2025, Vol. 49
文章信息
- 胡路杰, 王林松, 范兆乾, 高堃, 周潞潇, 王中玮, 张琦璘, 宋亚东, 邢荣娥, 李鹏程, 秦玉坤. 2025.
- HU Lujie, WANG Linsong, FAN Zhaoqian, GAO Kun, ZHOU Luxiao, WANG Zhongwei, ZHANG Qilin, SONG Yadong, XING Ronge, LI Pengcheng, QIN Yukun. 2025.
- 氨基葡萄糖催化转化的5-羟甲基糠醛的稳定载药体的构建及对根结线虫的影响
- Construction of a stable drug carrier for 5-hydroxymethylfurfural catalytically transformed with glucosamine and its efficacy against root-knot nematodes
- 海洋科学, 49(1): 93-104
- Marine Sciences, 49(1): 93-104.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240426002
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文章历史
- 收稿日期：2024-04-26
- 修回日期：2024-05-17
2. 崂山实验室 海洋药物与生物制品功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 中国科学院海洋大科学研究中心, 山东 青岛 266071;
4. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Laoshan Laboratory, Qingdao 266237, China;
3. Marine Research Center, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China;
4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
植物寄生线虫在世界范围内对农业构成巨大的威胁, 全世界每年因植物寄生线虫所造成的损失高达1 570亿美元[1], 其中根结线虫是主要的植物寄生线虫, 寄生3 000多种农作物并造成1 000多亿美元的损失, 严重危害了农业生产和发展[2]。
目前根结线虫的防治主要有农业、物理、化学和生物防治手段[3]。其中化学防治主要是利用对线虫具有直接致死作用的化学药物防治根结线虫。化学杀线虫剂的效果通常比其他策略更有效, 但由于它们对环境和人类的毒性作用, 其使用受到限制[4]。在全球农业的快速发展过程中, 根结线虫对过度使用的传统杀线虫剂产生耐药性[5], 使目前的线虫防治已经成为一个严重的问题。因此, 具有新杀线机制的新一代绿色杀线虫剂近年来越来越受到重视。与化学合成的杀虫剂相比, 天然来源的杀线剂不仅高效而且相对安全。
以天然产物为来源的农药的研究和利用历史悠久。自20世纪80年代开始, 利用天然产物为活性物质防治植物根结线虫病害的研究引起广泛关注[6]。尽管如此, 迄今为止商品化的杀线虫剂很少, 因为这类产品的活性化合物的确定很难, 结构鉴定也充满挑战, 因而难以寻找可能的先导化合物来开发新化合物[7]。
2010年, Ntalli等[8]报道苦楝子具有一定的杀线虫活性。在此基础上, Ntalli等[9]又对苦楝子的甲醇提取物进行分离, 并对所有化合物分别测试了对线虫二龄幼虫的杀线活性, 首次报道了苦楝子的小分子天然产物HMF(5-hydroxymethylfurfural, 5-羟甲基糠醛)具有良好的杀线虫活性。而HMF作为一种多用途的平台化合物, 被美国能源部列为生物质中十大增值化学品之一[10]。目前用于制备5-羟甲基糠醛的原料主要为单糖(果糖[11-12]、葡萄糖[13]), 如果广泛使用这些可食用生物质来制备HMF等平台化合物将面临着与人争粮的问题[14], 解决这一问题的有效办法就是使用非食用性生物质作为生产平台化合物的原料。非食用性生物质如木质纤维素、甲壳素等, 含量丰富、可再生。如近年来以木质纤维素来制备HMF已成为研究热点, 并取得了系列突破性进展[15-16]。另一方面, 海洋来源的甲壳素类生物质及其衍生物的生物质转化生产HMF的研究也受到了广泛的关注。
甲壳素是一种通过N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和D-葡萄糖胺(GlcN)之间的β-1, 4键形成的天然聚合物[17], 为地球第二大生物质资源, 全球每年产生近8×106 t甲壳类废物[18], 这为甲壳素生物质的转化提供了丰富的来源, 由于甲壳素单体GlcNAc和GlcN的结构具有与葡萄糖相似的结构, 甲壳素生物质及其衍生产物可用于合成HMF, 如Wang等[19]报道使用氯化铝和磷酸, 由甲壳素转化为HMF产率为9.0%; Omari等[20]将壳聚糖转化为HMF, 在SnCl2存在下, 产率约12.2%。之后, 采用各种均相和非均相酸催化剂(硫酸、沸石等)将GlcNAc和GlcN以及壳聚糖和几丁质聚合物在175~240 ℃的水溶液或乙酸水溶液中转化为HMF, 但其收率均较低(12.2%~ 37.9%)[21]; Wang等[19]还报道了在没有催化剂的情况下, 利用氯化锌水溶液在120 ℃的较低温度下从甲壳素中生产HMF, 但从GlcN可以获得的最高产率仅为21.9%。作为甲壳素的单体, GlcNAc和GlcN通常比它们的聚合产物具有更好的水溶性和反应活性, 因而具有更高的转化产率, 目前, 使用GlcN为原料合成HMF的最高产率为49.6%[21]。因此, 我们接下来的研究中主要选择GlcN作为原料制备HMF, 以尽可能地提高转化HMF的效率。
尽管HMF拥有许多令人欣喜的优点, 但其相对不稳定的特性, 对酸、碱和氧的敏感性, 使其即使在温和的条件下也很难储存[22]。Galkin等[23]发现, 即使是97%~99%的纯HMF, 在油状储存时也容易迅速老化和分解, 2周内形成其二聚体和更大的低聚物。HMF的快速降解和老化给其在工业生产和实际应用带来了难以避免的障碍。因此, 减少合成和储存中HMF降解是目前重要的研究方向, Galkin等[23]报道HMF的不稳定性主要来源于液态下的氢键形成的紧密分子网络, 而在低温下固体结晶态形式下储存, 受限制的分子迁移率限制了HMF聚合反应的发生从而使其可以长期储存。因此, 在常温下限制HMF的流动性可能是提高其稳定性, 解决其应用缺陷的有效手段。
基于上述论述, 我们拟通过构建高效负载HMF的载药体系, 限制其流动性, 以解决HMF稳定性较差、易液化的问题: 层状黏土矿物(layered clay minerals, LCM)是一类由天然的细粒层状颗粒和一种或多种层状硅酸盐矿物组成的黏土矿物, 具有生物相容性高、离子交换容量高、易功能化、成本低等特性[24], 被广泛应用于污水处理[25]、医药载体[26]和植物保护领域[27]。在植物保护领域, LCM作为载体负载药物并制备成颗粒剂或其他助剂被广泛运用, 主要应用的种类有膨润土、高岭石、蛭石等。LCM大多具有亲水性, 因而难以吸附结合大多数疏水性有机化合物[24], 而HMF虽然为有机醛类化合物, 但具有很强的亲水性, 在此基础上, 我们通过前期筛选选择了膨润土作为载体, 希望通过其固化HMF, 以此提高HMF的稳定性, 同时保持其杀线虫活性。
为此, 本研究首先以甲壳素类单体的GlcN为原料, 通过建立氯化钙/甲酸催化体系, 实现了HMF的绿色、高效制备; 接着基于HMF和层状黏土的层间域性质, 设计了HMF的固体载药系统并完成多种配型的HMF颗粒剂的制备, 后续开展了HMF颗粒剂的稳定性和盆栽线虫防效实验。通过本研究, 不仅为HMF常温储存稳定性差的问题提供了新的解决思路, 而且HMF作为一种新的未经应用的杀线虫化合物, 对根结线虫的防控措施的扩展也具有积极意义。
1 材料与方法 1.1 材料本实验中所用氨基葡萄糖、氯化钙、甲酸、正丁醇、可溶性淀粉, β-环糊精均为化学纯, 购自国药集团化学试剂有限公司; 壳聚糖(高黏度, > 400 mPa·s)购自上海阿拉丁试剂公司, 膨润土和甲醇(梯度级)购自上海麦克林生化科技有限公司, 0.5%阿维菌素颗粒剂购自山东国润生物农药有限公司。
1.2 实验方法 1.2.1 HMF的制备量取250 mg氨基葡萄糖, 100 mg氯化钙, 4 mL甲酸(9.959 mol/L), 8 mL正丁醇, 加入35 mL耐压瓶中, 聚乙烯盖密封。在160 ℃反应40 min。反应完成后, 反应原液通过碳酸氢钠调节pH为7左右并过滤, 用乙酸乙酯萃取后, 旋蒸脱溶, 残余物通过柱层析法(乙酸乙酯: 石油醚, 1∶10)进行洗脱提纯产物, 得到HMF产物105.325 mg, 收率42.1%。以壳聚糖为原料制备HMF的条件与前述一致, 仅原料不同。收率计算公式如下:
| $ Y = \frac{{{n_{{\text{HMF}}}}}}{{{n_{{\text{GlcN}}}}}}×100%, $ | (1) |
式中, nHMF为产物中HMF的物质的量; nGlcN为原料中GlcN的物质的量。
1.2.2 HMF颗粒剂的制备按HMF与膨润土比例为1∶10.5称取HMF和膨润土, 先加入适量蒸馏水完全溶解HMF, 再加入可溶性淀粉和β-环糊精作为颗粒剂黏结剂, 之后逐级加入称取的膨润土, 先搅拌成混悬液, 再捏合至均匀的湿性软材; 将捏合好的软材放入ZLB-80型旋转造粒机(张家港市荣华机械制造有限公司), 将机器频率设置在15~20 Hz, 使用1.25 mm孔径的挤出筒, 将湿料挤压成长条, 在室温下完全干燥后, 使用粉碎机将其粉碎成颗粒状后, 使用12目标准筛筛分颗粒, 再使用60目标准筛筛去粉末, 得到成品挤出成型, 在28 ℃烘箱中至完全干燥, 粉碎过筛后得到颗粒剂成品。
1.2.3 HMF颗粒剂质量分数检测 1.2.3.1 标样溶液的制备称取HMF标样0.1 g(精确至0.000 2 g), 置于50 mL容量瓶中并用甲醇溶解并稀释至刻度。移取10 mL上述溶液置于另一个50 mL容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 备用。
1.2.3.2 试样溶液的制备称取含HMF 0.1 g(精确至0.000 2 g) 的试样, 置于50 mL容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 超声振荡15 min使试样溶解, 摇匀。移取10 mL上述溶液置于另一个50 mL容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 用孔径为0.22 μm的滤膜过滤, 备用。
1.2.3.3 HPLC法测定HMF颗粒剂质量分数在上述操作条件下, 使用安捷伦1200高效液相色谱仪分析反应液组成, 配置有安捷伦1200泵、标准紫外检测器及AQ-C18 5 μm(4.6 mm×250 mm)反相色谱柱。洗脱液为甲醇: 水(20%∶80%)混合液, 流速0.6 mL∙min–1, 波长254 nm, 柱温维持在25 ℃。待仪器稳定后, 连续注入数针标样溶液, 直至相邻两针HMF峰面积相对变化小于1.0%后, 按照标样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。
1.2.3.4 计算将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中5-羟甲基糠醛的峰面积分别进行平均。试样中HMF质量分数
| $ {\omega _1} = \frac{{{A_2} \times {m_1} \times \omega }}{{{A_1} \times {m_2}}} \times f, $ | (2) |
式中, A₁为标样溶液中, 5-羟甲基糠醛的平均值; A₂为试样溶液中, 5-羟甲基糠醛的平均值; m₁为标样的质量, 单位为克(g); m₂为试样的质量, 单位为克(g); ω为标样中5-羟甲基糠醛的质量分数, 以%表示; f为稀释倍数, 对5-羟甲基糠醛f=1。
1.2.4 HMF颗粒剂的常温贮藏稳定性实验将HMF颗粒剂试样按1.2.2节中检测质量分数后, 在室温下储存3个月后, 按上述方法检测HMF颗粒剂的质量分数。
1.2.5 HMF颗粒剂的热贮稳定性实验将HMF颗粒剂按1.2.2节中方法检测质量分数后, 存放于65 ℃烘箱中14 d, 取出, 放入干燥器中冷却至室温, 按上述方法检测HMF颗粒剂的质量分数。
1.2.6 盆栽实验 1.2.6.1 黄瓜植株培育取黄瓜种置于烧杯中, 使用50~60 ℃的自然冷却的温开水浸泡约4 h, 将滤纸(或卫生纸)均匀铺满在12 cm的培养皿中, 用水浸湿, 将浸泡过的黄瓜种子均匀铺在湿润的滤纸上, 放置在黑暗环境的28 ℃培养箱下24 h, 至黄瓜种子露白。
将蛭石、珍珠岩和蚯蚓粪按照2∶2∶1的比例混匀后, 装入至50孔育苗穴中, 将露白的黄瓜种子置于土壤中, 约1 cm深, 覆混合育苗土, 浇透水, 盖保鲜膜置于人工气候室中培养, 育苗前期避光2~3 d至幼苗破土, 破土后, 去掉保鲜膜, 按照白天14 h (26 ℃), 夜晚10 h(20 ℃)的设置培养至两叶一心期。
1.2.6.2 根结线虫2龄幼虫的孵化将取自人工气候室植物的长有根结的植物根系剪断, 用1%的次氯酸钠溶液浸泡并搅拌, 用纯水冲洗500目的标准筛过滤残渣并收集根结线虫卵, 收集到的虫卵在28 ℃恒温培养箱中避光孵化14 d得到根结线虫2龄幼虫。
1.2.6.3 根结线虫的接种与药剂处理使用立式旋转混合机, 将蚯蚓粪∶细沙∶田园土按1∶1∶1的体积比混合均匀制成盆栽实验用的复合土, 按表 1重量比将各处理组土壤混匀, 每个处理组15个重复, 每个重复接种约800条2龄幼虫, 并在黑暗环境中处理3 d。
| 处理代号 | 药剂 | 与土壤质量比 |
| H1 | 8% HMF颗粒剂 | 1∶20 |
| H2 | 8% HMF颗粒剂 | 1∶30 |
| H3 | 8% HMF颗粒剂 | 1∶40 |
| H4 | 8% HMF颗粒剂 | 1∶50 |
| H5 | 8% HMF颗粒剂 | 1∶100 |
| P | 空白膨润土颗粒 | 1∶50 |
| HL | 0.02g∙mL–1 HMF水剂 | 1∶8 |
| A | 0.5% 阿维菌素颗粒剂 | 1∶100 |
| CK1 | / | 接虫 |
| CK2 | / | 不接虫 |
| 注: /表示不施药 | ||
挑选长势相近的, 两叶一心时期的黄瓜幼苗移栽, 移栽时, 小心地挤压育苗盘底部, 完整地带土取出幼苗, 然后放入提前挖好坑的花盆中, 覆土后轻轻压平。移栽完成后浇水浇透盆栽, 置于黑暗避光环境处理2~3 d后, 按照白天14 h(26 ℃), 夜晚10 h(20 ℃)的设置培养。
1.2.6.5 发病率统计与防效计算分别在14 d、21 d、28 d统计黄瓜植株的根结数, 按下式计算相对防效:
| $ E = \frac{{{N_1} - {N_2}}}{{{N_1}}}×100%, $ | (3) |
式中, E为相对防效; N1为对照组根结数; N2为实验组根结数。
1.2.7 HMF颗粒剂的结构表征 1.2.7.1 XRD使用德国布鲁克公司D8 ADVANCE X射线衍射仪在室温下对样品进行扫描管电流40 mA, 管电压40 kV, Co靶波长1.790 26 Å, 扫描范围为3°＜θ＜80°, 扫描速率是10°/min。
1.2.7.2 TG/DTG使用耐驰STA 449 F3热重检测仪, 测试气氛为氮气, 升温速率10 ℃∙min–1, 在25~900 ℃范围内对样品进行TG/DTG检测。
1.2.7.3 FT-IR使用赛默飞世尔科技(中国)有限公司Thermo Scientific NicoletiS10光谱仪对样品进行扫描, 扫描范围从4 000 cm−1至400 cm−1。
1.2.7.4 TEM场发射透镜使用FEI Tecnai G2 F30对样品进行扫描。
1.2.7.5 SEM扫描电镜将样品烘干处理后均匀分布于导电胶覆盖的样品台上。气吹移除未附着的粉末后真空喷金以形成导电层, 利用HITACHI S-4800型扫描电子显微镜对样品进行扫描。
1.2.7.6 HMF分子尺寸的计算使用Chem 3D软件绘制标准HMF分子的结构模型, 随后导出该模型的三维空间坐标数据, 随后导入到李继存[28]建立的一种在线计算分子三维尺寸的程序中计算。
2 结果与讨论 2.1 甲壳素生物质催化转化为HMF本研究中, 以氨基葡萄糖为原料, 通过构建正丁醇/水两相体系, 在CaCl2和甲酸协同催化下实现了氨基葡萄糖高效催化转化为HMF, 未经纯化的反应产物的HPLC结果如图 1所示, 在11.407 min时的主峰标示HMF的生成, 且杂峰较少, 通过比较HPLC的峰面积, HMF约占反应产物的96.4%, 表明该反应体系具有较好的选择性。
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| 图 1 氨基葡萄糖制备HMF的HPLC图 Fig. 1 HPLC chromatogram of the HMF prepared from glucosamine |
以往以甲壳素生物质为原料催化转化制备5-羟甲基糠醛(HMF)多存在反应条件苛刻、转化率不高、选择性差等问题。如表 2所示, 我们首先使用壳聚糖为原料制备HMF, 收率仅为7.0%。在进一步的研究中, 我们使用氨基葡萄糖为原料, HMF的收率为42.1%, 接近于已报道的以氨基葡萄糖制备HMF的最高收率(49.6%)[21]。本实验的催化反应体系可以简单地分离提纯产物, 获得高纯度的HMF产物(＞95%)并且反应中剩余的甲酸和氯化钙均可以回收进行再次利用, 且基于此我们建立一种HMF的简单、高效制备方法, 为后续的HMF的稳定性和盆栽线虫防效实验提供了充足的物质来源。
| 原料 | 收率 | 产物占比 |
| 壳聚糖 | 7.0 | 90.6 |
| 氨基葡萄糖 | 42.1 | 96.4 |
如表 3所示, 在前期的实验中, 以HMF和膨润土为原料和载体, 以可溶性淀粉和β-环糊精为黏结剂, 尝试了多种不同含量的不同制备颗粒剂的配方, 并通过高效液相法检测了其含量是否符合设计预期。
| 设计质量分数 | HMF | 黏结剂1 | 黏结剂2 | 润滑剂 | 载体 | 水 | 检测质量分数 |
| 5 | 5 | 0 | 0 | 0 | 95 | 95 | 1.75 |
| 5 | 5 | 2.5 | 2.5 | 1 | 89 | 73 | 2.63 |
| 5 | 5 | 5 | 5 | 0 | 85 | 70 | 2.53 |
| 8 | 10 | 5 | 5 | 2 | 105 | 80 | 8.07 |
| 8 | 8 | 0 | 0 | 0 | 92 | 92 | 6.45 |
| 8 | 8 | 4 | 4 | 2 | 82 | 64 | 8.17 |
| 9 | 9 | 9 | 9 | 0 | 73 | 73 | 11.14 |
| 9 | 9 | 0 | 0 | 1 | 92 | 75 | 9.06 |
| 10 | 10 | 5 | 0 | 0 | 85 | 70 | 11.25 |
在制备颗粒剂的初期, 由于设计的含量较低, 且制备工艺不完善, 制备的颗粒剂含量偏低且均匀度难以符合要求。随着配方设计的改进, 并采用逐次增量的等量递增混合方法, 最终通过多次筛选及制备工艺的改进, 可以稳定地制备均一性高且含量符合标准的HMF颗粒剂。本实验中, 主要选用质量分数为8%的HMF颗粒剂(以质量比计: HMF 10, 可溶性淀粉5, β-环糊精5, 液体石蜡2, 膨润土105, 水80)进行后续的实验与讨论。
2.3 HMF颗粒剂的含量根据GB/T 22610—2008中的检测标准, 使用高效液相色谱法对HMF颗粒剂的含量进行了检测, 制得的颗粒剂样品含量如表 4所示, 制备所得的HMF颗粒剂含量与均一性均符合检测标准(含量偏差≤0.8%, 均一性平行偏差≤0.3%)。
| 编号 | 平均质量分数/% |
| 1206-8-1 | 8.09±0.18 |
| 1206-8-2 | 7.90±0.08 |
| 1206-8-3 | 8.00±0.03 |
| 1206-8-4 | 8.08±0.08 |
| 1206-8-5 | 7.97±0.05 |
| 1214-8-1 | 7.96±0.07 |
| 1214-8-3 | 8.17±0.11 |
| 0223-65-1 | 8.07±0.19 |
| 0309-28-1 | 8.17±0.11 |
| 0309-12-1 | 8.15±0.12 |
| 0406-28-1 | 8.14±0.17 |
| 0406-65-1 | 8.15±0.12 |
HMF颗粒剂在常温下储存3个月后的含量检测高效液相色谱图如图 2(a)所示, 储存3个月后, HMF颗粒剂的含量为8.15%, 而储存前为8.17%, 考虑到检测误差, HMF颗粒剂的含量实际上可能没有减少。
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| 图 2 HMF颗粒剂常温储存稳定性及热贮稳定性实验的HPLC图 Fig. 2 HPLC images indicating the storage stability at room temperature and thermal storage stability of HMF-GR |
HMF原样在常温下储存的2周内, 就会发生较大的分解。这种稳定性上直观的差异, 被认为是由HMF的分子迁移率造成的[23]: HMF分子之间存在较强的非共价相互作用, 彼此由氢键相连, 并形成较大的聚集体(图 3)。HMF在溶液中的聚集导致了自组织网络的形成, 网络中分子的紧密排列有利于二聚反应和进一步的齐聚反应。在液态下, 较强的流动性增加了HMF分子的迁移率, 从而使聚合反应更容易发生, 形成二聚和多聚产物发生变质。
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| 图 3 HMF分子网络形成示意图 Fig. 3 Schematic of the formation of an HMF molecular network |
通常在低温下, HMF以固体结晶形式长期稳定储存, 尽管在此状态下, HMF分子也表现出分子间的氢键, 但HMF分子迁移率收到限制, 抑制了聚合反应的发生。
本实验中, 在储存的3个月内甚至更久的时间内, 未观察到油状液体的析出, 且HPLC结果分析其显示出了良好的稳定性。这可能是由于HMF以膨润土为载体制备成颗粒剂, 抑制了HMF分子的流动和迁移, 从而抑制了HMF的老化变质。
2.5 HMF颗粒剂的热贮稳定性根据GB/T 19136—2021中颗粒剂农药热贮稳定性测试方法测试了HMF颗粒剂的热贮稳定性, 结果如图 2(b)所示: 14 d后65 ℃和28 ℃下的颗粒剂中HMF平均质量分数分别为7.99%和8.09%, 差异在允许范围内。并且能够观察到颗粒剂表面无明显变化, 无液体析出。HMF颗粒剂不仅具有良好的常温稳定性, 也具有较好的热贮稳定性。另外, 本实验中使用了比检测标准更高的温度进行测试, 结果是HMF颗粒剂仍较稳定。
2.6 HMF颗粒剂在盆栽实验中对根结线虫的防治效果分别在14、21、28 d下对各处理组盆栽的根结数进行了统计, 并计算了相对防效, 结果如图 4所示。在较高用药量下, H1的3次相对防效相对于对照组P, 分别提升了71.7%、89.3%和96.1%; H2的相对防效与H1接近, 分别提升了68.9%、88.8%和91.8%; 在H3和H4组, 由于药剂使用量降低, 提升的防效有所降低, 分别是41.8%、69.1%、84.3%(H3)和38.7%、59.5%、87.5%; H5的3次防效提升有较为明显的下降, 仅为27.6%、27.5%和57.5%。
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| 图 4 各处理组对南方根结线虫的相对防效 Fig. 4 Relative efficacies of the various treatment groups against southern root-knot nematodes |
在另一项天然产物来源的杀线虫颗粒剂的报道中, 作者使用10%茶皂素颗粒剂在盆栽实验中对黄瓜根结线虫的防效进行了验证, 在低、中、高用药量下防效分别为16.95%、33.89%、37.29%; 高玉红等[29]等统计了0.15%的印楝素颗粒剂对番茄根结线虫的防效, 约为58.2%, 通过与其他市售颗粒剂进行复配, 防效最高可达到85.8%。因此, HMF颗粒剂除最低用药量下的前两次统计中防效相对不显著, 其余统计结果中防效均较为可观, 证明HMF是一类具有开发和应用潜力的天然产物来源的绿色农药。
另外, HL和A处理组在本实验中均表现出了优异的杀线活性, HL选择了与H1处理组等效的浓度, 而A处理组选择了与最低施药量的H5相同的施药比例, 尽管如此, 阿维菌素作为一种已经商品化的优秀杀线虫剂依旧在本实验中保持了100%的相对防效。HL在前两次的相对防效均为100%, 这与我们的预期不太相符, 但在28 d的相对防效有所下降, 而根结的出现意味着HMF溶液的药效正在逐渐减弱, 这可能是因为在日常对盆栽维护的过程中, HMF溶液的有效成分逐渐在土壤中流失, 而HMF-GR则拥有更好的缓释水平。我们推测在更长的实验周期内, 或在环境更加复杂的田间实验中, HL处理组的防效与HMF-GR相比劣势更为明显, 但本实验1个月的实验周期仅观察到了HL防线下降的开始, 接下来的趋势有待进一步的实验验证。
2.7 HMF颗粒剂的结构表征 2.7.1 XRD膨润土类矿物由两个硅氧四面体片和一个铝氧八面体片结合而成, 为2∶1型的层状硅酸盐矿物。其典型片层结构式可用Al4Si8O20(OH)4·nH2O来表示。膨润土的层间域是其吸附赋存有机物的重要区域, 指的是结构片层之间的空间, 这个空间主要含有平衡片层电荷的阳离子和水分子[30]。层间域高度可以通过XRD测得的d001值减去0.96 nm(两个四面体片和一个八面体片的厚度)来计算。膨润土主要有钙基和钠基, 由于水化能力不同, 在自然条件下钙基膨润土的层间域通常会形成两个水分子层高度, 高约为0.5~0.6 nm, 而钠基膨润土层间域为单个水分子层高度, 高约为0.25~0.3 nm。
HMF颗粒剂的XRD结果如图 5所示, 衍射峰的位置与样品内部的结晶度有关, 衍射峰的宽度和强度则与晶体的大小相关[31]。由图 5可知, 相比空白膨润土, HMF颗粒剂的衍射峰的宽度和强度无明显改变, 但其001峰位置横移, 根据布拉格方程2dsinθ=nλ可以得到空白的膨润土颗粒剂的晶面间距d001=1.29 nm符合钠基膨润土的层间域特征[32], 而HMF颗粒剂样品的晶面间距d001=1.49 nm, HMF颗粒剂的层间域的高度为0.59 nm, 经分子模拟计算(图 6), HMF分子的尺寸为0.96 nm× 0.63 nm×0.40 nm, 因此可以初步判断HMF分子进入并扩充了膨润土的层间域[33], 由于层间距增加小于HMF分子最大维度的长度, 我们可以推断HMF分子可能是以平躺或倾斜状态进入层间, 而非完全垂直于层板。
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| 图 5 HMF颗粒剂和空白膨润土颗粒剂的XRD谱图 Fig. 5 XRD spectra of HMF-GR and BEN-GR |
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| 图 6 HMF分子示意图 Fig. 6 Schematic of HMF molecules |
HMF-GR和BEN-GR的FT-IR结果如图 7所示。在1 654.5 cm–1左右的吸收峰对应着C=O伸缩振动, 而在HMF-GR中的C=O峰强度更高, 这意味着HMF的C=O被引入了膨润土中; 另外, 在HMF-GR的1 522.6 cm–1左右处出现了新的吸收峰, HMF的C=C在此处伸缩振动, 进一步证明了HMF已经进入到了膨润土的层间。
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| 图 7 HMF颗粒剂和空白膨润土颗粒剂的FT-IR图谱 Fig. 7 FT-IR spectra of HMF-GR and BEN-GR |
HMF颗粒剂和空白膨润土颗粒剂的热重测试结果如图 8所示。对于空白膨润土颗粒, DTG曲线的两个尖峰表示其在100和300左右均有较快的热分解, 在100开始损失表面相关的水分子, 而在300左右, 迅速损失了层间和晶胞中的水分子, 并导致层间结构的破坏[34]。其TG曲线呈现出二段式的下降, 符合典型的膨润土的热分解的特征; 而HMF颗粒剂的TG曲线上, 在0~300内的重量下降相比空白膨润土颗粒更加平稳, 在300和700左右观察到两个较为明显的质量损失阶段, 对应于DTG曲线上的两个不明显的突起, 该过程相较于空白膨润土颗粒更慢。另外, 空白膨润土颗粒的损失质量比HMF颗粒剂高3.54%, 这可能是空白膨润土颗粒比HMF颗粒剂吸附了更多水分子导致, 而HMF颗粒剂由于层间导入了一部分HMF分子, 最终残余物的质量略高于空白膨润土颗粒。
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| 图 8 HMF颗粒剂和空白膨润土颗粒的热重检测结果 Fig. 8 Thermogravimetric analysis of HMF-GR and BEN-GR |
HMF颗粒剂和空白膨润土颗粒的接触角测试结果如图 9所示, HMF颗粒剂的接触角为62.6°, 空白膨润土颗粒的接触角为41.4°, 接触角通常表示物料的亲水性[35], HMF颗粒剂的亲水性弱于空白膨润土颗粒剂, 但二者依然属于相对亲水。HMF颗粒剂的亲水性相对较弱, 是由于HMF分子进入层间域空腔, 并占据了部分空间, 使得膨润土比表面积下降, 从而吸水性能减弱, 该结论同样可以说明HMF颗粒剂与空白颗粒剂的热性能差异。
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| 图 9 HMF颗粒剂和空白膨润土颗粒的接触角测试结果 Fig. 9 Contact angle tests of HMF-GR and BEN-GR |
HMF颗粒剂和空白膨润土颗粒的TEM透射电镜图如图 10a、b所示, 空白颗粒剂呈现出膨润土典型的片层结构, 表面相对光滑, 层状结构更加明显和规整, 没有明显的凝聚体, 颗粒大小较为均一, 得益于这种结构, 膨润土具有很强的吸水性, 可以吸附自身3倍以上的水, 而HMF颗粒剂的片层结构相对不明显, 表面粗糙, 颗粒间存在较多的凹凸不平的结构, 可见有较大的凝聚体, 这可能表明HMF分子间的相互作用以及HMF与膨润土之间的作用力导致的颗粒聚合。同样地, 在SEM电镜图(图 10c、d)中, HMF颗粒剂的结构片层出现团聚和结块, 层状结构更为松散, 整体粗糙而不平整, 膨润土层间距更大, 层间结构不太清晰, 可能是由于HMF分子的进入使得层间距增加。而空白膨润土颗粒整体较平整, 保持了原有的片层结构[35], 层间距较小, 层状结构清晰可见, 结构密实, 显示出典型的膨润土结构。相对于空白颗粒剂, HMF颗粒剂的片层比表面积将缩小, 整体吸附水的能力变差。这些结果一定程度上解释了HMF颗粒剂的接触角变大是由于层间变化引起的亲水性减弱。
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| 图 10 HMF颗粒剂和空白膨润土颗粒的TEM场发射透射电镜图及SEM扫描电镜图 Fig. 10 Field emission transmission electron microscopy and scanning electron microscopy images of HMF-GR and BEN-GR |
本研究中, 以氨基葡萄糖为原料, 在氯化钙-甲酸催化体系中合成了高纯度、易提纯, 体系可回收的HMF, 并使用了一种层状黏土矿物膨润土作为载体, 设计并制备了HMF的颗粒剂, 可在常温下储存3个月以上, 并在65 ℃下储存2周下均保持稳定, 显著的提高了HMF的稳定性。HMF颗粒剂在盆栽实验中对根结线虫表现出了优异的防治效果, 高用药量下, 防效接近100%, 在最低用药量下, 平均防效约51.81%。XRD结果表明HMF进入了膨润土的层间域中并扩增填充了层间域空腔。TEM和SEM电镜结果显示膨润土的微观结构由于层间域膨胀受到破坏, 由平整的片层形成了多处团聚的块状, 使整体比表面积缩小, 从而吸附结合水的能力变差, 影响了膨润土原本的亲水性, 接触角和热重检测结果支持了这一推测。根据结果推测HMF分子由于被膨润土固定, 分子流动性降低, 抑制了其分子间聚合反应, 获得了较强的稳定性。因此, 本实验制备的HMF颗粒剂极大地改善了HMF的稳定性, 使其能够在常温下长期储存, 并且经实验验证, 对根结线虫有显著的防效。
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