2025, Vol. 49
文章信息
- 姚奕冰, 谢玉素, 刘晓, 许飞. 2025.
- YAO Yibing, XIE Yusu, LIU Xiao, XU Fei. 2025.
- 皱纹盘鲍芳基硫酸酯酶ARSB的复制及功能分化分析
- Replication and functional differentiation of an arylsulfatase B gene cluster in Haliotis discus hannai
- 海洋科学, 49(10): 79-89
- Marine Sciences, 49(10): 79-89.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250425001
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文章历史
- 收稿日期：2025-04-25
- 修回日期：2025-07-09
2. 中国科学院海洋研究所 水产品种创制与高效养殖重点实验室, 山东 青岛 266071
2. Key Laboratory of Breeding Biotechnology and Sustainable Aquaculture, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China
硫酸酯酶(Sulfatase)作为一类催化硫酸酯键特异性水解的关键酶系, 其编码基因广泛存在于从原核生物到复杂真核生物的各类生物基因组中。该酶系通过调控硫酸基团的转移与释放, 在自然界的硫元素生物地球化学循环中发挥着重要作用, 尤其在原核生物中参与有机硫化物分解代谢的研究已形成较为完整的理论体系[1-2]。真核生物中的硫酸酯酶通过动态调节硫酸化修饰过程, 深度参与激素生物合成、溶酶体代谢通路调控及细胞信号转导网络构建等关键生理机制, 其功能异常与多种代谢性疾病及肿瘤发生发展密切相关[3]。尽管硫酸酯酶在基础代谢领域具有重要生物学意义, 但由于多数动物日常膳食中硫酸化物质的丰度较低, 其在动物消化吸收中的作用研究未获得足够重视。植食性海洋动物如鲍等摄食的藻类富含高度硫酸化的海藻多糖, 为适应海洋大型藻类独特的营养组成, 鲍演化出了独特的消化系统及相关消化酶。早在1911年研究人员就已发现芳基硫酸酯酶存在于大型海洋腹足动物中, 其活性主要表现在消化腺部位[4]。Spaulding等[5]发现鲍体内硫酸酯酶的活性与复杂性会随着鲍的生长发育而逐渐增加, 证明硫酸酯酶参与鲍硫酸多糖的消化。
硫酸酯酶家族成员具有高度保守的催化核心结构域, 通过特异性水解硫酸酯键实现生物学功能[3]。该酶系的活性调控依赖于独特的翻译后成熟修饰机制: 所有家族成员均含特征性(C/S)XPXR五肽基序, 其中关键残基(半胱氨酸Cys或丝氨酸Ser)需经氧化修饰为甲酰甘氨酸(FGly)方能形成活性中心。不同物种演化出了差异化的成熟酶系统: 厌氧硫酸酯酶成熟酶(anaerobic sulfatase maturase, anSMEs)在无氧条件下可同时催化Cys型和Ser型硫酸酯酶FGly的生成[6], 而需氧型甲酰甘氨酸生成酶(formylglycine-generating enzyme, FGE)仅能在氧化环境下介导Cys型底物的活化[7-8]。除此之外, 大肠杆菌中也含有一套类似于FGE的硫酸酯酶成熟酶系统[9]。
在生物适应性演化过程中, 正向选择效应能够通过驱动基因复制事件促进基因新功能化(neofunctionalization)的发生[10]。前期研究发现, 皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)硫酸酯酶基因家族出现显著的数量扩张, 其成员在摄食不同大型藻类时表现高度异质性的表达特征[11], 暗示该基因家族在鲍类营养生态适应中可能发生功能辐射演化。鉴于串联重复(tandem duplication)作为基因复制事件的主要分子机制之一[12], 本研究整合比较基因组学与功能基因组学方法, 探究了鲍类芳基硫酸酯酶B(arylsulfatase B, ARSB)基因串联复制事件的演化轨迹; 通过原位杂交技术研究了鲍硫酸酯酶基因表达的组织特异性; 通过qPCR分析了不同饵料条件下串联重复基因表达模式的变化; 并筛选关键基因开展了原核重组表达和蛋白纯化分析。研究结果为鲍硫酸酯酶基因家族的适应性演化机制和基因功能研究奠定了基础。
1 材料和方法 1.1 材料所用皱纹盘鲍为团队培育的皱纹盘鲍8月龄幼鲍。选取壳长相近的健康个体共150只于中国科学院海洋研究所活体培育室分3组饲养6个月, 期间海水温度保持在20~25℃, 盐度30±1, 分别投喂海带(褐藻)、龙须菜(红藻)和孔石莼(绿藻)3种藻类。
1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取从3种藻类喂养组中分别随机取6个个体, 取样鲍平均壳长为32±2 mm, 分别取消化腺用液氮速冻, 然后转移到‒80 ℃冰箱冻存。使用TRIzol试剂盒(Invitrogen, USA)提取总RNA, 用1%的琼脂糖凝胶检查RNA的完整性, 同时通过NanoDrop2000检测RNA的纯度与浓度。
1.2.2 皱纹盘鲍硫酸酯酶基因簇的鉴定和系统发育分析通过本地BLAST鉴定皱纹盘鲍基因组中的硫酸酯酶基因, 并进一步将其作为查询序列(Query), 通过TBlastN对红鲍H. rufescens、黑鲍H. cracherodii、绿鲍H. fulgens, 共3个鲍基因组进行检索, 设置E值(E-value) < 10‒5, 获得最佳匹配基因位点, 4个鲍属物种之间的演化关系参考Tshilate等[13]的研究, 参考基因组来源于鲍基因组数据库(https://db.abalone.dbgenome.org和http://gigadb.org/dataset/100281)。通过python脚本提取基因组注释文件中的基因位置信息, 获得位置紧密相连的硫酸酯酶基因簇。将基因簇蛋白序列与人Homo sapiens、长牡蛎Crassostrea gigas、福寿螺Pomacea canaliculata、红鲍H. rufescens、斑马鱼Danio rerio、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、真蛸Octopus sinensis、黑唇鲍H. rubra的硫酸酯酶蛋白序列进行系统发育分析, 从而定义出复制基因的直系同源基因对。基于MAFFT的L-INS-I算法对以上所有序列进行比对后通过ClipKIT修剪一致性序列, 使用IQ-TREE构建ML系统发育树, 进化模型设置为WAG+F+R4, 自举法检验(Bootstrap)次数设为1 000, 在Chiplot(https://www.chiplot.online)中使用tvBOT对发育树进行可视化编辑[14]。
1.2.3 复制基因序列特征分析使用GSDS2.0(https://gsds.gao-lab.org)对4个复制基因上下游区域及外显子内含子的结构进行鉴定。通过MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)对复制基因蛋白的保守基序进行预测[15], 同时得到保守蛋白结构域的Logo图。使用Jalview2.11.4.1对复制基因进行氨基酸序列比对及可视化[16]。使用InterPro找到硫酸酯酶复制基因蛋白的保守位点[17]。
1.2.4 Real-time qPCR分析为探究不同饵料条件下串联重复基因表达模式的变化, 选取皱纹盘鲍基因组中串联重复排列的4个基因设计qPCR引物(表 1), 内参基因为RPS9[18]。使用HiScript® Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)反转RNA得到cDNA, 使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)通过QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System(ThermoFisher, USA)对基因进行荧光定量检测。使用2‒ΔΔCt法计算基因在各检测样本中的相对表达量, 用GraphPad Prism 9.5软件对数据进行统计和可视化处理。
| 引物名称 | 引物序列(5′-3′) | 用途 |
| HdARSB2 F | GATCACTTATGTATGGCCAGTGT | 基因克隆/原位杂交 |
| HdARSB2 R | TCGAAGATCAACACCATCCG | 基因克隆/原位杂交 |
| FGE F | ATGGCGTCGTCTAGGTTGTG | 基因克隆 |
| FGE R | CACCTCTGATCCCTGATACC | 基因克隆 |
| qPCR HdARSB1 F | GGAAGCACACGATCTGGGAA | qPCR |
| qPCR HdARSB1 R | CAGTCGACAGCGTGGATCAT | qPCR |
| qPCR HdARSB2 F | TGGCACCAGCCTATGAACAG | qPCR |
| qPCR HdARSB2 R | GCCAGGTCGTTATGCTCAGT | qPCR |
| qPCR HdARSB3 F | TCAGTGGAATGGTGTCTGCC | qPCR |
| qPCR HdARSB3 R | CCCTCCCAGATTGTGTGCTT | qPCR |
| qPCR HdARSB4 F | CGTGATCGGAAAATGGCACC | qPCR |
| qPCR HdARSB4 R | GCAGGAAGCTGATTGTCCCT | qPCR |
| RPS9 F | GTCGGCTCGTGCGTAT | qPCR |
| RPS9 R | GGATGTTCACCACCTGTTT | qPCR |
| HdARSB2反向F | CAGGTCGACAAGCTTATGGCCAGTGTAATGGAGGGG | 重组表达 |
| HdARSB2反向R | GCATTATGCGGCCGCTCAACACCATCCGGGGCT | 重组表达 |
| FGE反向F | AATTGGATATCGGCCATGGCGTCGTCTAGGTTGTG | 重组表达 |
| FGE反向R | AGCGGTTTCTTTACCATTTGCATCTTTCAAATAACTAGGCAGTTTG | 重组表达 |
参考已发表的皱纹盘鲍基因组序列信息, 获得硫酸酯酶HdARSB2和促成熟酶HdFGE的全长序列, 用NCBI Primer Blast设计引物(表 1)[19]。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Takara)反转录试剂盒对RNA进行反转录, 合成第一链cDNA作为模板, 使用DNA聚合酶预混液ApexHF HS DNA Polymerase FS(艾科生物科技有限公司)对目的基因进行扩增, 将PCR产物克隆至pMD19-T载体(pMD19-T Vector Cloning Kit, Takara)后测序确认(北京擎科生物科技有限公司)。将克隆到的HdARSB2与HdFGE全长通过反向PCR法连接至双克隆位点载体pETDuet-1中, 其中HdARSB2连接位点的N端带有1个6×His标签方便后续纯化。将重组质粒经测序后转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞(北京擎科生物科技有限公司), 挑取单克隆在含有氨苄抗生素的3 mL TB培养基中37 ℃振荡培养过夜, 次日将菌液接种至补充有相同抗性的150 mL培养液中培养至OD600值0.5~0.6, 加入0.25 mmol/L IPTG于30 ℃下振荡过夜诱导表达。次日收集菌体加入不含变性剂的裂解液充分裂解后在冰浴条件下超声破碎, 超声结束后收集上清液装入镍柱进行纯化, 使用SDS-PAGE检测纯化结果, 然后将收集的蛋白液透析浓缩, 利用底物4-硝基邻苯二酚硫酸二钾盐(4-MUS)检测活性。
1.2.6 组织切片制作和原位杂交取皱纹盘鲍内脏团组织(包含胃、消化腺与性腺)经4%多聚甲醛于4 ℃固定过夜, 依次进行梯度乙醇脱水(50%~100%)、二甲苯透明及石蜡包埋处理。使用Leica RM2235轮转式切片机制备8 μm连续切片, 60 ℃烘片2 h后4 ℃保存备用。
将目标基因HdARSB2的编码区(CDS)克隆至pGEM-T载体(Promega, USA), 经体外转录合成地高辛(Digoxygenin)标记的cRNA探针。组织切片原位杂交步骤为: 55 ℃加热融化切片, 将切片置于二甲苯中脱蜡2次, 每次5 min, 并在浓度梯度递减的乙醇(100%~30%)中复水; 使用磷酸盐缓冲液(PBS)平衡3次, 每次2 min; 使用4% PFA固定15 min, 用PBS清洗3次, 每次5 min; 使用蛋白酶K(10 μg/mL, 37 ℃, 15 min)消化蛋白质15 min, 然后用2 mg/mL的甘氨酸终止反应, 4% PFA重复固定15 min; 使用0.25%乙酸酐(含0.1 mol/L三乙醇胺)对切片进行乙酰化封闭10 min后用杂交缓冲液进行65 ℃杂交过夜。杂交液成分为: 50% 去离子甲酰胺、5×生理盐水柠檬酸钠缓冲液(SSC)、0.1%吐温–20、10% 十二烷基硫酸钠(SDS)、0.3 mg/mL酵母RNA、50 μg/mL肝素。次日用5×SSC在65 ℃下清洗20 min, 再用0.2×SSC在65 ℃下清洗2次, 每次30 min; 用马来酸缓冲液(MAB)在室温下平衡5 min; 用封闭液(含10%山羊血清)在室温下封闭2 h后, 用抗地高辛-AP抗体(Roche, 1︰4 000)在室温下孵育2 h, 然后用MAB洗去过量抗体; 最后用BCIP/NBT底物显色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)避光显色1 h, 用奥林巴斯正置显微镜观察显色情况, 随后用TE缓冲液终止显色。
2 结果 2.1 鲍硫酸酯酶基因簇的鉴定和系统发育分析4种鲍的基因簇鉴定结果如图 1a所示, 该基因簇在不同鲍中均存在类似的串联排列模式。系统发育分析结果显示(图 1b), 该基因簇中各复制基因均聚类于1个鲍特有的分支, 属于ARS亚家族中的ARSB成员[20]。与其他3种鲍亲缘关系相对较远的绿鲍基因组中出现了基因排序的变化, 这可能与基因组的组装或物种演化过程中发生的基因重排事件有关。这一结果表明ARSB基因的串联复制现象可能是鲍物种演化过程中的保守特征, 提示在鲍共同祖先基因组中已经发生了此类复制事件。
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| 图 1 基因簇在不同鲍鱼种基因组中排列示意图及硫酸酯酶氨基酸序列的系统演化树 Fig. 1 Gene cluster arrangement in the genomes of different abalone species and phylogenetic analysis of sulfatases 注: (a)图中同种颜色代表不同的同源基因; (b)图中Hdis: 皱纹盘鲍; Hruf: 红鲍; Hrub: 黑唇鲍; Hful: 绿鲍; Hcra: 黑鲍; Cgig: 长牡蛎; Pcan: 福寿螺; Osin: 章鱼; Dmel: 黑腹果蝇; Drer: 斑马鱼; Hsap: 人; ARS: 芳基硫酸酯酶(arylsulfatase); IDS: 艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(iduronate 2-sulfatase); SGSH: 乙酰肝素N-硫酸酯酶(N-sulfoglucosamine sulfohydrolase); STS: 甾类硫酸酯酶(steroid sulfatase); SULF: 硫酸酯酶(sulfatase) |
结构分析表明这些复制基因具有相似的外显子-内含子分布模式(图 2a), Motif预测分析进一步显示各基因的主要功能基序组成与分布完全一致(图 2b), 关键的硫酸酯酶保守基序CSPSR均严格保守地位于motif2中(图 2c), 这些特征支持它们源自共同祖先基因的串联复制事件。然而, 在整体结构保守的背景下, 各基因外显子数量存在细微差异: HdARSB1、HdARSB2和HdARSB4均包含14个外显子, 而HdARSB3仅保留13个外显子。
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| 图 2 ARSB复制基因的结构、保守motif在复制基因中的位置以及motif2序列信息 Fig. 2 Structure of the arylsulfatase B (ARSB) replication genes, positional relationship of the conserved motif in the replication genes, and the sequence of motif2 |
进一步对4个复制基因的氨基酸序列进行比对, 结果如图 3所示。根据InterPro数据库对硫酸酯酶的注释, 其家族成员共有2个可以充分显示其特征的保守区域, 硫酸酯酶特征1(保守基序CSPSR)在所有复制基因中均保持严格保守; 而硫酸酯酶特征2则显示出分化趋势, 4个基因在该区域均出现了特异性氨基酸替换。
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| 图 3 皱纹盘鲍硫酸酯酶复制基因簇的多序列比对 Fig. 3 Multiple alignment of the sulfatase replication gene cluster in Haliotis discus hannai |
对皱纹盘鲍ARSB家族4个串联重复基因的表达定量结果表明, 在不同藻类喂养条件下, 各基因的表达量存在一定差异。其中HdARSB1和HdARSB3在喂养龙须菜时表达量最高, 其次是孔石莼; 而HdARSB2和HdARSB4均在喂养孔石莼时表达量最高, 其次是龙须菜; 4个基因在投喂海带组表达量均偏低。从实验数据来看, 尽管技术误差控制在可接受范围内, 个体间生物学差异仍导致表达量存在波动。通过整合4个基因的表达模式分析可见: HdARSB1/HdARSB3与HdARSB2/HdARSB4呈现出显著相反的调控趋势(龙须菜偏好型vs孔石莼偏好型)。结合前述基因结构特征的变异, 这种系统性的表达分化模式进一步支持了复制基因发生功能分化的结论。
2.4 皱纹盘鲍HdARSB2与HdFGE重组蛋白的表达HdARSB2基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为1 449 bp, 编码482个氨基酸, 理论分子量为5 430 000; HdFGE基因的ORF长度为1 134 bp, 编码377个氨基酸, 理论分子量为4 240 000。经SDS-PAGE验证, 得到的重组蛋白HdARSB2与HdFGE在其理论分子量大小处均可观察到条带, 但表达的HdFGE存在于沉淀中, 可能在大肠杆菌中以包涵体的形式存在(图 5a)。对融合蛋白进行纯化(图 5b)并经透析复性(图 5c)后通过SDS-PAGE电泳验证了其纯度。为评估重组蛋白HdARSB2的酶活性, 使用4-MUS作为底物进行硫酸酯酶活性检测, 然而检测结果表明透析复性后的蛋白在该实验条件下未表现出硫酸酯酶活性。
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| 图 4 不同饵料饲喂条件下皱纹盘鲍消化腺ARSB家族基因表达特征 Fig. 4 Expression profiles of the ARSB genes in the digestive gland of Haliotis discus hannai under different feeding conditions 注: *代表组间差异性, P < 0.05 |
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| 图 5 HdARSB2重组蛋白的SDS-PAGE分析 Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the recombinant HdARSB2 protein 注: 泳道M为标准蛋白marker; 1为HdARSB2沉淀; 2为HdARSB2上清; 3为HdARSB2全菌体; 4为HdARSB2上清洗脱液; 5为HdARSB2透析后蛋白; 黑色箭头所指为HdARSB2条带; 红色箭头所指为HdFGE条带 |
HdARSB2基因在皱纹盘鲍消化腺组织中的表达位置如图 6所示。结果显示, 蓝紫色阳性杂交信号(红色箭头所示)出现在皱纹盘鲍消化腺内一处腺泡状结构中, 表明HdARSB2基因可能集中在这类腺体结构中表达。已有研究表明, 皱纹盘鲍的消化腺是硫酸酯酶活性最强的组织部位。相比之下, 阴性对照组在相应区域未见明显染色信号, 表明实验组中的杂交信号具有较强的特异性, 且背景染色较低, 验证了实验方法的可靠性。
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| 图 6 HdARSB2基因在组织中表达定位 Fig. 6 HdARSB2 expression and localization in the visceral organs |
鲍栖息于环境复杂多变的浅海区域, 其成长阶段需经历3个关键的摄食转变期。一是在变态时期, 从依赖卵黄营养过渡到摄食底栖硅藻类的颗粒物质, 此时无论摄食何种底栖硅藻, 它们的生长速率都相似; 二是在壳长约超过0.8 mm时, 鲍对硅藻食物的消化能力增强, 开始展现出摄食偏好, 即在摄食某些可有效消化的硅藻时生长更快; 三是在进入稚鲍阶段后, 鲍的摄食习惯从底栖硅藻转变为以大型藻类为主[21]。鲍的消化系统构造使其在摄食活体大型藻类时能够更高效地获取和利用营养, 从而更好地满足生长需求[22]。大型海藻主要分为褐藻、绿藻与红藻, 这些大型海藻富含丰富的碳水化合物和蛋白质等, 其中碳水化合物可占到大型藻类营养物质的40%~ 60%[23]。海藻的碳水化合物中包含许多高度硫酸化的多糖, 例如褐藻的岩藻多糖、红藻的卡拉胶和绿藻中的石莼多糖等。这些多糖不仅是重要的能量来源, 还因其高硫酸化特征, 对摄食它们的动物的消化系统能力提出了更高的要求。因此, 硫酸酯酶在食物降解和营养获取中扮演重要角色[24]。皱纹盘鲍生命周期大部分时间处于摄食大型藻类为主的食性阶段, 硫酸酯酶的高表达可有效提升硫酸化多糖的分解效率, 进而促进营养吸收与能量获取。本研究通过原位杂交技术发现皱纹盘鲍硫酸酯酶主要在一个腺泡状结构中表达, 表明皱纹盘鲍可能存在特化的组织或细胞用于分泌硫酸酯酶。
基因家族的扩张往往与物种的适应性演化密切相关, 在长期的演化过程中, 生物体会通过基因复制来增强某些关键功能以适应复杂的生态环境[10], 硫酸酯酶基因家族的扩张可能直接提升了皱纹盘鲍对富含硫酸多糖藻类的消化适应能力。在多细胞生物中, 基因复制往往伴随着环境选择, 促进个体在特定生态条件下的存活与繁衍[25], 许多与代谢、免疫、发育相关的基因家族都经历了明显的扩张[26]。本研究发现, ARSB基因的串联复制模式在鲍物种中呈现高度保守性。基因组比较分析进一步揭示, 除本研究聚焦的基因簇外, 其附近还分布着其他ARSB基因, 表明ARSB基因在鲍基因组中经历了更大规模的扩张, 可能不仅仅局限于串联复制的形式, 而是由基因组内的转座或片段复制共同驱动。在细菌和真核生物中FGly依赖性硫酸酯酶功能的多样化也被认为是早期不同类型基因复制驱动的结果[27]。
基因串联复制产生的拷贝通常以紧密连锁的形式存在于染色体上, 这种排列特征有利于复制基因的协调表达, 但经复制后, 基因的功能可能会发生不同程度的丧失、分化或是产生新功能[28-29], 本研究在皱纹盘鲍中鉴定的ARSB基因簇正是这一演化过程的典型例证。4个ARSB串联复制成员在外显子-内含子结构及数量上较为相似, motif分布模式显示出的一致性表明其基础酶学功能被完整保留, 这种结构的整体保守性是典型的串联复制特征。然而自然选择作用于基因结构变异, 进而塑造其功能适应性[30-31]: 微观结构上的差异如外显子数目的缺失、排列位置的变化可能影响mRNA稳定性及剪接方式; 硫酸酯酶特征2保守位点区域的氨基酸替换可能通过改变蛋白质三维构象来调控酶学特性(底物结合亲和力或催化效率等方面)。硫酸酯酶家族基因在多种生物中呈现出高度的保守性主要是在硫酸酯酶特征1中关键半胱氨酸/丝氨酸催化位点区域[32], 这种保守性为跨物种功能研究提供了基础, 说明其在功能发挥过程中的作用不可替代。然而, 在其他非核心功能相关的保守位点区域中, 仍可能发生氨基酸序列的变异, 这类变异可能导致酶功能发生分化, 以更好地适应不同的环境条件或生理需求, 这些精细的结构调整均为基因功能分化提供了关键的分子基础。
从诱导基因产生表达模式差异的外界因素来看, 不同藻类底物的化学结构差异可能是驱动ARSB基因表达分化的关键环境因素。龙须菜中主要多糖为琼脂糖和琼脂果胶, 琼脂中琼胶糖主要含3, 6-内醚L-半乳糖和D-半乳糖[33], 琼脂果胶中硫酸酯成分多, 其多糖结构复杂, 硫酸化程度较高, 可能需要催化效率更高或特异性更强的硫酸酯酶如HdARSB1、HdARSB3来对其进行降解。石莼的多糖组分中含有占比高达36%干质量的硫酸化多糖, 主要由硫酸化的鼠李糖等成分构成, 其结构特征可能更适宜被HdARSB2和HdARSB4识别和分解。在海带主要的几种多糖中, 硫酸盐基团含量占比相对较小[34], qPCR结果中一致偏低的表达量说明这4个基因对低硫酸化程度的多糖底物响应较弱。总的来说, 这些基因可能对具有不同硫酸化程度的多糖底物表现出差异化的降解效率, 这很可能是驱动其表达模式在各类藻类饲喂条件下产生分化的关键选择压力。高度硫酸化的复杂多糖可能需要具有更强底物亲和力或更高催化效率的酶来进行降解, 而这类特征可能在部分复制基因中通过微小的序列变异调控演化出来。表达模式的差异反映了4个串联基因在消化系统中的功能分化, 以帮助皱纹盘鲍来适应不同食性环境, ARSB基因家族通过复制产生的多个成员, 不仅在结构上保留核心功能基序, 也在表达调控层面形成适应性分工, 从而提升了皱纹盘鲍在面对复杂藻类多糖环境时的消化效率与营养利用能力。
硫酸酯酶活性的精确调控对维持机体代谢平衡至关重要, 当其翻译后修饰过程出现异常时, 会导致酶活性丧失或显著降低, 这种功能缺陷将引发硫酸化多糖代谢通路的阻断, 会造成底物在溶酶体等细胞区室中的异常累积。在人类疾病中, 此类代谢障碍已被明确证实会引发粘多糖贮积症(mucopolysaccharidoses, MPS)等一系列疾病[35], 其发病机制直接印证了硫酸酯酶在维持细胞代谢稳态中的不可替代作用。本研究中面临的一个关键挑战是目前尚未有海洋软体动物成功表达ARSB的先例, 缺乏直接的表达系统参考, 因此这项表达实验借鉴广泛研究的细菌中的硫酸酯酶表达策略进行初步尝试[8, 36], 但未能获得具有酶活性的重组蛋白。硫酸酯酶的活性发挥严格依赖于其保守位点半胱氨酸残基向FGly的翻译后修饰[37], 已有研究表明, ARSB的酶活调控具有独特的双重依赖性: 除了需要促成熟酶介导的翻译后修饰外, 其活性还严格受限于分子氧的含量[38], 为此在表达过程中使用了曝气更好的挡板三角瓶以增加其溶氧量。虽然大肠杆菌本身存在一套FGly生成系统, 但原核表达系统在表达这类依赖复杂修饰的真核蛋白时存在显著局限: 启动子的强度、融合标签的选择、诱导温度及IPTG浓度控制等很多因素都容易使外源表达的蛋白无法形成其天然构象从而影响本身的性质。尽管原核表达体系具备操作简便、成本低廉等优点, 但对于像ARSB这样依赖复杂修饰的真核酶类, 其表达仍面临巨大挑战[39]。
本研究虽使用原核表达系统获得了HdARSB2基因的可溶性表达, 但纯化蛋白无硫酸酯酶活性, 提示其空间构象仍未达到功能所需的正确折叠状态。经查阅文献发现硫酸酯酶与FGE的共表达, 可将FGE连接至其他类型表达载体如含araBAD启动子的载体上, 在诱导时先添加L-阿拉伯糖来诱导FGE表达再使用IPTG对硫酸酯酶进行诱导[40], 本次实验中诱导的ARSB基因很可能因过低的表达量而不能被大肠杆菌内源成熟系统有效识别, 同时外源表达的FGE也未达到发挥其功能所需的阈值水平。芳基硫酸酯酶的功能性表达高度依赖于其复杂的翻译后修饰机制及表达环境适配性, 在原核系统中, 缺乏适配的内源性修饰机制可能成为限制其正确折叠与功能发挥的关键因素。考虑到该蛋白来源于真核生物, 推测其正确构象的形成可能依赖特定的辅助因子, 而这些在大肠杆菌表达系统中无法有效提供。因此, 后续研究考虑采用酵母、昆虫细胞等真核表达系统或在共表达实验中单独诱导FGE以获取具有生物活性的蛋白。需要强调的是, 以上表达实验并不意味着目标基因本身缺乏功能活性, 而是进一步揭示了在异源表达功能性海洋软体动物酶类过程中所面临的技术挑战。尽管这项实验未获得具有生物活性的重组蛋白, 但为理解软体动物中ARSB的表达特征及未来功能验证路径提供了有益探索, 亦为后续研究奠定了基础。
4 结论(1) 在皱纹盘鲍基因组中鉴定到一个硫酸酯酶基因簇, 其中的基因具有高度的结构保守性和序列相似性, 均为硫酸酯酶ARSB亚家族成员, 可能通过串联复制的方式形成, 系统发育分析表明, 复制事件发生在鲍共同祖先时期。
(2) ARSB复制基因在不同饵料喂养条件下表现出显著的差异表达, 证明复制基因发生了功能分化, 氨基酸序列中保守位点的突变也为功能分化提供了分子层面的证据。原位杂交结果表明ARSB基因可能由消化腺特定的组织分泌。
致谢: 感谢中国科学院海洋研究所海洋科学数据中心(Oceanographic Data Center, IOCAS)对本研究的支持。
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