甲壳素是一种由β-(1-4)-糖苷键连接而成的天然大分子聚合物, 是自然界中除纤维素外最多的有机化合物, 广泛来源于甲壳类生物, 其中虾壳是目前研究最多的甲壳素提取来源。甲壳素及其衍生物, 尤其是壳聚糖及壳寡糖, 已被报道具备良好的抗菌、抗炎、生物相容性和生物降解性, 在医药^[1-2]、食品^[3-4]、水处理^[5-6]、生物防治^[7]等领域均具有重要的应用价值, 因此作为源头的甲壳素的获取研究具有重要的意义和价值。

从虾壳中提取甲壳素的过程主要包括脱钙(主要为碳酸钙)、脱蛋白及脱色。目前最常使用的化学法因酸和碱的大量使用及废水排放对环境具有严重的危害。为寻求更加绿色环保的技术, 微生物法、酶法、离子液体法等绿色提取技术目前已经受到广泛关注, 其中微生物法提取甲壳素是一种有效环保的方法, 主要通过利用微生物代谢过程中产生的有机酸及蛋白酶除去虾壳中的钙和蛋白质。目前报道的常用产酸菌包括植物乳杆菌^[8]、瑞士乳杆菌^[9]等乳杆菌, 产蛋白酶菌株主要来自于芽孢杆菌, 如枯草芽孢杆菌^[10]、凝结芽孢杆菌^[11]、地衣芽孢杆菌^[12]等, 少部分研究采用铜绿假单胞菌^[13]及黏质沙雷氏菌^[14]。单菌株发酵普遍无法兼顾去除虾壳中的碳酸钙和蛋白质, 因此通常需要结合2种及以上菌株共同作用。目前报道的相关研究多是采用芽孢杆菌与乳杆菌联合使用的效果, 还未有关于铜绿假单胞菌与产酸菌联用脱除虾壳中杂质的报道。

为了提高虾壳中蛋白质和矿物质的去除效率进而获得纯度较高的甲壳素, 本研究从不同来源筛选出具有高产酸及产蛋白酶活性的菌株, 对单菌发酵条件进行优化, 同时在两步发酵过程中研究不同接种顺序对脱钙和脱蛋白的影响, 对获得的纯度较高的产物进行结构分析, 以期对微生物法从虾壳中提取甲壳素的绿色制备工艺提供参考借鉴。

1 实验材料 1.1 材料与试剂

虾壳(shrimp shell, SS)为南美白对虾(Litopenaeus vannamei), 由浙江金壳药业股份有限公司提供, 粉碎后过不同目数筛网, 置于密封袋中保存备用。

MRS肉汤培养基与LB肉汤培养基购自青岛海博生物技术有限公司, 葡萄糖(D(±)－葡萄糖, 一水)购自国药集团化学试剂有限公司, 商用甲壳素(commercial chitin, CC)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 福林酚购自上海麦克林生化科技股份有限公司。益生菌粉购自镇江市天益生物科技有限公司。

1.2 培养基

MRS液体培养基: MRS肉汤55.2 g, 去离子水1 L, pH自然。

MRS固体培养基: MRS肉汤55.2 g, 琼脂20 g, 去离子水1 L, pH自然。

LB液体培养基: LB肉汤25 g, 去离子水1 L, pH自然。

LB固体培养基: LB肉汤25 g, 琼脂20 g, 去离子水1 L, pH自然。

上述培养基115 ℃灭菌30 min后备用。

脱脂奶粉筛选培养基:

成分1: 脱脂奶粉10 g, 去离子水500 mL, pH自然, 105 ℃灭菌10 min备用。

成分2: 琼脂20 g, 去离子水500 mL, pH自然, 121 ℃灭菌15 min备用。

将成分1与成分2充分混合后得到脱脂奶粉筛选培养基。

2 实验方法 2.1 菌株筛选

为了获得产酸能力强的菌株, 以上清液的pH值作为标准, 对实验室已有益生菌粉进行筛选, 主要包括鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌等。称取0.1 g不同的菌粉, 溶解分散于100 mL灭菌MRS液体培养基中, 37 ℃静置培养, 通过测量上清液的pH值确定最佳产酸菌株。

为了获得产蛋白酶能力强的菌株, 采用透明圈法初筛及福林酚法复筛结合, 筛选包括发酵乳制品、海水、养殖场底泥、海山及冷泉土等多种来源中的产蛋白酶菌株。

将所得活性最高的菌株多次纯化后测序, 确定其为纯种菌株后保存于20%甘油冻存液中, 置于−80 ℃保存。

2.2 菌株活化及培养

将保存于−80 ℃的菌株分别活化至MRS固体培养基及LB固体培养基上, 37 ℃倒置培养2 d。待菌落长出后一次划线纯化培养。挑取纯化培养基上的单菌落接种至100 mL相应液体培养基中, 于37 ℃条件下培养约12 h, 将所得菌液作为后续发酵实验中的种子液。

2.3 发酵条件优化

将上述种子液混匀后取5%分别接种至发酵培养基(100 mL去离子水于250 mL锥形瓶), 37 ℃培养。以脱钙率及脱蛋白率为指标, 选择发酵时间、碳源种类、碳源浓度、固液比作为优化因素, 对两株菌的发酵条件进行优化。

2.4 脱钙率及脱蛋白率计算

灰分含量测定采用马弗炉灼烧法。先将坩埚置于马弗炉中550 ℃灼烧至恒重(前后质量差值≤0.5 mg)。称取一定质量烘干后的3种粉末于恒重坩埚中, 550 ℃灼烧多次直至恒重。剩余质量占原始质量的比例即为灰分含量。脱钙率(demineralization, D_m)计算公式如下:

$D_{\mathrm{m}}(\%)=\frac{\left(M_0 \times A_0\right)-\left(M_{\mathrm{F}} \times A_{\mathrm{F}}\right)}{M_0 \times A_0} \times 100,$

(1)

其中, M₀、M_F分别为反应前后的样品质量, g; A₀、A_F分别为反应前后的样品中的灰分含量。

蛋白含量测定采用凯氏定氮法。按照说明书进行操作, 所得含氮量乘以系数6.25得到蛋白质含量。脱蛋白率(deproteinization, D_p)计算公式如下:

$D_{\mathrm{p}}(\%)=\frac{\left(M_0 \times P_0\right)-\left(M_{\mathrm{F}} \times P_{\mathrm{F}}\right)}{M_0 \times P_0} \times 100,$

(2)

其中: M₀、M_F分别为反应前后的样品质量, g; P₀、P_F分别为反应前后的样品中的蛋白质含量。

2.5 发酵中有机酸成分的测定

采用高效液相色谱(HPLC)测定产酸菌株发酵所得上清液中所含的有机酸成分, 以草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸等作为标准品, 检测条件如下:

(1) 色谱柱: Agilent C18 AQ(4.6 mm×250 mm, 5 μm);

(2) 检测器: 紫外检测器;

(3) 柱温: 35 ℃; 进样量: 10 μL;

(4) 流速: 0.5 mL/min;

(5) 波长: 210 nm;

(6) 流动相: A: 0.1% 磷酸水; B: 甲醇。

2.6 发酵方法

采用两步发酵法从虾壳中提取甲壳素, 采用先脱钙后脱蛋白以及先脱蛋白后脱钙2种接种顺序, 在最佳优化条件下对虾壳进行发酵处理。发酵结束后将发酵体系离心并用去离子水清洗至中性, 添加至10% H₂O₂溶液中, 于80 ℃脱色, 完成后收集沉淀, 于70 ℃烘箱干燥。

2.7 结构分析

发酵后得到的产物及商用甲壳素采用傅里叶红外光谱(FTIR)及X-射线衍射(XRD)方法获取分子内结构信息, 其中红外光谱扫描波长范围为4 000~400 cm^–1, X-射线衍射扫描速率为2°/min, 扫描范围为5°~60°。采用扫描电子显微镜(SEM)观察分析发酵前后所得固体的微观形貌。

2.8 数据分析

采用GraphPad Prism 8对所得数据进行分析。数据平均值±标准差表示, 方差分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA), P < 0.05视为数据之间具有统计学显著性差异。

3 结果与讨论 3.1 菌株筛选结果

产酸菌株液体培养基的上清pH见图 1, 由图可知植物乳杆菌在相同培养条件下可以营造最低的pH环境(3.79±0.02), 有机酸测定结果显示, 发酵液中所含有机酸主要为乳酸(7 182.10 mg/L)和乙酸(67.83 mg/L), 并含有少量丙酸、异戊酸、正丁酸、异丁酸等短链脂肪酸(数据未显示)。乳酸是使用有机酸代替盐酸去除矿物质时的常用有机酸^{[13, 15-16]}。16S rRNA鉴定结果显示其为纯种菌株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum), 确定其为目标产酸菌株, 记作LA01。

通过透明圈法初筛从不同来源中筛选得到活性较高的菌株, 进一步采用福林酚法测定其上清蛋白酶活性, 结果见图 2。结果显示菌株T-7具备最高的蛋白酶活性, 16S rRNA鉴定结果显示其为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 确定其为目标产蛋白酶菌株, 记作PS01。

3.2 发酵条件优化 3.2.1 LA01脱钙条件优化

LA01通过利用环境中的碳源代谢产生有机酸, 可将虾壳表面覆盖的碳酸钙溶解, 进一步通过洗涤去除, 进而达到脱钙的效果。首先探究了发酵时间对脱钙率的影响, 确定最佳发酵时间为3 d(图 3a)。进一步探究了不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖、半乳糖)对脱钙率的影响。由图 3b可知, 当碳源为葡萄糖时, 虾壳的脱钙率最高(76.57%±4.81%), 与果糖组和半乳糖组无显著性差异(P > 0.05), 说明LA01更易利用单糖类碳源。图 3c显示了葡萄糖质量分数对脱钙效果的影响, 可知最佳葡萄糖质量分数为4%(78.91%± 1.15%)。图 3d为固液比对脱钙效果的影响, 确定最佳固液比为1 g/100 mL, 所得脱钙率为79.79%±1.81%。

3.2.2 PS01脱蛋白条件优化

PS01通过代谢产生蛋白酶并释放到环境中, 可用于水解虾壳基质中的蛋白质。首先探究了发酵时间的影响, 结果见图 4a, 确定最佳发酵时间为2 d, 所得脱蛋白率54.89%±1.21%。进一步探究了不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖、半乳糖)对脱蛋白效果的影响。由图 4b可知, 碳源的添加并不能对脱蛋白效果起到促进作用, 说明碳源的添加对蛋白酶的产生及分泌具有抑制作用, 与前期报道结果相似^[17-19], 因此在PS01发酵培养基中不再添加碳源。图 4c显示了固液比对脱蛋白效果的影响, 可知最佳固液比为3%(63.59%±2.50%)。

3.3 两步发酵法提取甲壳素结果 3.3.1 虾壳灰分及蛋白质含量

海洋甲壳类动物的外壳通常含有20%~40%的蛋白质、20%~50%的矿物质及15%~40%的甲壳素^[20]。一般来说, 生物质所含杂质的多少与物种、雌雄、获取时间及状态等均有关系, 因此在开展实验时需要确定本实验所用材料的杂质成分。本研究所用生物质外壳均由浙江金壳药业股份有限公司提供, 确保了材料的一致性。实验结果显示, 本研究所用虾壳含有33.96%±0.90%灰分及38.65%±0.43%的蛋白质。

3.3.2 两步发酵结果

采用2种发酵顺序用于去除虾壳中的碳酸钙和蛋白质, 一种为先脱钙再脱蛋白, 即先接种LA01再接种PS01, 所得产物记作MSLP; 另一种为先脱蛋白再脱钙, 即先接种PS01再接种LA01, 所得产物记作MSPL。以MSPL发酵过程为例, 流程图见图 5。两种产物对应的脱钙率及脱蛋白率见表 1。由表可知先接种LA01具备更高的脱钙效果, 与先接种PS01所得结果相似, 而先接种PS01组脱蛋白效果更好, 脱蛋白率相比MSLP高出13%。相比于单菌发酵, 两步发酵后的脱钙率与脱蛋白率分别提高了24.10%与23.38%。综合考虑钙及蛋白质去除效果, 选择MSPL与商用甲壳素及原材料虾壳进一步进行结构分析。

前期研究中已经报道过采用两步发酵法提取甲壳素的相关研究, 绝大部分采用乳杆菌与芽孢杆菌共同作用。Liu等^[12]采用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter axydans)联合发酵虾头, 在先脱钙后脱蛋白的条件下发酵4 d, 所得脱钙率及脱蛋白率分别达到93.5%及87%。Xie等^[21]通过先接种附生嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)再接种深部外生杆菌(Exiguobacterium profundum)发酵虾壳, 所得脱钙率及脱蛋白率分别为95%及85.9%。本研究所采用的乳杆菌与铜绿假单胞菌组合未有过报道, 丰富了微生物法提取甲壳素的研究内容, 相对于目前的报道具有高水平的脱钙率。Sedaghat等^[22]同样采用P. aeruginosa去除虾壳中的蛋白质, 脱蛋白率为74.7%, 与本研究结果相似, 而脱钙率(76.46%)低于本研究所得。诱变处理是一种可对菌株性质进行改善的常用方法, 操作简便且效果较好, 其中紫外诱变、化学诱变及二者复合诱变已经广泛使用。朱明军等^[23]采用紫外诱变与化学诱变(硫酸二乙酯)复合处理, 最终得到菌株的酶活(7 307 U/mL)相比野生型菌株提高了59.68%。卢超等^[24]以紫外与亚硝酸钠作为诱变处理条件, 将枯草芽孢杆菌的酶活提高了2.61倍。结合上述研究结论, 后续研究中可对铜绿假单胞菌进行诱变处理, 以期提高菌株的产蛋白酶活性。

3.4 甲壳素结构分析 3.4.1 甲壳素样品的FTIR结果

由图 6可知, 微生物法所得虾壳甲壳素(MS)光谱模式与商用甲壳素(CC)相似, 在3 447 cm^–1与3 268 cm^–1波长处的峰值分别归因于NH₂和OH基团的对称伸缩振动^[25], 强度高于CC。酰胺Ⅱ带对应波长为1 558 cm^–1, 酰胺Ⅲ带对应波长为1 315 cm^–1。1 379 cm^–1处波段归属于乙酰胺基团, 1 158 cm^–1峰值则归因于C-O-C基团的对称拉伸^[22]。原材料(RS)在1 437 cm^–1附近存在CaCO₃吸收峰, 经过微生物法处理后该处吸收峰消失, 表明CaCO₃去除较为完全。对应于RS中2 929 cm^–1处的吸收峰消失, 说明蛋白质大部分被去除^[26]。MS与CC在酰胺Ⅰ带在1 660 cm⁻¹和1 626 cm⁻¹处断裂, 这是由于分子间(-CO··HN-)和分子内氢键(-CO··HOCH₂-)的存在, 是α-甲壳素的特征^{[25, 27]}。

3.4.2 甲壳素样品的XRD结果

RS、MS及CC的XRD衍射图谱见图 7。如图所示, MS的XRD谱图在9.3°和19.3°处有两个主衍射峰, 在12.8°、23.3°及26.6°处存在3个弱衍射峰, 其中12.8°处的峰值在CC的谱图中较明显, 整体表现为α-甲壳素的晶体结构, 与商用甲壳素具有较好的一致性。参照原材料RC的谱图, MS样品在2θ= 29.5°附近没有出现对应的碳酸钙衍射峰, 说明碳酸钙去除完全。所得谱图相对标准卡片略向右偏移, 可能是由于测试条件出现偏差, 如仪器未校准, 样品放置偏移等。

结晶指数(C_rl, %)是影响甲壳素物理和生物特性(包括可溶性和生物降解性)的一个重要特征, 结晶度越高, 可溶性及生物降解性越低。C_rl通过以下公式计算:

$C_{\mathrm{rl}}(\%)=\frac{I_{110}-I_{\mathrm{am}}}{I_{110}} \times 100,$

(3)

其中I₁₁₀为2θ= 20°处的最大强度, I_am为2θ = 16°处的最大强度。根据公式计算结晶指数, 结果显示微生物法处理虾壳所得结晶指数(78.70%)高于商用甲壳素(66.29%)。先前的研究表明, 甲壳素的C_rI值因物种和提取方法的不同而从47%到91%不等^[28]。Hajji等^[29]通过微生物法获得的虾壳来源(Penaeus kerathurus)的α-甲壳素结晶指数为64.1%。Zhang等^[30]利用菌株Serratia marcescens B742提取虾壳(Penaeus vannamei)中的甲壳素, 所得结晶指数为79.65%。Xin等^[31]利用菌株发酵所得虾壳甲壳素结晶指数为80.72%。此外, 微生物法所得产物C_rl与原材料虾壳的C_rl(79.27%)相似, 说明在本研究所获得的微生物发酵获取虾壳甲壳素过程中晶体结构未受到明显影响。

3.4.3 甲壳素样品的SEM结果

通过SEM进一步表征商用甲壳素及微生物法所得产物的微观结构, 结果见图 8。表面结构是甲壳素的重要特征之一, 其决定了所得产物的应用方向, 如孔隙较多的甲壳素可用于重金属吸附及组织工程, 而纳米纤维结构可用于纺织行业^[28]。如图所示, 虾壳原材料表面粗糙, 大量块状杂质覆盖于表面, 无法观察到内部甲壳素结构。通常来说, 未经处理的虾壳表层含有许多无机成分(主要为碳酸钙)及柔性蛋白大分子, 内部为蛋白质与甲壳素复合物^[31], 作为骨架主要组成部分的纤维状结构(甲壳素)不容易被检测到^[12]。经过微生物法处理后的虾壳表面光滑平整, 结构均匀且紧密, 呈现出纤维状结构, 同时观察到少量孔洞结构, 说明经过微生物发酵处理后, 大部分杂质被去除, 部分残留杂质分子不规则插入孔隙与纤维形成的复合结构之中。商用甲壳素表面光滑, 呈现紧密的片层状结构, 观察到少量孔洞结构。

甲壳素的表面形貌可能与甲壳素来源和制备方法的不同有关。目前报道了4种甲壳素结构: 片状多孔结构(lamella porous structure)、微纤维结构(microfibrillar structure)、多孔纤维结构(porous fibrous structure)及断裂海绵状结构(fractured spongy structure)^[26]。纤维结构是目前报道最多的结构, 也是虾蟹壳等海洋来源的甲壳素的主要结构, 少部分研究报道为其他结构, 如张巧等^[32]用微生物发酵法从虾壳(P. vannamei)中制备的甲壳素呈现断裂的海绵状结构。与商品甲壳素相比, 样品MS的表面形貌显示出更多的孔隙结构, 具有一定的应用潜力, 如用于金属离子吸附和组织工程等领域。

4 结论

从甲壳类生物外壳中获取甲壳素的常见加工流程包括脱钙、脱蛋白及脱色。目前获取甲壳素最广泛使用的方法仍然是化学法, 高浓度的酸碱试剂处理成本高, 若处理不当将对环境造成严重威胁, 且剧烈的化学反应条件会影响甲壳素的结构, 包括分子量、乙酰度等, 进而影响其应用。作为一种良好的绿色替代方法, 微生物法目前已受到广泛研究。本研究从不同来源筛选获得了产酸微生物植物乳杆菌(L. plantarum)和脱蛋白微生物铜绿假单胞菌(P. aeruginosa), 通过发酵条件优化后, 采用先脱蛋白再脱钙的两步发酵法从虾壳中提取甲壳素, 最终产物的脱钙率及脱蛋白率分别为96.92%±0.07%及78.46%±1.29%。经过FTIR、XRD及SEM结构分析后发现所得产物与商用甲壳素结构相似, 表现为纤维状结构且具有孔隙结构。该提取方法避免了酸碱试剂的使用, 采用全新的菌株组合, 为微生物法制备虾壳甲壳素提供了一种相对高效且环保的方法。