在卵黄囊中的血岛发生。
很多学者已经利用斑马鱼模型开展了一系列对于血液系统的研究[5]。例如, 通过添加蛋黄和花生四烯酸, 成功构建了斑马鱼高脂血症和血栓模型, 用于探究6′-O-咖啡酰基熊果苷降低血脂和抗血栓形成的机制[6]。通过转基因技术, 构建了hE2A-PBX1转基因斑马鱼, 用以模拟人类白血病, 并在此基础上鉴定了潜在的靶向治疗药物[7]。还有研究利用斑马鱼模型来探讨Apela因子对血管新生和重塑的作用[8]。
为了深入研究斑马鱼胚胎的血液系统, 多种技术手段已被开发并应用于血流动力学分析。例如, 数字粒子图像测速法(DPIV)和计算流体动力学(CFD)被用于分析斑马鱼胚胎的血流动力学特性[1]。通过使用GFP标记的内皮/心内膜细胞和GATA1标记的红细胞的转基因斑马鱼胚胎, 研究者能够追踪管腔和血液流动, 从而精确测量血液流速, 这些技术在心血管研究领域显示出巨大的应用潜力[9]。但这些研究往往依赖于复杂的技术和设备进行分析, 而缺乏利用简单方法、系统地分析早期胚胎血液分布情况。
斑马鱼心脏在很多方面与人类心脏高度相似, 但是斑马鱼心脏仅由一心房和一心室组成, 早期的胚胎通过被动扩散的方式进行气体和营养物质的交换, 而不依赖于成熟心血管系统的功能维持生命, 这使其成为研究心血管疾病缺陷的理想模型[10]。在斑马鱼胚胎发育到3个体节时, 成血管细胞开始出现; 在10至15个体节期间, 原始的体轴血管形成, 随着胚胎发育, 新的血管逐渐形成并相互连接, 进而构建起一个复杂的血管网络[11-12]。在受精后24 h, 线性心管开始有节奏地跳动, 此时红细胞开始缓慢流动, 从心脏流出经主动脉到达静脉, 然后进入心房, 并最终回到心室, 完成血液循环的初步循环[1, 13]。
目前, 血红蛋白染色法常被用来分析胚胎血液循环情况及心血管发育情况。例如, 通过血红蛋白染色观察血红蛋白基因敲除对斑马鱼胚胎心血管发育的影响[4]; 在金鱼中, 通过血红蛋白染色检测到雌核发育单倍体胚胎血液循环障碍[14]; 在敲除斑马鱼心脏再生相关基因 klf1 后, 通过血红蛋白染色检测心脏血液分布情况[15]。尚未见到系统地将血液发育相关基因的表达与血红蛋白染色相结合分析斑马鱼胚胎早期的血液分布情况。
本研究中, 采用了一种简单的血红蛋白染色法, 并结合血红蛋白标志基因hbbe3[16], 造血祖细胞标志基因etsrp(etv2)[17], 红细胞标志基因gata2a[18], 造血干细胞标志基因cd34[19], 血管祖细胞标志基因kdrl和血管标志基因tek(tie2)[20]的表达分析, 来探究斑马早期胚胎中血细胞的形成和分布。这种方法不仅为理解斑马鱼心血管系统发育提供了重要的参考信息, 而且为初步分析和评估相关疾病及病理状况提供了便捷的手段。
1 材料与方法 1.1 实验鱼与样品获取斑马鱼TU品系, 饲养于中国科学院海洋研究所的淡水循环养殖系统, 养殖温度为(28±1) ℃, 每天14 h光照10 h黑暗。斑马鱼交配前夜, 将雌鱼和雄鱼分别放在产卵盒的两侧, 雌雄比例为1︰1或2︰1, 次日开灯后移开挡板, 雄鱼追逐雌鱼刺激后产卵, 收集胚胎。胚胎置于(28.5±0.5) ℃培养箱中培养。
1.2 邻联茴香胺染色邻联茴香胺染色原理: 邻联茴香胺是过氧化物底物, 血红蛋白具有过氧化物酶类似的活性, 可以催化过氧化氢释放氧, 使邻联茴香胺发生颜色变化, 从而观察胚胎血红蛋白存在的位置, 指示胚胎红细胞分布情况。
斑马鱼胚胎用含有0.003%的1-苯基-2-硫脲(PTU)水培养去除黑色素, 用镊子在解剖镜下剥除卵膜, 然后使用斑马鱼血红蛋白邻联茴香胺染色试剂盒染色, 按照说明书步骤操作。然后用显微镜观察、拍照。
1.3 冷冻切片、HE染色将血红蛋白染色样品利用冷冻切片以便深入分析斑马鱼早期胚胎血液循环情况。将血红蛋白染色的胚胎用磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.2)清洗, 随后包埋于1.2% 琼脂糖(用含5% 蔗糖的 PBS 配置)中, 然后将琼脂块放入30% 蔗糖溶液(PBS 配置)中(4 ℃), 待琼脂块沉入底部后, 将其浸入OCT中冷冻(‒20 ℃ 以下)30 min以上, 待修块后进行冷冻切片, 切片厚度为10 μm。将切片进行HE染色, 具体步骤如下: 将切片在纯水中复水2 min, 随后苏木精染色40 s, 再流水冲洗7 min, 然后伊红染色40 s, 流水再冲洗7 min, 接着进行乙醇梯度脱水, 二甲苯透明, 最后使用中性树胶封片, 在显微镜观察拍照。
1.4 RNA提取、cDNA获得与荧光定量PCR (qPCR)收集3组来自不同亲本的胚胎, 采用Trizol法提取各个时期总 RNA。使用一步法cDNA合成试剂盒(全式金, 中国)将提取的RNA反转录成cDNA。以反转录获得的cDNA为模板, 进行qPCR, 按照PerfectStart® Fast Green qPCR SuperMix(全式金, 中国)说明书步骤进行反应, 配置20 μL 的体系, 使用3步法反应程序, 设置40个循环。选择 ef-1α 作为内参基因, 每个样品3个技术重复, 基因的相对表达量通过2‒∆∆Ct方法计算。所用引物如表1所示。
| 基因 | 引物 | 引物序列 (5′ → 3′) |
| gata2a | gata2a-F | TACGACATACAAGCAGAGAA |
| gata2a-R | GAGGGAAAGCCAAATAGGA | |
| etsrp | etsrp-F | AAGCTAGGTGCCTTTAGAAA |
| etsrp-R | CAAGAGTTCACTATCTGATGTC | |
| cd34 | cd34-F | GAGTGATTGCTTCTCTTGAA |
| cd34-R | TGACAGAACACCGGAATG | |
| hbbe3 | hbbe3-F | GCTTCACTCAGAGAAACTAC |
| hbbe3-R | ACAACAACAGACAGGAACT | |
| kdrl | kdrl-F | GTAAGGGAAAGGTTGAGAGA |
| kdrl-R | TTGGAAGACATCATCAGCTA | |
| tek | tek-F | TACGAGAAGTTCACCTACG |
| tek-R | CCTCACTAATCAACACTGTG | |
| ef-1α | ef-1α-F | CTGCCAAGACCAAGTGAA |
| ef-1α-R | ATCAGCATTATCCAGTCCTT |
结果以mean±SEM(平均标准误差)表示。用Excel统计和分析数据, GraphPad Prism 9.5.1作图。
2 实验结果 2.1 斑马鱼早期胚胎血细胞分布在斑马鱼胚胎发育的过程中, 血液的出现和分布是一个动态的过程(图1)。斑马鱼胚胎在受精后24 h时(24 hpf)使用邻联茴香胺染色法无法检测到明显的红细胞存在(图1-1); 到了30 hpf时, 卵黄囊区域开始出现少量的红细胞聚集(图1-2)。在30~38 hpf之间, 红细胞数量逐渐增多, 到了38 hpf时, 已经广泛分布于卵黄囊(图1-3, 图1-4)。48 hpf时, 卵黄囊中的红细胞数量显著增加, 心脏区域首次出现红细胞, 眼眶也有少量红细胞出现(图1-5)。54 hpf时, 眼眶内的红细胞数量有所增加(图1-6), 体节和尾部也开始出现红细胞(图1-7)。到了66 hpf, 卵黄囊内的红细胞数量继续增多, 在腹侧心房和心室结构变得清晰可见(图1-9), 同时脑部也出现了红细胞(图1-8)。72 hpf时, 心房和心室的血液面积扩大, 心脏内血液充盈, 心房和心室的结构更为明显(图1-11)。到了96 hpf, 鳃和胸鳍区域出现红细胞(图1-12), 120 hpf时, 斑马鱼胚胎全身的红细胞数量进一步增加(图1-14), 此时血液循环系统已基本发育成熟(表2)。
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| 图 1 斑马鱼早期胚胎血红蛋白染色 Fig. 1 Hemoglobin staining of zebrafish early embryos 注: 1-1: 24 hpf; 1-2: 30 hpf; 1-3: 38 hpf; 1-4: 38 hpf; 1-5: 48 hpf; 1-6: 54 hpf, 头部; 1-7: 54 hpf, 尾部; 1-8: 66 hpf; 1-9: 66 hpf; 1-10: 72 hpf; 1-11: 72 hpf; 1-12: 96 hpf, 头部; 1-13: 96 hpf, 尾部; 1-14: 120 hpf, 头部; 1-15: 120 hpf, 尾部; hpf为受精后小时; 1-1, 1-2, 1-3, 1-9, 1-11为腹侧观, 其他为侧面观, 放大倍数是50倍 |
为了分析体内是否出现染色阳性的红细胞, 我们对38 hpf, 48 hpf, 54 hpf, 72 hpf, 96 hpf的血红蛋白染色的胚胎进行了冷冻切片, 随后叠加HE染色进行观察(图2)。结果显示, 38 hpf的胚胎在卵黄囊处有少量红细胞(图2-1); 48 hpf的胚胎在躯干和体节出现红细胞(图2-3), 此时卵黄囊红细胞数量已明显增多(图2-2); 54 hpf时卵黄囊红细胞分布延长(图2-4); 72 hpf时可以在脑部、躯干、心脏和卵黄囊明显观察到大量红细胞, 卵黄囊红细胞分布开始缩短(图2-5); 96 hpf可以在鳃处观察到红细胞, 并且卵黄囊红细胞分布更加集中(图2-6)(表2)。
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| 图 2 血红蛋白染色胚胎组织切片 Fig. 2 Sections of hemoglobin staining of embryos 注: 2-1: 38 hpf; 2-2: 48 hpf, 头部; 2-3: 48 hpf, 尾部; 2-4: 54 hpf; 2-5: 72 hpf; 1-6: 96 hpf。 |
| 发育时期 | 胚胎发育特征[21] | 染色结果 |
| 24 hpf | 心脏开始跳动, 血液循环开始 | 无法观察到红细胞 |
| 30 hpf | 血液通过咽部和尾部之间单一的主动脉弓和完整的动脉系统缓慢循环 | 首次观察到红细胞, 位于卵黄囊处 |
| 38 hpf | 血液循环畅通, 通过躯干和卵黄回流 | 红细胞广泛分布于卵黄囊 |
| 48 hpf | 尾部前端开始携带循环血液 | 卵黄囊红细胞数量明显增加, 心脏、眼眶和躯干观察到红细胞; 切片可以观察到躯干和体节中的红细胞 |
| 54 hpf | 胸鳍开始有血液循环 | 体节红细胞明显, 卵黄囊红细胞分布延长 |
| 66 hpf | 心脏充满循环血液, 血液流经所有主动脉弓 | 脑部出现红细胞 |
| 72 hpf | 心脏血液充盈, 明显观察到心房和心室 | |
| 96 hpf | 鳃和胸鳍出现红细胞, 血液循环基本成熟 |
通过定量PCR分析了血红蛋白标志基因hbbe3[21], 血祖细胞标志基因etsrp[22], 红细胞标志基因gata2a[18], 造血干细胞标志基因cd34[23]在斑马鱼胚胎发育过程中的表达。结果显示红细胞标志基因gata2a在4 hpf高表达, 4~24 hpf表达量明显下降, 24 hpf时表达量处于最低值, 24~48 hpf表达量上升, 48 hpf之后表达量再次下降。造血干细胞标志基因cd34在12 hpf开始表达, 12~ 24 hpf表达量下降, 24~72 hpf表达量持续上升, 72 hpf之后表达量下降。血祖细胞标记基因etsrp在12 hpf才开始表达, 12~24 hpf略微上升, 24 hpf时达到最大值, 此后其表达量持续下降。血红蛋白标记基因hbbe3在24 hpf开始表达, 24~36 hpf表达量迅速上升, 36~48 hpf表达下降, 48 hpf之后无法检测到。
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| 图 3 斑马鱼早期胚胎血细胞相关基因表达变化趋势 Fig. 3 Expression trend of blood cell-related genes in early zebrafish embryos |
利用定量PCR对斑马鱼胚胎发育过程中血管祖细胞标志基因kdrl[24]和血管标志基因tek(tie2)[11]的表达进行分析。结果显示, 血管祖细胞标志基因kdrl在24 hpf开始表达, 在24~72 hpf之间持续上升, 72~ 96 hpf下降。血管标志基因tek(tie2)同样在24 hpf开始表达, 24~48 hpf之间表达量变化不大, 稍微下降, 48~72 hpf表达量迅速上升, 随后又在72~96 hpf迅速下降。血管祖细胞标志基因kdrl和血管标志基因tek均从24 hpf开始检测到, 且在72 hpf的表达量最高。
3 讨论本研究利用定量PCR及血红蛋白染色法等系统地分析了斑马鱼胚胎发育过程中血液循环系统中的血细胞(红细胞为主)及血管发育相关基因的表达、血红蛋白表达的时序及分布特征, 明确了斑马鱼血液循环系统中血细胞(红细胞为主)的发育及分布规律; 结合斑马鱼胚胎血液循环系统的发生过程, 我们明确了利用血红蛋白染色可以观察到血液循环系统发育的时期及其表达特征(表2)。
我们发现gata2a在4 hpf就表达, 比血祖细胞标志基因etsrp和造血干细胞标志基因cd34表达更早, 有研究发现斑马鱼gata2a最早表达于2 hpf, 并没有在0 hpf表达, 因此该基因属于非母源性表达的基因[25-26]。Gata2主要表达于造血干细胞、多功能造血祖细胞、红系幼稚细胞等[27], 斑马鱼中其最早表达于未来发育成造血干细胞等的成血-血管干细胞(hemangioblasts)[28], 因此在12 hpf之前, gata2a的表达可能代表着成血-血管干细胞的发生, 12 hpf时与cd34和etsrp分别代表了造血干细胞和造血祖细胞发生。在12~24 hpf时, cd34的表达处于下降趋势, 而etsrp的表达处于上升阶段, 因此此阶段造血祖细胞处于增殖过程中, 即数量在增加, 而造血干细胞的数量却在下降。在24 hpf时, gata2a可以与hbbe3一样标志红细胞的发生及发育。同时24 hpf时, 血管祖细胞标志基因kdrl和血管标志基因tek开始表达, 这标志着血管开始生成, 这与此时心脏开始跳动、血液循环开始启动相吻合[21]。由于24 hpf时, 大多数血细胞聚集在卵黄囊的血岛中[29-30], 且RNA水平上的血红蛋白标志基因此时才开始低表达, 表达血红蛋白的红细胞数量更是极少, 以至于使用血红蛋白染色法无法有效检测到它们, 这也是该方法的局限性, 即无法检测到低密度的红细胞。
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| 图 4 斑马鱼早期胚胎血管相关基因表达变化趋势 Fig. 4 Expression trend of vascular-related genes in early zebrafish embryos |
在24~36 hpf时, 血红蛋白标志基因hbbe3的表达快速上升表明血红蛋白生成加速, 在36 hpf时, 表达量达到最高; 在此阶段, gata2a和cd34的表达趋势与hbbe3一样是逐渐增加; 而etsrp的表达却逐渐减少, 这表明在此阶段造血祖细胞因逐渐分化成血细胞并表达标志蛋白而减少, 如分化成红细胞并表达血红蛋白。由于gata2a和cd34还表达在其他类型的细胞或干细胞中[15, 17], 因而它们在24~36 hpf的表达不仅仅代表造血干细胞和造血祖细胞。尽管在30 hpf时, 斑马鱼胚胎的咽部和尾部之间就形成了一个单一的主动脉弓和完整的动脉系统, 血液通过这些动脉缓慢循环[21], 但在血液系统中仍无法检测到染色信号, 而在卵黄囊中首次可以观察到少量的血红蛋白染色的红细胞, 这与大多数血细胞早期聚集在卵黄囊的血岛中[29-30]相符合, 这表明卵黄囊是血细胞发生、发育的地方[29-30]。
在36~48 hpf期间, etsrp和hbbe3的表达量处于下降趋势, 且两者相互吻合, 这表明由于分化的红细胞数量在减少, 其生成的血红蛋白也进而减少; 而gata2a和cd34的表达量仍然处于上升趋势, 这表明这个阶段是除了造血干细胞和造血祖细胞以外的其他类型细胞在快速发生和发育。尽管36 hpf时血液循环已经通畅, 血液通过躯干和卵黄回流[20], 但在38 hpf, 血红蛋白阳性的红细胞仍然存在于卵黄囊中, 血液循环系统中仍然没有, 这表明循环系统中含有血红蛋白的红细胞来源于卵黄囊[29-30]。血红蛋白的标志基因hbbe3的表达在36 hpf之后开始下降, 48 hpf之后没有表达, 这表明此时红细胞基本成熟, 不再生成新的血红蛋白。
在48~72 hpf时, 我们发现血管祖细胞标志基因kdrl和血管标志基因tek的表达处于增加阶段, 表明此阶段大量血管生成, 这与42 hpf时, 血管开始深入肌节[31], 血液循环系统在尾部前端形成有一定的关联。在72 hpf时, 染色结果显示斑马鱼心脏充满血液, 心房和心室的位置清晰可见。红细胞标志基因gata2a的表达量在48 hpf开始下降并在72 hpf之后维持, 造血干细胞标志基因cd34, 血管祖细胞标志基因kdrl和血管标志基因tek(tie2)同样在72 hpf之后表达量开始下降, 这表明斑马鱼胚胎在72 hpf之前血液循环系统和血管发育已经成熟。
斑马鱼血细胞先在卵黄囊形成。卵黄囊是血细胞产生的第一个部位, 原始红细胞起源于卵黄囊并在血液中成熟[32], 的确我们的染色结果也是首先出现在卵黄囊上。本研究也通过血红蛋白染色和冷冻切片观察到了斑马鱼胚胎卵黄囊血岛的位置。且斑马鱼血液在卵黄囊处呈弥散性分布, 斑马鱼的卵属于沉性卵, 产卵后直接沉于水底, 血细胞弥散分布就可以在大面积的情况得到足够的氧气。目前已知, 金鱼胚胎血液在卵黄囊处分布与斑马鱼相似[14], 均弥散性分布在卵黄囊腹侧靠上的部位; 鸡胚胎卵黄囊血液位于胚胎外周环状分布[33-34]。
我们发现该方法对红细胞的识别有一个数量上的限制。红细胞数量太低下的情况下, 对红细胞的识别效果较差, 因而在斑马鱼胚胎中通过染色识别的时间晚于实际红细胞出现的时间, 但是这并不影响通过该方法简单明了地识别红细胞在一些组织如心脏、血管中的分布, 进而可以快速、简单地初步分析疾病造成血细胞分布发生变化的病理特征; 在利用斑马鱼构建相关疾病模型及机制研究的工作中, 该方法可以快速判断疾病模型是否构建成功, 并为机制分析提供了一定的线索。
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