2025, Vol. 49
文章信息
- 李帅欣, 王兴仁, 王雪芹, 宋琳. 2025.
- LI Shuaixin, WANG Xingren, WANG Xueqin, SONG Lin. 2025.
- 酶解法制备牡蛎肽的工艺优化及抗氧化作用研究
- Optimization of enzyme-based preparation conditions for oyster peptides and evaluation of their antioxidant activity
- 海洋科学, 49(10): 99-110
- Marine Sciences, 49(10): 99-110.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20251009001
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文章历史
- 收稿日期：2025-08-09
- 修回日期：2025-09-06
2. 中国科学院海洋研究所 实验海洋生物学实验室, 山东 青岛 266000
2. Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266000, China
牡蛎是一种优质的海洋来源贝类, 在我国各海域均有分布, 其富含蛋白质、糖原、牛磺酸、维生素和矿物质[1]。近年来, Chen等[2]和Wu等[3]研究表明牡蛎具有抗氧化活性、抗炎活性、免疫调节以及抗高血压等多种生物活性。在这些功能中, 牡蛎肽的抗氧化活性尤为重要。当机体内自由基产生与清除失衡时, 产生的活性氧(radical oxygen species, ROS)及其衍生物会导致氧化应激, 进而损伤细胞膜结构、蛋白质和DNA等生物大分子, 最终诱发多种慢性疾病[4-5]。由于牡蛎抗氧化肽具有高活性、低毒副作用及天然安全的特性, 使其成为极具开发潜力的抗氧化剂, 可有效缓解机体氧化损伤, 在功能食品和医药领域展现出广阔的应用前景[6]。
近年来, 从牡蛎中提取制备抗氧化肽的研究较多。Xia等[7]通过蛋白酶解技术对富硒牡蛎蛋白进行水解, 分离鉴定出具有显著抗氧化活性的多肽组分, 研究发现其可显著降低HepG2细胞内的ROS水平, 保护细胞免受氧化应激损伤。Quan等[8]采用超声辅助酶解技术制备牡蛎活性肽, 从中筛选出新型肽段并证实其对氧化损伤的MC3T3-E1成骨细胞均表现出显著的抗氧化活性。吴虹颖等[9]基于分子对接技术筛选牡蛎酶解产物, 通过体外实验验证牡蛎肽具有较强的抗氧化活性。目前, 生物活性肽的制备方法主要包括直接提取法、发酵法、化学水解法和酶解法[10]。其中, 酶解法因反应条件温和、安全性高且成本较低等优势, 成为制备活性肽的理想方法。由于不同蛋白酶的切割位点具有特异性, 不同蛋白酶制备的酶解产物在肽段组成和生物活性上存在显著差异, 因此选择合适的蛋白酶对优化肽结构及功能至关重要[11]。近年来研究表明, 相较于单一酶解, 双酶复合水解不仅能提高蛋白水解度, 还能获得更丰富的肽段, 并显著增强酶解产物的生物活性[12-13]。然而, 目前关于双酶复合水解技术在牡蛎蛋白中的应用研究仍相对匮乏, 亟待进一步探索。
实验前期采用胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶和复合蛋白酶水解牡蛎蛋白制备了牡蛎肽, 结果表明胰蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶具有较高的抗氧化活性, 因此本研究进一步进行单酶和双酶复合水解优化, 采用单因素实验和正交实验确定多种牡蛎肽的最优制备工艺, 通过分析不同制备工艺获得的牡蛎肽的基本组分和生物活性差异, 确定酶解法制备牡蛎肽的最佳工艺, 为牡蛎蛋白的高值化利用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂新鲜牡蛎(Crassostrea gigas)购自中国青岛团岛海鲜市场, 去壳后于高速匀浆机打碎成牡蛎匀浆, −80 ℃储存; 胰蛋白酶(2.5×105 U/g)、复合蛋白酶(1.0×105 U/g)和风味蛋白酶(3.0×104 U/g)购自Solarbio公司; 其他化学试剂均为分析纯。
1.2 实验方法 1.2.1 酶解法制备牡蛎肽参考Wang等[14]的方法改进制备牡蛎肽。准确称取适量冷冻牡蛎匀浆, 按液固比6∶1加入去离子水, 充分搅拌均匀后, 置于各蛋白酶最适温度水浴中平衡10 min。采用1 mol/L NaOH或HCl溶液精确调节体系酸碱度至各蛋白酶的最适范围。随后, 按照1 000 U/g的加酶量加入各蛋白酶, 分别在适宜温度下恒温酶解5 h。酶解完成后, 立即沸水浴处理15 min灭酶活, 终止反应。将酶解液于4 ℃条件下离心(10 000 r/min, 15 min), 收集上清液, 经冷冻干燥后即得牡蛎肽冻干粉。
1.2.2 单酶水解工艺优化本研究基于胰蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶的适宜酶解条件, 采用单因素实验依次研究酶解反应的酶解时间(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 h)、加酶量(500、1 000、1 500、2 000、2 500 U/g)、液固比(2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1), 以及各蛋白酶所需的酶解温度与pH(胰蛋白酶: 35、40、45、50、55 ℃, pH 6.0、7.0、8.0、9.0、9.5; 复合蛋白酶40、45、50、55、60 ℃, pH 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5; 风味蛋白酶: 40、45、50、55、60 ℃, pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)对牡蛎酶解产物羟自由基清除活性的影响。在单因素实验确定各因素最佳水平的基础上, 进一步采用五因素三水平的正交实验, 以羟基自由基清除活性为评价指标, 系统优化各蛋白酶的酶解工艺参数, 确定水解牡蛎蛋白的最佳条件。
1.2.3 双酶复合水解工艺优化本研究进一步采用双酶复合水解策略优化牡蛎蛋白的酶解工艺。基于单酶单因素实验和正交实验获得的最佳工艺, 优先固定部分参数, 分别设计3种双酶复合水解的四因素三水平正交实验, 其中包括: 胰蛋白酶+复合蛋白酶组, 复合蛋白酶+风味蛋白酶组, 胰蛋白酶+风味蛋白酶组(以下简称: 胰+复合组, 复合+风味组, 胰+风味组), 以羟基自由基清除活性为评价指标, 系统优化双酶复合水解的最优工艺参数(表 1)。
| 双酶复合实验 | 加酶量/(U⋅g−1) | 加酶比例 | 酶解时间/h | 液固比 | 酶解温度/℃ | pH |
| 胰+复合组 | 2 000 | 1∶3, 2∶2, 3∶1 | 5.0, 6.5, 8.0 | 2∶1, 4∶1, 6∶1 | 40, 45, 50 | 7.0 |
| 复合+风味组 | 2 000 | 1∶3, 2∶2, 3∶1 | 6.0, 7.0, 8.0 | 2∶1 | 40, 45, 50 | 6, 7, 8 |
| 胰+风味组 | 1 500 | 1∶2, 1∶1, 2∶1 | 6.0 | 2∶1, 4∶1, 6∶1 | 40, 45, 50 | 6, 7, 8 |
按照国家标准方法进行基本成分的测定。水分含量测定方法参考GB 5009.3—2016; 灰分含量测定方法参考GB 5009.4—2016; 蛋白质含量测定方法参考GB 5009.5—2025, 总氮含量采用凯氏定氮法测定, 再乘以折算系数, 即为蛋白质含量。
1.2.4.2 多肽含量的测定使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio)对牡蛎肽多肽含量进行定量分析。具体实验步骤如下: 移取20 μL浓度为1.0 mg/mL的牡蛎肽样品溶液, 与200 μL BCA工作液混合于96孔板中, 置于37 ℃恒温条件下反应20 min, 使用酶标仪在562 nm波长处测定吸光度。该实验以牛血清蛋白作为标准品(0.2~1.5 mg/mL), 建立标准曲线, 根据标准曲线方程计算牡蛎肽样品中的多肽含量。
1.2.4.3 氨基酸组成的测定采用Wang等[15]的方法测定牡蛎肽的氨基酸组成, 具体操作如下: 将牡蛎肽溶液(溶于6 mol/L HCl)于110 ℃水解24 h, 随后转移至50 mL容量瓶中定容, 经旋蒸去除溶剂后, 残留物溶于1 mL pH 2.2的缓冲液, 最终采用S433D氨基酸分析仪测定氨基酸组成。
1.2.4.4 水解度的测定参考Alahmad等[16]的方法并稍作改进测定水解度。具体步骤如下: 采用甲醛滴定法测定氨基态氮含量, 在25 mL锥形瓶中加入2 mL牡蛎肽溶液、5 mL超纯水、5滴酚酞指示剂(0.5%, 溶于50%乙醇)及2 mL中性甲醛, 混合后以0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微红色终点, 记录NaOH消耗量, 按式(1)计算氨基态氮含量。同时, 采用凯氏定氮法测定总氮含量, 按式(2)计算水解度。
| $N_{\mathrm{a}}(\%)=\frac{c \times\left(V-V_0\right) \times 14.008}{m} \times 100, $ | (1) |
| $ D H(\%)=\frac{N_{\mathrm{a}}}{N_{\mathrm{t}}} \times 100 , $ | (2) |
式中: c为NaOH标准溶液的浓度, mol/L; V为滴定过程中消耗NaOH标准溶液的体积, mL; V0为空白组消耗NaOH标准溶液的体积, mL; m为样品质量, mg; Nt为总氮, %; Na为氨基态氮, %; DH为水解度, %。
1.2.5 分子量分布测定采用高效液相色谱(HPLC)法分析牡蛎酶解产物的分子量分布[17]。具体条件如下: 色谱柱: TSKgel G2000(7.8 mm×30 cm, 5 μm), 流动相: 含0.1%乙酸的水/乙腈(85∶15, V/V), 流速: 0.5 mL/min, 柱温: 25 ℃, 运行时间: 30 min, 进样量: 20 μL, 检测波长: 215 nm。
分子量标定方法: 选取细胞色素C(12 384 Da)、牛胰岛素(5 733.49 Da)、胸腺法新(3 108.28 Da)、L-氧化型谷胱甘肽(612.638 Da)、L-酪氨酸(181.191 Da)和L-半胱氨酸(121.16 Da)作为标准品, 用超纯水配制成5 mg/mL的标准溶液, 经0.22 μm滤膜过滤后进样分析, 以保留时间为横坐标、分子量对数为纵坐标, 绘制标准曲线。牡蛎肽样品经相同前处理后进行HPLC分析, 并根据标准曲线计算其分子量分布范围。
1.2.6 抗氧化活性测定 1.2.6.1 羟自由基清除活性测定羟基自由基清除活性的测定采用分光光度法[18]。具体实验操作如下: 样品组在试管中加入1 mL牡蛎肽溶液、0.5 mL 1% EDTA-Fe、1 mL磷酸盐缓冲液(0.15 mol/L, pH 7.4)、1 mL番红花(36 mg/mL)和1 mL H2O2(3%, 溶于PBS), 充分混匀后置于37 ℃水浴中反应30 min, 反应完成后在520 nm波长处测量吸光度。空白组以1 mL去离子水代替牡蛎肽溶液, 对照组使用1 mL PBS代替H2O2。羟基自由基清除活性E(%)按下式计算:
| $ E(\%)=\frac{A-A_{0}}{A_{1}-A_{0}} \times 100 , $ | (3) |
式中: A为样品组吸光度; A1为对照组吸光度; A0为空白组吸光度。
1.2.6.2 还原能力测定牡蛎肽的还原力测定参照Li等[19]的方法并稍作优化。首先, 在试管中依次加入0.5 mL牡蛎肽、2.5 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L, pH 6.6)和2.5 mL 1% 铁氰化钾溶液, 充分混匀后置于50 ℃水浴反应20 min。随后, 向反应体系中加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液, 室温静置10 min以终止反应。反应完成后, 取2.5 mL反应上清液, 加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%氯化铁溶液, 混匀后室温静置10 min, 700 nm波长处测定吸光度。
1.3 数据处理实验数据运用SPSS软件进行统计分析, 采用单因素方差分析(One-way-ANOVA)和邓肯多重比较(Duncan’s multiple range test)检验组间差异, 进行显著性分析。实验结果以“平均值±标准差”表示, 并通过Excel进行数据可视化, 实验数据进行3次重复测定。
2 结果与讨论 2.1 酶解法制备牡蛎肽的单因素实验本实验通过单因素实验, 以羟自由基清除活性为评价指标, 研究了胰蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶在酶解时间、加酶量、液固比、酶解温度及pH五个因素下的最佳酶解条件。由于3种蛋白酶具有不同的酶切位点和作用特性, 其酶解产物的羟自由基清除活性亦存在显著差异。
如图 1a所示, 随着酶解时间的延长, 复合蛋白酶和风味蛋白酶的羟自由基清除活性呈上升趋势, 其中, 风味蛋白酶组在6 h时达到活性峰值, 羟自由基清除活性为97.23%; 复合蛋白酶组羟自由基清除活性变化趋势比较平稳, 在7 h时活性最高, 达到87.55%。值得注意的是, 胰蛋白酶组在4 h时羟自由基清除活性出现显著下降, 这一现象可能源于酶解过程中部分关键活性肽的构象变化, 导致其自由基捕获能力下降。随着酶解时间的延长, 新的酶切位点逐渐暴露, 生成更多低分子量活性肽段, 促进羟自由基清除活性缓慢恢复, 最终在6 h达到新的酶解平衡状态。Zou等[20]的报道也证实, 活性肽的抗氧化活性不仅取决于肽段分子量, 更与其氨基酸序列和空间结构特征密切相关。
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| 图 1 不同因素水平下牡蛎蛋白酶解产物的羟自由基清除活性 Fig. 1 Hydroxyl radical scavenging activities of the enzyme hydrolysates of oyster protein under different treatment conditions |
就加酶量而言, 不同蛋白酶的最适用量存在显著差异(图 1b), 其中复合蛋白酶组的最适加酶量为2 500 U/g。风味蛋白酶组在加酶量为2 000 U/g和2 500 U/g时, 羟自由基清除活性无显著性差异, 表明当加酶量达到2 000 U/g时, 酶解反应已趋于饱和状态, 继续增加酶用量并不能显著提高其抗氧化活性, 且考虑到酶制剂的成本因素, 最终选择2 000 U/g作为最佳加酶量。而胰蛋白酶组在1 000 U/g时羟自由基清除活性达到峰值(82.04%), 随着加酶量的增加, 活性呈现先急剧下降后缓慢回升的趋势。这一现象说明在加酶量为1 500 U/g时, 关键活性肽段可能因过度酶解而降解, 导致羟自由基清除活性降低。随着加酶量持续增加, 持续的酶解暴露出新的活性中心, 羟自由基清除活性逐渐恢复, 最终在2 000 U/g达到新的稳定状态。
液固比对酶解效果的影响呈现非线性特征(图 1c)。胰蛋白酶组在液固比6∶1时, 羟自由基清除活性最佳, 为96.29%, 而复合蛋白酶和风味蛋白酶组在液固比分别为2∶1和4∶1时达到最高的羟自由基清除活性。过高的液固比会显著降低蛋白酶与底物的有效接触浓度, 导致酶解效率下降, 活性肽段释放减少, 进而影响酶解产物的羟自由基清除活性[21]。
酶解温度对酶解产物的影响具有特异性。如图 1d所示, 风味蛋白酶和复合蛋白酶组的最适温度分别为45 ℃和60 ℃, 考虑到实际应用的经济性, 且复合蛋白酶在50 ℃时活性高达93.16%, 因此可选择50 ℃作为最适酶解温度。胰蛋白酶组在35 ℃时表现出最佳的羟自由基清除活性, 达到90.98%, 这一结果与文献报道的该酶最适温度一致[22]。研究表明, 胰蛋白酶在35~45 ℃区间可维持其空间构象的稳定性, 从而保证高效的酶解效率。然而, 当温度超过45 ℃时, 胰蛋白酶会发生不可逆变性, 导致其活性中心构象改变, 最终导致酶解效率的急剧下降。
pH实验结果表明(图 1e): 复合蛋白酶组和风味蛋白酶组分别在pH为8.0和7.0时达到较高的羟自由基清除活性。胰蛋白酶组在pH 6.0和pH 9.5时羟自由基清除活性相近, 但为避免碱性条件对酶结构的潜在破坏, 实验选择pH 6.0。此外, 在pH 8.0时, 酶解产物中的多肽可能因降解或构象变化而降低自由基清除活性; 而pH 9.5时可能使蛋白酶结构展开, 暴露更多酶切位点, 从而产生更多高活性肽段, 使自由基清除活性再次升高。Wu等[23]在优化黄酒糟抗氧化肽的酶解制备工艺时亦证实pH对蛋白酶活性具有显著影响, 当pH为10.5时, 蛋白酶的空间结构发生变化导致更多活性位点被暴露, 从而促进抗氧化产物的生成。
单因素实验结果表明, 不同蛋白酶在牡蛎蛋白的酶解条件上存在显著差异, 这为优化酶解工艺以获得高抗氧化活性肽提供了重要依据。与刘金丽等[24]的研究对比发现, 虽然同样采用复合蛋白酶, 但红极参蛋白(酶解时间6 h、加酶量1 000 U/g、料液比1∶1.5、温度50 ℃、pH 7.0)与牡蛎蛋白的最适酶解条件存在差异。这一结果也进一步证实, 底物蛋白来源的差异也会影响蛋白酶的酶解工艺参数。
2.2 单酶水解制备牡蛎肽的正交实验基于单因素实验结果, 本研究进一步采用正交实验设计, 以羟自由基清除活性为评价指标, 系统优化了胰蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶的酶解条件。实验结果如表 2所示, 不同蛋白酶的最适酶解条件存在显著差异, 胰蛋白酶制备牡蛎抗氧化肽的最佳条件为: 酶解时间5.0 h, 加酶量1 500 U/g, 液固比4∶1, 酶解温度40 ℃, pH 7.0。极差K值分析各因素对羟自由基清除活性的影响排序为: 液固比 > pH > 酶解温度 > 加酶量 > 酶解时间。复合蛋白酶制备牡蛎抗氧化肽的最佳条件为: 酶解时间8.0 h, 加酶量2 000 U/g, 液固比2∶1, 酶解温度50 ℃, pH 8.0; 影响因素排序为: 液固比 > 加酶量 > 酶解温度 > 酶解时间 > pH。值得注意的是, 加酶量和酶解温度对复合蛋白酶的影响仅次于液固比, 表明适宜的酶浓度和温度能够提升复合蛋白酶的酶解产物活性。风味蛋白酶制备牡蛎抗氧化肽的最佳条件为: 酶解时间7.0 h, 加酶量1 500 U/g, 液固比2∶1, 酶解温度45 ℃, pH 6.0; 影响因素排序为: 液固比 > 加酶量 > 酶解温度 > pH > 酶解时间, 与复合蛋白酶类似, 风味蛋白酶组酶解产物的羟自由基清除活性也主要受液固比和加酶量的调控。
| 实验号 | 胰蛋白酶 | 复合蛋白酶 | 风味蛋白酶 | |
| 羟自由基清除活性/% | ||||
| 1 | 92.43 | 93.32 | 95.67 | |
| 2 | 94.15 | 96.74 | 93.77 | |
| 3 | 94.15 | 97.24 | 96.51 | |
| 4 | 83.97 | 89.69 | 90.23 | |
| 5 | 90.46 | 86.63 | 88.59 | |
| 6 | 91.32 | 89.73 | 85.50 | |
| 7 | 84.86 | 79.95 | 84.16 | |
| 8 | 86.42 | 87.38 | 84.40 | |
| 9 | 90.43 | 78.55 | 84.35 | |
| 10 | 90.99 | 92.82 | 91.18 | |
| 11 | 91.25 | 90.47 | 87.64 | |
| 12 | 94.75 | 92.04 | 79.22 | |
| 13 | 83.05 | 79.13 | 79.67 | |
| 14 | 83.75 | 83.42 | 83.36 | |
| 15 | 85.43 | 80.07 | 80.67 | |
| 16 | 88.93 | 98.47 | 96.71 | |
| 17 | 91.03 | 99.46 | 95.32 | |
| 18 | 91.86 | 100 | 96.21 | |
| 19 | 79.80 | 89.23 | 81.71 | |
| 20 | 81.67 | 95.42 | 82.71 | |
| 21 | 86.48 | 88.94 | 80.37 | |
| 22 | 93.42 | 95.26 | 95.91 | |
| 23 | 91.44 | 97.65 | 92.73 | |
| 24 | 92.72 | 97.85 | 95.17 | |
| 25 | 84.03 | 89.69 | 79.87 | |
| 26 | 85.59 | 88.57 | 80.67 | |
| 27 | 87.63 | 92.99 | 83.16 | |
| 最佳条件 | 酶解时间/h | 5.0 | 8.0 | 7.0 |
| 加酶量/(U‧g–1) | 1 500 | 2 000 | 1 500 | |
| 液固比 | 4∶1 | 2∶1 | 2∶1 | |
| 酶解温度/℃ | 40 | 50 | 45 | |
| pH | 7.0 | 8.0 | 6.0 | |
综上所述, 液固比在3种蛋白酶体系中均对羟自由基清除活性表现出显著的影响, 此外, 加酶量和酶解温度也是酶解反应的关键因素。本研究结果与多位学者的研究结论相吻合。例如, 高云龙[25]在优化冰岛刺参抗氧化肽的制备工艺时, 同样发现复合蛋白酶是最佳用酶, 并指出底物浓度对刺参肽抗氧化活性影响最大, 同时酶解温度和加酶量也起到重要作用。此外, 吴亚婷[26]在研究大鲵肌肉蛋白的胰蛋白酶水解工艺时, 也证实了液固比对活性肽的抗氧化活性具有最显著的影响, 进一步验证了本实验的结论。
2.3 双酶协同水解制备牡蛎肽的正交实验除单一蛋白酶水解外, 现有研究表明, 采用双酶或多酶的分步或同步水解方式通常能够获得优于单酶的处理效果[27]。基于这一研究背景, 本研究在3种蛋白酶单因素实验及正交实验的基础上, 综合考虑了总加酶量, 加酶比例、酶等因素解时间、液固比、酶解温度及pH, 同时以羟自由基清除活性为评价指标, 设计了3组双酶同步水解的正交实验(详见表 1)。
实验结果如表 3所示。胰+复合组制备牡蛎抗氧化肽的最佳条件为: 加酶比例1∶3, 酶解时间6.5 h, 酶解温度50 ℃, 液固比2∶1; 影响因素排序为: 液固比 > 加酶比例 > 酶解温度 > 酶解时间。胰+风味组制备牡蛎抗氧化肽的最佳条件为: 加酶比例1∶2, 液固比2∶1, 酶解温度45 ℃, pH 8.0; 影响因素排序为: 液固比 > 加酶比例 > pH > 酶解温度。复合+风味组制备牡蛎抗氧化肽的最佳条件为: 加酶比例1∶3, 酶解时间6.0 h, 酶解温度50 ℃, pH 8.0; 影响因素排序为: pH > 加酶比例 > 酶解时间 > 酶解温度。值得关注的是, 在3组双酶复合水解实验中, 液固比为2∶1时均表现出最优的羟自由基清除活性, 分别为93.04%, 89.48%和98.49%。这一结果说明, 在一定范围内, 增加底物浓度有助于提高酶解效率, 进而增强产物的抗氧化活性。此外, 已有学者研究发现加酶比例是多酶水解体系的关键参数。例如, 李慧凝等[28]采用动物蛋白酶和风味蛋白酶复合水解鲣鱼蛋白, 发现加酶比例为4∶1时水解度达到最高, 进一步验证加酶比例对酶解效果的重要影响。
| 实验号 | 胰+复合组 | 胰+风味组 | 复合+风味组 | |
| 羟自由基清除活性/% | ||||
| 1 | 98.45 | 94.58 | 97.44 | |
| 2 | 90.51 | 89.04 | 98.03 | |
| 3 | 90.17 | 84.82 | 100.00 | |
| 4 | 91.33 | 96.67 | 99.19 | |
| 5 | 85.91 | 85.99 | 96.28 | |
| 6 | 94.19 | 85.17 | 97.48 | |
| 7 | 83.28 | 100.00 | 96.75 | |
| 8 | 97.25 | 92.92 | 97.06 | |
| 9 | 87.77 | 88.89 | 94.46 | |
| 最佳条件 | 加酶比例 | 1∶3 | 1∶2 | 1∶3 |
| 酶解时间/h | 6.5 | – | 6.0 | |
| 酶解温度/℃ | 50 | 45 | 50 | |
| 液固比 | 2∶1 | 2∶1 | – | |
| pH | – | 8.0 | 8.0 | |
基于正交实验结果, 本研究优化并确定了6组不同牡蛎抗氧化肽的酶解制备条件, 进一步在各组最优条件下制备了6组牡蛎抗氧化肽(胰蛋白酶组、复合蛋白酶组、风味蛋白酶组、胰+复合组、胰+风味组、复合+风味组), 用于后续实验。
2.4 六组牡蛎肽的组分分析 2.4.1 牡蛎肽的基本组分分析牡蛎富含优质蛋白质, 如表 4所示, 6组不同酶解条件制备的牡蛎肽在蛋白质、水分和灰分含量上差异较显著。其中, 胰蛋白酶组牡蛎肽的蛋白质质量浓度最高, 为50.39%±0.06%, 其次是风味蛋白酶和胰+复合组牡蛎肽的蛋白质质量浓度, 分别为48.61%±0.53%和47.85%±0.21%。值得注意的是, 复合+风味组和胰+风味组牡蛎肽的蛋白质质量浓度较低, 推测可能与不同酶解体系制备的牡蛎肽中多肽、多糖以及矿物质含量存在差异有关。此外, 胰+复合组牡蛎肽的水分质量浓度最高, 灰分质量浓度最低, 表明其具有较好的溶解性和较低的矿物质残留。该结果优于付柏枫[29]的研究, 其报道了未经酶解的牡蛎粉的蛋白质质量浓度为44.01%, 灰分质量浓度为15.86%, 进一步证实了酶解工艺对牡蛎蛋白资源高效利用的积极意义。
| 组别 | 蛋白质/% | 水分/% | 灰分/% |
| 胰蛋白酶 | 50.39±0.06 | 12.04±0.12 | 11.22±0.06 |
| 复合蛋白酶 | 47.53±1.18 | 14.09±0.26 | 11.08±0.02 |
| 风味蛋白酶 | 48.61±0.53 | 13.98±0.12 | 18.08±0.08 |
| 胰+复合组 | 47.85±0.21 | 15.20±0.29 | 10.17±0.02 |
| 胰+风味组 | 43.17±0.19 | 11.06±0.11 | 13.15±0.10 |
| 复合+风味组 | 42.70±0.49 | 12.07±0.13 | 21.30±0.34 |
多肽含量是牡蛎肽生物活性的关键指标之一, 因其直接反映潜在活性肽的丰度。如图 2所示, 不同酶解工艺制备的6组牡蛎肽在多肽含量上存在显著差异。其中胰+复合组表现出最佳的多肽质量浓度(50.43%), 其次是复合蛋白酶组和胰蛋白酶组, 多肽质量浓度分别为40.89%和32.15%, 胰+风味组的多肽质量浓度最低, 为19.18%。这一现象可能与风味蛋白酶的特异性作用机制有关: 该酶同时具备内肽酶和外肽酶活性, 在酶解过程中倾向于将蛋白质降解为游离氨基酸, 而非保留功能性肽段, 从而降低了多肽的质量浓度[30]。
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| 图 2 六组牡蛎肽的多肽质量浓度 Fig. 2 Peptide concentrations of the six groups of oyster peptides 注: 实验数据为3次重复测定的平均值±标准差(n=3)。采用SPSS软件进行单因素方差分析(ANOVA), 不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。 |
在蛋白酶水解牡蛎蛋白的过程中, 肽键断裂不断释放多肽片段, 其氨基酸组成直接影响其生物活性。从表 5可以看出, 由于各种蛋白酶的酶切位点不同, 所制备的6组牡蛎肽的氨基酸组成也存在差异。其中, 胰蛋白酶组牡蛎肽的总氨基酸质量浓度最高, 达到34.89 mg/100 mg, 其次为胰+复合组, 而复合+风味组牡蛎肽的总氨基酸质量浓度最低, 为29.90 mg/100 mg。此外, 牡蛎鲜味的主要贡献者谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asp)在6组牡蛎肽中占比较高, 分别约占总氨基酸质量浓度的17%和10%。该结果与Cho等[31]对太平洋牡蛎的氨基酸组分分析类似, 其也报道了该牡蛎中Glu和Asp质量浓度最高。必需氨基酸质量浓度是衡量牡蛎肽营养价值的关键指标。六组牡蛎肽均含有7种必需氨基酸(EAA)。其中, 胰蛋白酶组牡蛎肽的EAA质量浓度最高, 为11.70%, 其次是胰+风味组和复合蛋白酶组, 其EAA质量浓度分别为11.53%和11.52%。
| 氨基酸 | 胰蛋白酶 | 复合蛋白酶 | 风味蛋白酶 | 胰+复合 | 胰+风味 | 复合+风味 |
| Thra | 1.66 | 1.59 | 1.43 | 1.57 | 1.66 | 1.44 |
| Ala* | 2.27 | 2.15 | 1.93 | 2.14 | 1.96 | 1.86 |
| Vala* | 1.73 | 1.83 | 1.64 | 1.78 | 1.77 | 1.59 |
| Meta* | 0.27 | 0.20 | 0.29 | 0.40 | 0.19 | 0.26 |
| IIea* | 1.56 | 1.67 | 1.62 | 1.61 | 1.60 | 1.48 |
| Leua* | 2.38 | 2.41 | 2.23 | 2.36 | 2.35 | 2.16 |
| Phea* | 1.34 | 1.42 | 1.22 | 1.28 | 1.39 | 1.17 |
| Lysa | 2.76 | 2.42 | 2.19 | 2.44 | 2.57 | 2.18 |
| Pro* | 2.14 | 2.06 | 1.87 | 1.97 | 1.98 | 1.64 |
| ∑AA | 34.89 | 33.91 | 30.64 | 33.85 | 33.81 | 29.90 |
| ∑EAA | 11.70 | 11.52 | 10.62 | 11.45 | 11.53 | 10.27 |
| ∑HAA | 11.69 | 11.72 | 10.79 | 11.54 | 11.24 | 10.15 |
| 注: a代表必需氨基酸; *代表疏水性氨基酸; ∑AA为总氨基酸质量浓度; ∑EAA为总必需氨基酸质量浓度; ∑HAA为总疏水性氨基酸质量浓度; 氨基酸质量浓度单位为mg/100 mg。 | ||||||
疏水性氨基酸丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和脯氨酸(Pro)等, 因其侧链结构特性, 可通过提供氢原子清除自由基, 常被报道与抗氧化活性相关[32]。本研究中, 复合蛋白酶组牡蛎肽的疏水性氨基酸质量浓度最高(11.72%), 其次是胰蛋白酶组和胰+复合组, 说明这3种牡蛎肽可能具有更优越的抗氧化活性。Yin等[33]的研究也发现, 具有较高疏水性氨基酸质量浓度的水解产物表现出较强的抗氧化活性。
2.4.4 水解度分析水解度作为评价蛋白质酶解效率的关键参数, 其数值差异主要源于蛋白酶的特异性酶切位点分布。本研究发现, 6组酶解工艺对牡蛎蛋白的水解度影响显著(图 3), 其中, 胰+风味组表现出最高的水解度, 其次是复合+风味组和胰+复合组。这一结果可能与复合蛋白酶的多元酶切特性有关, 该酶系包含外切肽酶、内切蛋白酶和风味蛋白酶等多种组分, 能提供更多的酶切位点, 加之与风味蛋白酶和胰蛋白酶的协同作用, 从而提升水解效率。相比之下, 单一酶解体系的水解度相对较低, 其中胰蛋白酶组水解度最低, 为39.85%, 其次是复合蛋白酶和风味蛋白酶组。3种双酶复合水解的水解度普遍优于单酶水解, 达到显著性差异, 这可能与不同蛋白酶的特异性互补有关, 多种酶协同作用能够更全面地切断肽键, 从而产生更高程度的水解产物[34]。
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| 图 3 六组牡蛎肽的水解度分析 Fig. 3 Analysis of hydrolysis degree in the six groups of oyster peptides 注: 实验数据为3次重复测定的平均值±标准差(n=3)。采用SPSS软件进行单因素方差分析(ANOVA), 不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。 |
肽的活性与其分子量密切相关, 通常小分子量肽表现出更强的抗氧化活性, 这一现象可能归因于酶解过程中蛋白质结构展开, 使得关键活性氨基酸残基更易暴露, 从而增强与自由基的相互作用[35]。本研究测定了6种牡蛎肽的分子量分布, 结果如图 4所示。所有酶解产物中分子量小于5 000 Da的占比较高, 且小于1 000 Da的组分占比尤为突出, 约在57%~76%。此外, 双酶联用能更好地水解蛋白质, 生成更多低分子量肽段。当前研究普遍支持低分子量肽具有更高抗氧化活性的观点。例如, Yin等[33]在含硒西兰花肽的研究中发现, 1 000~3 000 Da组分表现出最优的抗氧化活性。Wang等[32]同样报道了棉籽抗氧化肽中分子量小于3 000 Da的组分的DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性和Fe2+螯合活性均显著优于高分子量组分。
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| 图 4 六组牡蛎肽的分子量分布 Fig. 4 Molecular weight distributions of the six groups of oyster peptides |
氧化应激是自由基与抗氧化防御系统失衡导致的细胞损伤过程, 与衰老、癌症、糖尿病等疾病密切相关。本研究测定了6组牡蛎肽的羟自由基清除活性和还原能力, 结果表明, 2种抗氧化活性均呈浓度依赖性, 随着牡蛎肽浓度升高, 羟自由基清除活性和还原能力显著增强。其中胰+复合组、风味组和胰+风味组牡蛎肽在各浓度下均表现出较优的羟自由基清除能力, 尤其是在浓度为10 mg/mL时, 胰+风味组和胰+复合组牡蛎肽的羟自由基清除活性均超过75%。此外, 图 5(b)显示胰+复合组牡蛎肽在不同浓度下的还原能力显著优于其他组牡蛎肽, 展现出显著的抗氧化潜力。
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| 图 5 六组牡蛎肽的抗氧化活性 Fig. 5 Antioxidant activities of the six groups of oyster peptides 注: 实验数据为3次重复测定的平均值±标准差(n=3)。采用SPSS软件进行单因素方差分析(ANOVA), 不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。 |
上述结果提示, 胰蛋白酶与复合蛋白酶的联合使用可能通过协同效应提升了牡蛎肽的抗氧化活性, 其机制或与2种酶的特异性互补有关: 胰蛋白酶特异性切割精氨酸和赖氨酸的羧基端肽键, 而复合蛋白酶通常对疏水性氨基酸附近的肽键具有广谱水解活性, 联合作用可能释放更多含疏水侧链的活性肽段[36]。类似现象在其他研究中亦有报道。例如, Teng等[13]发现胰蛋白酶+复合蛋白酶+风味蛋白酶的三酶组合显著提高了水母肽的抗氧化活性; Yue等[37]通过碱性蛋白酶与风味蛋白酶的联合酶解, 从鲢鱼排中获得了高活性抗氧化肽。这些研究均支持多酶协同策略在功能性肽制备中的优势, 其核心在于酶切位点的多样性可更高效释放具有特定结构的活性片段。
3 结论本研究以牡蛎蛋白为原料, 通过单酶单因素实验、正交实验及双酶复合水解正交实验, 系统优化了6组高活性牡蛎抗氧化肽的制备工艺。结果表明, 六组牡蛎肽的组分与活性差异较大, 其中胰+复合组水解效果最佳, 其最优工艺参数为: 总加酶量2 000 U/g, 加酶比例1∶3, pH 7.0, 酶解时间6.5 h, 液固比2∶1, 酶解温度50 ℃。在此条件下, 所得牡蛎肽的羟自由基清除活性显著提高, 且多肽质量浓度、总氨基酸及疏水性氨基酸占比均优于其他制备组。本研究不仅建立了高效的双酶复合制备牡蛎抗氧化肽的水解工艺, 也为后续牡蛎肽抗氧化机制的研究与应用提供科学依据。
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