2025, Vol. 49
文章信息
- 胡青松, 杨文红, 鲍凌翔, 洪鑫, 孙灏, 周杜源, 刘春胜. 2025.
- HU Qingsong, YANG Wenhong, BAO Lingxiang, HONG Xin, SUN Hao, ZHOU Duyuan, LIU Chunsheng. 2025.
- 香港牡蛎及其养殖水体中食源性致病菌的周年变动规律及环境相关性
- Annual variations and environmental correlations of foodborne bacterial load in Hong Kong oysters (Crassostrea hongkongensis) and their aquaculture waters
- 海洋科学, 49(11): 28-37
- Marine Sciences, 49(11): 28-37.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250925001
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文章历史
- 收稿日期：2025-09-25
- 修回日期：2025-10-27
海洋贝类是人类重要的蛋白质和脂肪酸来源, 消费需求持续增长[1-2]。然而, 牡蛎、贻贝等双壳贝类可富集病毒、细菌及藻类毒素等, 如处理不当极易造成食品安全风险[3]。据报道, 食源性疾病每年导致约6亿病例, 已成为重大公共卫生问题。2018年欧盟共报告5 146起病例, 波及48 000人; 中国在2021年共报道5 493起相关食品安全事件, 导致32 000人患病、117人死亡[4-5]。双壳贝类中常见食源性致病菌包括弧菌属[创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、霍乱弧菌等(Vibrio cholerae)][6]、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)和嗜水气单胞菌属(Aeromonas hydrophila)等[3]。
食源性疾病暴发呈现显著的时空差异, 并与季节和气候因素密切相关[7]。现有研究表明, 大肠杆菌和沙门氏菌引发的疾病发生率随气温上升而增加[8]; 创伤弧菌和副溶血弧菌在夏秋季检出率最高, 其丰度与海水温度呈正相关[9-10]。此外, 食源性疾病发生存在显著的地域差异, 如美国不同州的贝类食源菌发病率可相差4倍[11]; LIU等[12]对中国香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)食源菌检查显示, 其创伤弧菌含量为1×103~6×103 CFU/g, 而FROELICH等[13]对北卡罗来纳州美洲牡蛎(Crassostrea virginica) 周年检测发现, 其创伤弧菌含量为30~1×104 CFU/g。这些差异主要源于环境因子的波动对牡蛎生理状态以及致病菌繁殖与致病性的影响。
牡蛎是中国养殖产量最大的贝类, 年养殖量超过667万t[14]。香港牡蛎是中国主要的养殖牡蛎品种之一, 养殖地域位于广东、广西和海南地区[15]。随着养殖规模扩大和海洋环境变化, 香港牡蛎中食源性致病菌污染问题日益突出, 严重制约产业可持续发展[16-17]。本研究以海南地区养殖香港牡蛎为对象, 采用平板涂布与PCR技术, 检测其养殖水环境及不同组织(外套膜、闭壳肌、性腺、鳃、消化腺)中菌落总数及5种食源性致病菌(大肠杆菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌和单增李斯特氏菌)的周年含量变化, 同时分析各食源菌含量与环境因子的相关性, 以期为揭示牡蛎食源菌含量变动规律及牡蛎食用安全预警提供支撑。
1 材料与方法 1.1 实验材料每月25日前后, 于海南东寨港牡蛎养殖场(110°34′37″E, 19°57′10″N)采集香港牡蛎样本, 每次采集15只。采集后立即使用海水清洗, 并于1 h内送至实验室。为降低潮汐波动对牡蛎及其养殖水体的影响, 采样时间均选择在平潮期进行。所采集样本的基础数据如下(平均值±标准差): 湿质量为179.4±26.8 g, 软体质量为35.3±7.2 g, 壳长为4.2±1.8 cm, 壳高为9.6±2.4 cm。
1.2 水质参数测定在采集牡蛎同时, 用多参数水质仪(AZ86031)同时测定牡蛎养殖周边海水的温度、盐度、pH和溶解氧。用采水器采集水样, 经滤膜过滤(津腾微孔过滤膜)、丙酮萃取后, 使用分光光度法测定叶绿素a。另取100 μL水样用于检测养殖水体食源菌检测, 每个样品5个平行。
1.3 牡蛎样品处理选取健康、外壳完整的15只香港牡蛎, 随机分为5组, 每组3只。使用灭菌解剖器材对每只个体进行解剖, 分别采集外套膜、闭壳肌、消化腺、鳃和性腺组织。各组织经灭菌PBS清洗后, 暂存于2 mL灭菌离心管中。将同组内3只个体的同一组织合并于同一离心管中, 精确称质量后转入至无菌玻璃匀浆器。按质量体积比1∶5加入灭菌PBS缓冲液, 充分匀浆至组织完全破碎并均匀分散。最后, 将组织匀浆液进行10倍梯度稀释, 分别吸取100 μL各梯度稀释液进行细菌涂板培养。
1.4 食源性病原菌含量分析本实验严格遵循无菌操作规范, 采用选择性培养基对牡蛎及水体样本中菌落总数及5种食源性致病菌进行定量检测。对假阳性率较高的创伤弧菌和副溶血弧菌, 进一步通过PCR方法进行验证。每种浓度菌液设置5个平行平板进行涂布, 所有操作均在无菌操作台内进行, 并以无菌PBS涂布平板作为阴性对照, 以排除操作污染。
涂布后的平板均置于36 ℃恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)中培养48 h, 结束后进行菌落计数。各目标菌种的分离与计数采用如下选择培养基: 菌落总数(TBC)使用平板计数琼脂(PCA, 广东环凯微生物科技有限公司); 大肠杆菌使用结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA); 单增李斯特氏菌使用PALCAM琼脂(PAL); 沙门氏菌采用亚硫酸铋琼脂(BS)。上述培养基特异性强, 特征菌落形态典型, 可直接依据典型形态进行计数。创伤弧菌与副溶血弧菌检测采用选择性培养基培养与毒力基因PCR验证相结合的方法。创伤弧菌选用蛋白胨-氯化钠-纤维二糖-多粘菌素E琼脂(PNCC)分离, 副溶血弧菌则使用硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂(TCBS)筛选。针对创伤弧菌, 以其种特异性溶血素基因vvhA为靶标, 使用引物Vvh-785F (5′-CCGCGGTACAGGTTG GCGCA-3′)与Vvh-1303R(5′-CGCCACCCATTTCGG GCC-3′)进行扩增, 预期产物长度为519 bp。副溶血弧菌则以其热不稳定溶血素基因tlh为靶标, 使用引物L-tlh (5′-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3′)与R-tlh(5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′)进行扩增, 预期产物长度为450 bp。
PCR反应体系为20 μL, 包含2× Power Tap PCR Master Mix预混液(TaKaRa)10 μL、待测菌液1 μL、正反向引物各0.5 μL, 并用ddH₂O补足至总体积。创伤弧菌vvhA基因的扩增程序为: 94 ℃预变性5 min; 随后进行30个循环的扩增(94 ℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min); 最后72 ℃延伸5 min。副溶血弧菌tlh基因的扩增程序为: 94 ℃预变性3 min; 随后30个循环(94 ℃变性60 s, 58 ℃退火60 s, 72 ℃延伸2 min); 最后72 ℃延伸10 min。
每月对选择性培养基上的特征菌落计数后, 分别从PNCC和TCBS平板上随机挑取40个典型菌落(不足40则全部检测)进行上述PCR验证。最终, 根据PCR阳性菌落数占挑取菌落总数的比例, 乘以当月特征菌落计数, 作为该样品中相应病原菌的定量结果[18]。
1.5 数据处理所有数据均以平均值±标准差表示(n=5)。采用Excel 2016对食源性细菌数据进行处理和图表绘制。统计分析使用SPSS 27完成, 组间细菌含量比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA), 若结果显著, 进一步以独立样本t检验进行两两比较。养殖水体及牡蛎组织中食源性细菌含量与环境因子之间的相关性采用Bivariate Correlations (Pearson检验)进行分析。Pearson相关系数®用于评估变量间线性关系的强度与方向, 其取值范围为–1~1; 正值表示正相关, 负值表示负相关, 绝对值越接近1, 相关性越强。P < 0.05认为差异有统计学意义。
香港牡蛎各组织菌落总数、大肠杆菌、单增李斯特氏菌和沙门氏菌含量计算公式如下:
细菌含量(菌落形成单位, CFU/g) = (平均菌落数×稀释倍数×5)/0.1。
创伤弧菌和副溶血弧菌含量计算公式如下:
细菌含量(CFU/g) = (平均菌落数×PCR 阳性比例×稀释倍数×5)/0.1。
2 结果与分析 2.1 环境因子周年变化对香港牡蛎养殖区水质进行了周年监测(图 1)。结果显示, 海水温度变化范围为17.87 ℃~31.86 ℃, 最低值出现于12月, 最高值出现于8月; 养殖水体pH介于7.48~7.89, 7月最高, 11月最低; 盐度变化范围为8.41~32.17, 12月最高, 9月最低; 溶解氧质量浓度为3.67~6.53 mg/L, 6月最高, 7月最低; 叶绿素a含量为1.34~9.15 mg/L, 9月最高, 4月最低。
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| 图 1 水环境因子周年变化 Fig. 1 Annual variations in water environmental factors |
香港牡蛎各组织菌落总数与大肠杆菌的计数结果见图 2。养殖水体与香港牡蛎中各组织菌落总数呈现一致的周年动态变化, 均在2月、8月及10月出现峰值。水环境中菌落总数于2月达到最高(3.9×103 CFU/mL), 同期香港牡蛎各组织中菌落总数也处于较高水平, 最高达2.4×106 CFU/g。大肠杆菌数量在2月与9月均出现同步高峰, 其中水环境中大肠杆菌数在4月最高, 为2.8×102 CFU/mL, 而香港牡蛎中则在9月达到最大值, 为6.3×104 CFU/g。
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| 图 2 水环境和香港牡蛎各组织菌落总数和大肠杆菌含量周年变化 Fig. 2 Annual changes in total viable count and Escherichia coli in water and Crassostrea hongkongensis |
在不同组织中, 外套膜和鳃中的菌落总数显著高于其他组织。在大肠杆菌污染较为严重的1月、2月和9月, 消化腺与外套膜中大肠杆菌富集尤为明显, 其含量分别达3.3×104 CFU/g与3.9×104 CFU/g; 至9月, 外套膜中大肠杆菌含量进一步升高至6.3×104 CFU/g。
2.3 副溶血弧菌和创伤弧菌含量周年变化根据图 3所示, 水环境及香港牡蛎中的副溶血弧菌和创伤弧菌均呈现一致的周年变化规律。副溶血弧菌在两者中均于2月、3月和8月出现较高菌数, 水环境中分别为2.6×102、3.8×102和3.4×102 CFU/mL, 香港牡蛎中同期分别为2.4×104、1.5×104和2.9×104 CFU/g。创伤弧菌则在2月和8月均出现峰值, 水环境中分别为1.0×102和79 CFU/mL, 香港牡蛎中分别为5.1×104 CFU/g和6.1×104 CFU/g。
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| 图 3 水环境和香港牡蛎各组织副溶血弧菌和创伤弧菌含量周年变化 Fig. 3 Annual changes in Vibrio parahaemolyticus and V. vulnificus in water and Crassostrea hongkongensis |
对不同组织分析发现, 香港牡蛎中副溶血弧菌含量于2月、8月和11月出现3个峰值, 其中鳃和消化腺含量较高, 最高浓度分别为2.4×104、2.9×104和1.1×104 CFU/g。创伤弧菌在5种组织中呈无规则波动, 其鳃组织中浓度普遍高于其他组织。
2.4 沙门氏菌和单增李斯特氏菌含量周年变化如图 4所示, 水环境中沙门氏菌在7月和10月出现两个明显峰值, 数量分别为33和23 CFU/mL; 香港牡蛎中该菌仅在7月和10月被检出, 含量分别为2.3×103和2.1×104 CFU/g。水环境中单增李斯特氏菌于2月和10月出现峰值, 浓度分别为5.7×102和5.2×102 CFU/mL; 在香港牡蛎中, 其峰值出现在2月和8月, 浓度分别为1.4×105和1.3×105 CFU/g。
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| 图 4 水环境和香港牡蛎各组织沙门氏菌和单增李斯特氏菌含量周年变化 Fig. 4 Annual changes in Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in water and Crassostrea hongkongensis |
组织分布分析表明, 沙门氏菌仅见于鳃和消化腺中, 且仅在7月和9月中被检测出; 单增李斯特氏菌则在消化腺、外套膜和鳃中均有较高富集, 其中2月消化腺中浓度达1.4×105 CFU/g, 8月外套膜中为1.3×105 CFU/g, 11月鳃中为9.0×104 CFU/g。
2.5 食源性致病菌含量与环境因素相关性养殖水体中5种食源性细菌的含量与盐度、pH呈正相关, 而与温度、叶绿素a浓度呈负相关性(图 5a)。香港牡蛎各组织中食源性细菌含量与环境因子的相关性见图 5b~5f。结果显示, 除生殖腺外, 副溶血弧菌和创伤弧菌在其他各组织中均与温度呈正相关, 而与盐度在所有组织中均呈负相关, 与叶绿素a浓度则呈正相关。大肠杆菌含量在外套膜、鳃和生殖腺中与叶绿素a呈正相关, 在闭壳肌、消化腺和生殖腺中与温度呈负相关。各组织中的沙门氏菌含量与溶解氧呈负相关, 其中在鳃、闭壳肌和外套膜中的相关性显著(P < 0.05)。单增李斯特氏菌含量在鳃组织中与pH呈显著负相关(P < 0.05), 在性腺中则与pH呈显著正相关(P < 0.05)。
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| 图 5 食源性致病菌含量与环境因子相关性热图 Fig. 5 Heat map of the correlation between foodborne pathogens and environmental factors *. 0.05水平差异显著; **. 0.01水平差异显著; TBC. 菌落总数; DO. 溶解氧; Chl a. 叶绿素a; S. 盐度; T. 温度 |
本研究对海南养殖区香港牡蛎不同组织及养殖水体中细菌总数与常见食源性致病菌进行了周年监测。结果表明, 该区域香港牡蛎组织中菌落总数周年平均值为1.1×10⁶ CFU/g, 高于大长山岛虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)组织最高值(1.2×105 CFU/g)及菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)的相应数值(3.5×105 CFU/g)[19-20]。牡蛎体内致病菌丰度与水体菌群均呈现显著季节性波动, 二者在2—4月(春季)和8—10月(秋季)出现峰值。春季水温稳定处于20~ 25 ℃ (为细菌最适生长温度范围), 盐度波动小, 温盐协同效应促进了病原菌的富集, 与“水温超过20 ℃时弧菌属食源性疾病发病率显著上升”的已有结论一致[21]。秋季水温达全年最高(28~32 ℃), 与牡蛎中创伤弧菌和副溶血弧菌密度呈显著正相关, 符合美洲牡蛎中弧菌密度与水温关系的报道[22]。此外, 印度在6月份或季风初期由牡蛎中副溶血弧菌引发的感染率较高[23], 中国上海牡蛎样本中细菌多样性在秋季达到最高[24], 均与本研究中致病菌的季节性变化趋势高度吻合。上述结果提示, 不同地理区域食源性致病菌的流行可能受相似的共性驱动机制影响。
单增李斯特氏菌的周年变化呈现显著的温度依赖性, 在秋、冬及初春等低温季节具有较高的检出率和生物载量。这一分布规律与其嗜冷特性一致。有关研究表明该菌在低温条件下能够维持代谢活性并缓慢增殖, 从而在冷水期的海区及牡蛎组织中持续存在[25]。陆源输入(如农业与城市径流)可能是该菌传入近岸牡蛎养殖区的重要途径, 而其在低温海水中的较强存活能力进一步促进了在牡蛎体内的季节性积累[26]。相比之下, 沙门氏菌在全年监测中均未稳定检出, 表明其在该环境中难以持续定殖。作为温血动物肠道特异性寄生菌, 沙门氏菌对高盐、营养有限且微生物竞争激烈的海洋环境中适应能力较差, 存活周期较短[27]。尽管降雨径流或污水排放可能将其偶然引入养殖水体, 但其在牡蛎体内或水体中难以形成稳定群落, 因此在周年尺度上表现为“未检出”或极低污染水平。
3.2 牡蛎食源性致病菌组织差异性分析对香港牡蛎不同组织中食源性致病菌的分布特征进行分析, 结果显示鳃和外套膜中的致病菌含量显著高于其他组织, 而性腺中含量最低。该分布特征可从摄食行为与组织结构两方面解释: 作为滤食性贝类, 香港牡蛎每小时可过滤约10 L海水, 导致水体中致病菌(大肠杆菌、弧菌属)在其体内富集[28], 其中鳃和外套膜直接暴露于水体, 更易成为微生物定殖的高风险区域。鳃丝的分支结构和外套膜的褶皱形态显著增大了表面积, 有利于微生物吸附[29]。相比之下, 性腺组织可分泌抗菌肽, 其抗菌活性显著高于其他组织, 这可能是该部位致病菌含量较低的主要原因[30]。此外, 本研究还发现大肠杆菌和沙门氏菌在消化腺中积累量最高, 与美国食源性疾病报告中“沙门氏菌易通过肠道黏膜黏附增殖”的结论一致[31]。上述结果说明, 牡蛎的组织结构与免疫功能共同调控了食源性致病菌的分布, 为靶向净化技术的开发提供了理论依据。
3.3 养殖水体及牡蛎食源性致病菌含量环境相关性分析本研究观察到, 养殖水体中食源致病菌的丰度与水温呈弱负相关性, 这与前人报道的贝类养殖水体中弧菌等含量变化规律不一致[6, 10, 19]。一方面现有报道多聚焦于温带海域, 其水温季节性变动较为明显; 而本研究海区属热带, 其最低水温依然保持20 ℃左右, 依然为弧菌等食源性病原菌的适宜生长温度范围。另一方面采样水域的盐度、叶绿素a浓度等关键环境因子易受极端天气事件(台风及暴雨导致的陆源水源输入等)驱动而呈现短期剧烈波动, 这些环境变化可能掩盖了水温对食源致病菌的正向促进作用。
双壳贝类体内食源性细菌的丰度受水温、盐度等环境因子的调控[32-34]。本研究结果显示, 环境因子与香港牡蛎组织中食源性细菌含量之间存在一定弱相关性。香港牡蛎鳃和外套膜中的大肠杆菌、创伤弧菌和副溶血弧菌含量与水温及叶绿素a浓度呈正相关。温度对细菌增殖具有显著促进作用, 在一定范围内, 较高温度可提高菌落总数, 并增强双壳贝类的滤食速率, 从而更易富集食源性细菌[32-35]。本研究亦发现, 除性腺组织外, 创伤弧菌和副溶血弧菌在其他组织中均与水温呈正相关。然而, 消化腺中大肠杆菌与水温呈显著负相关, 这可能与肠道菌群的缓冲作用有关。作为宿主微生物的主要定殖部位, 消化腺内菌群结构复杂(包括细菌、真菌和噬菌体), 其代谢活动及生态位竞争可能削弱温度对大肠杆菌种群动态的直接影响[36]。
外套膜中大肠杆菌及弧菌浓度均与叶绿素a呈正相关, 这可能与陆源营养输入有关。海南雨季频繁, 陆地径流携带大量营养物质刺激水体中微藻生长的同时, 也携带有大量病原菌, 从而间接导致细菌与叶绿素a水平呈正相关[37]。在本实验中, 未发现创伤弧菌和副溶血弧菌与pH、盐度存在显著相关性, 这可能与弧菌的生长特性及多因子互作有关。弧菌的最适生长往往依赖于温度、pH、盐度等环境因子的协同调控, 单一因子的影响可能不足以引起显著响应[38]。其最适生长条件取决于温度、pH、盐度等环境应激因协同作用, 因此单一因子难以引起显著响应。尽管沙门氏菌仅在个别月份被检出, 但其含量与溶解氧呈显著负相关, 符合兼性厌氧的特性[39], 这也解释了其在消化腺中检出率较高, 而在其他组织中未检出的现象。
3.4 牡蛎食源性致病菌含量与致病剂量的综合评估本研究系统分析了香港牡蛎不同组织(外套膜、闭壳肌、鳃、消化腺、性腺)中5种常见食源性致病菌的污染水平。创伤弧菌与大肠杆菌在闭壳肌等可食部位中含量虽低, 但由于其感染剂量极低(可低至数十至数百个菌体), 在生食条件下仍对易感人群构成较高的侵袭性感染风险[40-41]。因此, 对此类高毒力病原体需采取接近“零容忍”的严格管控策略。副溶血弧菌在整体样本中浓度较高, 且牡蛎中的总菌量常超过其致病阈值(本研究香港牡蛎最高浓度为2.9× 104 CFU/g)[42], 在生食或加热不充分时具有明确的急性肠胃炎风险。单增生李斯特氏菌对高危人群的感染剂量较低(102~103 CFU)[43], 且该菌可在冷藏条件下持续存活并缓慢增殖[25], 因此在储藏与流通过程中风险可能进一步累积, 提示必须加强食用前的热处理。沙门氏菌的感染剂量范围较宽(104~108 CFU)[45], 本研究中其平均浓度虽未达高风险水平, 但其在牡蛎组织中的持续存活仍提示存在潜在的交叉污染与季节性暴发风险。
4 结论综上所述, 海南养殖海区香港牡蛎及其养殖水体中菌落总数、大肠杆菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和单增李斯特氏菌含量均表现出明显的季节性波动。养殖水体与牡蛎各组织的菌群变动规律较为一致, 分别在2—3月(春季)和8—10月(秋季)出现两个含量高峰。水体环境因子, 如溶解氧、水温、盐度、叶绿素a等, 与多种食源性致病菌之间存在相关性。由于2—3月食源性细菌含量高峰期与海南香港牡蛎上市期(每年10月至次年4月)重叠, 且所测组织中食源性细菌含量均超过其感染剂量。因此, 建议在食用时避免生食或未彻底煮熟, 并高度重视该时期的病原菌感染风险。
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