2025, Vol. 49
文章信息
- 陈思奇, 蔡奕彦, 张程, 毕燕会, 周志刚. 2025.
- CHEN Siqi, CAI Yiyan, ZHANG Cheng, BI Yanhui, ZHOU Zhigang. 2025.
- 利用荧光原位杂交技术在海带伸展的DNA纤维上刻画45S rRNA基因的高分辨率可视图谱
- High-resolution visual mapping of 45S rRNA genes by fluorescence in situ hybridization of the extended DNA fibers in Saccharina japonica
- 海洋科学, 49(11): 97-105
- Marine Sciences, 49(11): 97-105.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250917002
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文章历史
- 收稿日期：2025-09-17
- 修回日期：2025-10-06
2. 上海海洋大学 国家海洋生物科学国际联合研究中心, 上海 201306
2. Shanghai Ocean University, International Joint Research Center for Marine Biology, Shanghai 201306, China
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是基于放射性原位杂交的原理与方法[1-2]率先在丝光短膜虫(Crithidia luciliae)等动物研究中建立和开发出来的[3]; FISH技术先利用荧光素取代同位素标记的核酸探针对载玻片上处于有丝分裂中期或间期的染色体或DNA纤维(fiber)进行分子杂交, 再经荧光显微系统对目标DNA进行定性、定量和定位等分析[4-5]。
有丝分裂中期核的染色体因制备简单, 是FISH分析的首选材料; 但中期染色体的结构极端固缩(condensation), 即由串珠状的核小体(nucleosome)经逐级压缩分别形成螺线管、超螺线管后而经染色可显微观察到的特定形式染色质[6], 使FISH分析的空间分辨率(resolution, 即能分辨相邻两位点杂交信号之间核苷酸序列的最短长度)较低, 多在1~5 Mb[7-9]。相比较而言, 有丝分裂的间期核, 因染色质固缩程度低, 其分辨率虽可提高到50~100 kb[4, 10], 但这以牺牲有形染色体的个体分辨为代价[8], 难以用于染色体精准定位等分析。然而, 处于减数分裂粗线期(pachytene)的染色质却易于分辨个体, 且大小约是中期核相应染色体的10~40倍[8, 11], 因而固缩程度明显降低, FISH分辨率可达到几kb[12]甚至约100 kb[13]; 但在发育过程中, 粗线期所持续的时间短暂, 因而难以从待检测的物种中获得理想的样品[8, 11], 导致在FISH的应用研究中受限。
对于固缩程度较低的间期染色体, 人们尝试利用化学[14-15]或物理[16]等方法使染色质伸展并释放出来DNA, 便于探针或检测试剂可及靶标DNA以完成分子杂交, 从而建立了DNA的纤维-FISH技术[17-18]。该技术的运用极大地提高了FISH技术的分辨率。例如, 在拟南芥(Arabidopsis thaliana)的rRNA基因研究中, 分辨率达3.27 kb[19]; 而对水稻(Oryza sativa)纤维-FISH分析的平均分辨率也达到3.21 kb[20]; 这些数值非常接近Watson和Crick[21]所建立的DNA双螺旋模型中B-构型的长度估计值(2.97 kb/μm)。除了拟南芥, 纤维-FISH技术还用于水稻[22]、吊兰属(Chlorophytum Ker-Gawl)[23]、辣椒属(Capsicum Linn.)[24]、棉属(Gossypium Linn.)[25]、木本苜蓿(Medicago arborea)[26]以及猕猴桃属(Actinidia Lindl.)[27]等高等植物5S或45S rRNA基因的高分辨率物理图谱构建和比较等研究中, 但至今未见藻类细胞遗传学中有类似的研究报道。
鉴于DNA纤维-FISH技术的高分辨率, 为了将该技术运用到藻类的相关研究领域, 在掌握海带(Saccharina japonica)染色体FISH技术[28]、45S rRNA基因结构[29]并对含有海带45S rRNA基因序列的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)克隆进行序列分析[30]等基础上, 本研究拟利用18S rDNA作为探针首先对海带BAC克隆的质粒DNA分子进行FISH分析, 以建立纤维-FISH技术体系; 然后分离海带细胞核并优化DNA纤维的制备方法, 再利用18S rDNA探针对伸展的DNA纤维进行分子杂交; FISH图谱的比较分析结果表明, 我们已成功运用纤维-FISH技术可视化海带45S rDNA的高分辨率物理图谱。本研究也是纤维-FISH技术在藻类分子细胞遗传学应用研究的首次报道。本研究所获得的海带45S rDNA高分辨率物理图谱为其基因组的正确组装提供了重要的细胞学证据, 也可供其他藻类基因组中串联重复序列及多拷贝基因等组装参考。
1 材料与方法 1.1 生物材料及培养本研究以海带配子体为研究对象, 将配子体接种于PES培养基[31]中, 按已报道的方法[32], 在温度为(17±1) ℃、光周期为12L∶12D(光/暗)、光照强度为30 μmol photons/(m2⋅s)的条件下培养。每两周更换一次新鲜培养基。
将Liu等[30]筛选到含海带45S rDNA序列的BAC克隆(编号为625-E18)菌株接种于含12.5 μg/mL氯霉素的LB液体培养基中, 在37 ℃摇床中, 以220 r/min的转速过夜振荡培养。
将携带目的基因克隆的大肠杆菌(Escherichia coli)接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中, 在37 ℃摇床中, 以220 r/min的转速振荡培养3~6 h。
1.2 18S rRNA基因克隆与探针制备根据海带18S rRNA基因(GenBank登录号: EU293553.1)的序列设计一对引物: 18S-1F(5′-AGAAA CGGCTACCACATC-3′)和18S-1R(5′-GGACATCTAAG GGCATCAC-3′), 使用DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)从经5 000 r/min转速离心收集的新鲜海带配子体中提取基因组DNA并作为模板, 进行PCR扩增。25 μL反应体系包含: 12.5 μL PCR预混液(生工生物工程(上海)股份有限公司), 上、下游引物各1 μL, 1 μL模板DNA以及9.5 μL无菌去离子水。扩增程序如下: 94 ℃预变性3 min, 紧接着按照94 ℃变性45 s、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸1.5 min的程序进行30个循环, 最后72 ℃延伸10 min。
扩增产物经过1.0%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离后进行DNA回收, 再使用UNIQ-10柱式DNA凝胶提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)并按照其操作步骤纯化目标片段DNA。在16 ℃条件下连接过夜, 然后将纯化后的PCR产物连接到pMDTM19-T载体; 连接反应体系包含: 4 μL纯化的PCR产物, 1 μL pMDTM19-T载体及5 μL Solution I(TaKaRa公司, 日本东京)。
取上述连接产物, 加入100 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞(生工生物工程(上海)股份有限公司); 于42 ℃热激90 s、再冰浴1 min后, 加入890 μL的LB液体培养基, 振荡培养3~6 h。将转化的菌液涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL异丙基硫代-β-D-半乳糖苷和20 μg/mL的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的LB琼脂平板上进行蓝白斑筛选; 并利用上述18S rDNA序列克隆同样的PCR反应对菌液经鉴定后, 将阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列分析。
在4 ℃下、以8 000 r/min的转速离心5 min收集菌体, 利用质粒DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取携带18S rDNA序列的重组质粒。利用FISH TagTM DNA多色试剂盒(Thermo公司, 美国沃尔瑟姆)并按照其操作指南, 用Alexa FluorTM Red-5-dUTP(PerkinElmer公司, 美国波士顿)对18S rDNA探针进行标记。将标记后的探针保存于−20 ℃冰箱, 用于后续的FISH实验。
1.3 BAC质粒提取携带目的序列BAC克隆的菌株经培养后, 上述同样条件下离心收集菌体; 利用OMEGA公司生产的BAC质粒DNA提取试剂盒(飞扬生物工程(广州)有限公司)并按照其操作指南自625-E18号BAC克隆中提取质粒DNA。用20~50 μL无菌去离子水收集BAC质粒, 运用NanoDrop 2000c紫外分光光度计(Thermo公司, 美国Rockford)测定OD260 nm与OD280 nm的比值并计算质粒浓度, 于−20 ℃冰箱中保存备用。
1.4 海带配子体细胞核提取对Zhao等[27]的方法稍作修改以提取海带配子体处于分裂间期的细胞核。将离心收集的2 g(湿质量)海带配子体, 在液氮中研磨成粉末; 加入1 mL于4 ℃冰箱中预冷的核分离缓冲液(含10 mmol/L MgSO4、5 mmol/L KCl、0.5 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、1 mg/mL二硫苏糖醇和0.25% (w/v) Triton X-100), 轻轻混匀后冰上放置5 min; 悬浮液用20 μm滤膜过滤2次, 在滤液中加入1 mL核分离缓冲液; 滤液在4 ℃下、以12 000 r/min转速离心1 min, 弃上清; 将沉淀的核团重悬于核储存缓冲液(即在核分离缓冲液中加入等体积甘油), 保存于−20 ℃冰箱中备用。
1.5 BAC质粒涂片及DNA纤维的制备参照Jackson等[33]的方法稍作修改来制备BAC质粒涂片。将40~80 ng的BAC质粒悬浮于20 μL的甘油溶液(含1%对苯二胺、15 mmol/L NaCl、1 mmol/L H2PO4和90%甘油, pH 8.0)中; 吸取20 μL质粒溶液至多聚赖氨酸载玻片中部, 并用移液器吸头轻轻涂抹均匀; 室温下干燥10 min后, 在质粒涂抹处滴加50 μL卡诺氏固定液(乙醇∶乙酸=3∶1)固定3 min; 风干后于55 ℃处理30 min以烤片, 用于后续FISH实验。
参照Wang等[25]的方法并稍作修改以制备BAC质粒的DNA纤维。用无菌去离子水将提取的BAC质粒稀释至40 ng/μL, 在多聚赖氨酸载玻片上滴加10 μL; 静置10 min至半干状态, 加5 μL无菌去离子水后, 使用塑料盖玻片缓慢平移, 拉伸BAC质粒DNA的纤维; 风干后滴加100 μL卡诺氏固定液固定5 min; 用无水乙醇洗涤2~3次, 风干后放入55 ℃烘箱中预变性1 d, 以备后续FISH实验。
参照Zhong等[12]的方法, 用磷酸缓冲液洗涤上述制备而储存的海带细胞核, 然后在4 ℃条件下、以8 000 r/min的转速离心5 min, 再用核储存缓冲液重悬细胞核; 吸取1~2 μL细胞核悬浮液置多聚赖氨酸载玻片的一端, 用移液器吸头将细胞核涂抹成均匀的线状, 在室温下自然晾至半干状态。加入10~20 μL细胞核裂解液(含0.5% SDS、100 mmol/L Tris-HCl和50 mmol/L EDTA, pH 7.0)并孵育4、6、8或10 min, 使用载玻片前端引流法[33](即将塑料盖玻片一端与液滴接触但不触碰载玻片, 缓慢匀速拖动液体至另一端, 用吸水纸吸取末端多余水分以便风干)或重力自然拉伸法[12, 19, 34](即轻轻倾斜载玻片, 将上端的液滴大约倾斜至15°~45°, 小心地将液滴移过载玻片表面, 从而将DNA拉伸成的一条长流状的纤维)以制备海带细胞核DNA的纤维。然后按BAC质粒DNA纤维的同样处理方式进行风干、固定及洗涤, 并在55 ℃烘箱中烤片30 min, 以备FISH实验。
1.6 FISH实验与显微拍照参照Liu等[30]的方法, 将涂抹BAC质粒的载玻片在紫外交联剂中交联2~3次, 然后在质粒涂抹处滴加10 μL于95 ℃预变性的杂交液, 该杂交液包括1 μL已标记的18S rDNA探针和9 μL的2×SSC和1×TE缓冲液(含3 mol/L NaCl、0.3 mol/L柠檬酸二钠、10 mmol/L Tris和1 mmol/L EDTA, pH 8.0)。盖上塑料盖玻片后, 将装片先在100 ℃中水浴5 min, 再放至55 ℃烤箱中杂交过夜。然后, 用2×SSC缓冲液洗涤2~3次以去除盖玻片, 将载玻片浸泡于装有去离子水的染色缸中, 上下颠倒1~2次; 干燥后, 加入20 μL的4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液; 避光孵育20 min后, 在荧光显微镜下观察。
海带基因组DNA纤维的FISH方法基本同上, 但在滴加18S rDNA探针杂交液后, 载玻片使用85 ℃水浴锅变性5 min。
使用Leica公司生产的DM4000型荧光显微镜(德国Wetzlar)和数码相机DFC550(瑞士Heerbrugg)拍摄图像。在612 nm和495 nm的发射波长处分别检测到Alexa Fluor Red-5-dUTP(红色)和DAPI(蓝色)2种荧光信号。使用Adobe Photo Shop CS 6.0处理图像, 使之颜色对比度恰当、亮度均匀。
1.7 纤维-FISH图谱分辨率的估算以18S rDNA序列作为查询对象, 在已公布的海带雄配子体基因组[35-36]及海带雌性孢子体基因组[37]中搜索, 以获得45S rRNA基因拷贝数及其平均长度等信息。在纤维-FISH图谱上计数杂交信号数并测量之间的距离(μm), 根据海带45S rDNA的平均长度, 计算分辨率, 即杂交信号数×平均长度(kb)/杂交信号之间的距离(μm)。
2 结果与分析 2.1 18S rDNA在海带BAC质粒及其DNA纤维上的FISH定位通过对BAC克隆625-E18中的质粒进行DNA序列分析, 可知海带45S rDNA的总长8 995 bp, 它由5 420 bp长的18S-5.8S-25S rDNA和3 575 bp长度可变的基因间隔区(IGS)组成[30]。尽管Liu等[30]用了二代测序技术, 但可能因拼接等问题, 最终也只获得3个45S rDNA的重复转录单元序列。若利用18S rDNA作为探针, 对该BAC质粒进行FISH分析, 理应至少显示3个荧光信号点; 但在BAC质粒的FISH图谱上却出现一段难以分辨信号点的区域(图 1左)。
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| 图 1 以海带18S rDNA作为探针对自BAC克隆625-E18中分离的质粒(左)及其伸展的DNA纤维(右)进行FISH分析 Fig. 1 FISH of Saccharina japonica 18S rDNA as a probe to an isolated plasmid (left) and its extended fiber (right) obtained from the BAC clone 625-E18 注: 圆圈指18S rDNA的杂交信号区域, 箭号指18S rDNA的杂交信号点 |
按照Wang等[25]的操作方法, 将分离获得的BAC质粒分子进行伸展以获得DNA纤维后再进行FISH分析, 可观察到8个呈串珠状且易于辨别的杂交信号(图 1右)。Liu等[30]对BAC克隆625-E18的质粒经脉冲电泳分析, 可知插入片段长度约95 kb, 再加上质粒pIndioBAC-5的本身长度(约7 kb), 这样该质粒DNA的总长约102 kb; 经DAPI染色后测量可知, 该环形BAC质粒(图 1左)的总长度约21.65 μm, 因而, 可计算出质粒DNA的FISH分辨率约为4.7 kb (=102 kb/21.65 μm)。而本研究所使用的探针长度为1.075 kb, 约是FISH分辨率的1/4, 这样在BAC质粒的FISH图谱(图 1左)上就呈现信号连续分布的区域。但该BAC质粒DNA的分子经纤维-FISH分析(图 1右), 其分辨率约提高至0.9 kb; 此值明显超过Watson和Crick[21]所建立的DNA双螺旋模型中B-构型的长度估计值(2.97 kb/μm), 说明该BAC质粒DNA分子在拉伸后已呈现非正常双螺旋的B-构型结构, 有可能是超伸展的S-构型[38]。
总之, 携带海带45S rDNA的BAC克隆质粒的裸露DNA在拉伸前后(图 1)的比较结果显示, 纤维-FISH技术能使FISH分辨率自4.7 kb提高到至0.9 kb, 因而能获得如图 1右所示可视化的高分辨率物理图谱。
2.2 海带细胞核及其DNA纤维的制备与高等植物的细胞一样, 海带等大型藻类的原生质体外几乎都包裹着或薄或厚细胞壁。而它的存在, 必然阻碍DNA纤维的制备。因此, 在将纤维-FISH引入植物细胞遗传学的研究时, Fransz等[19]认为制备高质量的细胞核是该技术成功应用的先决条件。经研磨、过滤和离心等过程, 自2 g鲜质量的海带配子体中获得约1.2×107个细胞核。随机对部分圆形细胞核(图 2)进行显微测量, 可知它们的直径是(4.43± 0.09)μm(n=95)。该结果与郑倩等[39]所观察到的细胞核形态结果一致, 也与海带属其他物种配子体的细胞核大小(多在3.5~5 μm范围内)[40-42]相吻合。这些结果表明, 分离得到的这些海带细胞核可作为后续实验的材料。
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| 图 2 自海带配子体中分离的细胞核的显微形态 Fig. 2 Microscopy images presenting the morphology of the nuclei isolated from the gametophytes of Saccharina japonica 注: 箭号指圆形的海带细胞核 |
细胞核的裂解时间是DNA纤维制备中最为关键的一步[27, 34]。为此, 本研究在预实验的基础上设置4、6、8和10 min等4个不同的孵育时间, 通过检查DNA纤维的数目与质量来确定适用于海带DNA纤维制备的细胞核裂解时间。结果(图 3左)显示: 经4 min裂解, 在一个视野下可以得到多条DNA纤维, 但这些纤维之间常常交叉, 且在载波片上能明显观察到未被裂解的细胞核, 这表明裂解时间较短以致细胞核裂解不充分, DNA分子未能充分释放而被拉伸; 当裂解6 min时, 获得的DNA纤维连续且平滑, 且与4 min的结果相比, DNA纤维数量较多, 交叉现象明显减少; 经8 min裂解, 获得的DNA纤维数目与6 min的相差不明显, 但DNA纤维出现断裂现象, 这可能是由于裂解时间的延长, 导致DNA分子的化学损伤[43], 因而在拉伸过程中容易断裂; 当裂解时间延长至10 min时, DNA纤维因损伤加剧而断裂得更明显, 以致纤维数量明显降低。综上, 裂解时间为4~8 min的范围较易获得平滑、少交叉和少断裂的DNA纤维, 其中, 6 min是从海带细胞核中获得较高质量DNA纤维的最适宜裂解时间(图 3左)。
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| 图 3 酶解时间(左)及伸展方法(右)对海带基因组DNA纤维制备的影响 Fig. 3 Effects of incubation time (left) and extension protocol (right) on the preparation of genomic DNA fibers in Saccharina japonica |
为了优化海带DNA纤维的制备方法, 本研究选用重力自然拉伸法[12, 19, 34]与载玻片前端引流法[33]这2种常用的DNA纤维拉伸方法来进行对比分析。其中, 重力自然拉伸法制备的海带DNA纤维数目少且分布不均匀(图 3右上), 同时, DNA纤维还出现重叠现象, 这可能是由于液体表面张力的作用, 使携带DNA纤维的液滴在下滑过程中因曲折前进而造成的[44]; 而载玻片前端引流法却能够消除这种液体表面张力的影响, 所制备的DNA纤维数目多且分布均匀, 很少出现重叠和交叉现象(图 3右下)。因此, 本研究选择前端引流法来制备海带的DNA纤维。
2.3 使用纤维-FISH技术展示海带45S rDNA的高分辨率物理图谱利用上述优化的方法, 即使用核裂解液对分离的海带细胞核处理6 min, 再利用载玻片前端引流法来制备海带DNA纤维。然后利用荧光标记的海带18S rDNA探针, 对制备的海带DNA纤维进行FISH分析。在94.6 μm长的海带DNA纤维上共检测到22个荧光信号(图 4箭号所指); 值得注意的是, 图 4中还有许多荧光信号, 因它们不位于DAPI负染的DNA纤维上, 应属于噪点, 这在纤维-FISH图谱上是常见的现象[19-20, 27]。而在另一条DNA纤维(长度为128 μm)上也检测到25个杂交信号(未提供图谱)。这些结果不仅说明本研究的纤维-FISH结果是可重复的, 也表明利用优化的方法所建立的纤维-FISH技术平台, 可用于海带细胞遗传学的研究。
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| 图 4 基于建立和优化的纤维-FISH方案在海带伸展的DNA纤维上定位18S rDNA Fig. 4 Localization of 18S rDNA on the extended fibers of Saccharina japonica DNA based on an established and optimized fiber-FISH protocol |
Liu等[30]对BAC克隆625-E18插入片段的序列分析结果显示: 3个重复的18S rDNA分别位于6 122~ 7 836 bp、15 117~16 831 bp和21 558~23 272 bp, 由于最后一段45S rDNA基因并不完整, 这样45S rDNA两个单元长度依次为8 998 bp和9 008 bp, 平均单元长度为9 003 bp。在Ye等[35]以及Guo等[36]所组装的雄配子体基因组数据中进行搜索, 发现45S rDNA的序列几乎未组装到相应的染色体上。但在Li等[37]发表的海带雌性孢子体基因组的数据中, 共搜索到32个重复单元的45S rDNA, 平均单元长为9 005 bp, 这与BAC克隆625-E18插入片段的序列分析结果[30]相吻合。因此, 本研究就以9 005 bp来计算45S rDNA的纤维-FISH分辨率, 结果即2.09 kb(=9 005 bp× 22/94.6 μm)。这个数值与高等植物纤维-FISH的分辨率多在3 kb左右的结果相近[8-9]。
3 讨论本研究在分离到高质量细胞核(图 2)的基础上, 通过核裂解时间及DNA纤维制备方法的优化(图 3), 在海带中建立了DNA纤维-FISH技术体系, 并用此技术展示了海带45S rDNA可视化的高分辨率物理图谱(图 4), 这也是纤维-FISH技术在藻类细胞遗传学研究领域应用的首次报道。
Liu等[30]对BAC克隆625-E18的质粒经DNA序列分析, 揭示海带与高等植物45S rRNA的基因[45]一样, 它的一个完整单元也是由18S、5.8S和25S等rDNA以及IGS和内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)组成, 在基因组中这样的单元是以“头-尾”形式串联重复[30, 37]。本研究只以18S rDNA中的1 075 bp为探针来进行FISH分析, 由于IGS序列的长度可变, 这样相邻两个杂交信号之间就出现3 714~7 289 bp不等的间隔, 因而无论在BAC克隆质粒DNA纤维-FISH图谱(图 1)还是海带细胞核DNA纤维-FISH图谱(图 4)上均呈现“串珠状”分布。这与高等植物45S rDNA的纤维-FISH图谱结果[19, 23-24, 26-27]一致。本研究用可视化的图谱展现了海带45S rRNA的基因是以串联重复形式分布在染色体上, 为Li等[37]所组装的海带45S rDNA序列提供了可视化的细胞学证据。由此可见, 纤维-FISH是展示串联重复序列及多拷贝基因等在海带等藻类染色体上高分辨空间布局的强有力工具。
从海带BAC克隆625-E18质粒的测序结果[30]以及海带雌性孢子体基因组的数据[36]分析中发现, 45S rDNA的平均长度在8 995~9 005 bp之间, 因而, 在海带DNA的纤维-FISH图谱中理论上不会产生明显的视觉差异。但在图 4上, 杂交信号的亮度和间距并非那么一致, 这得从染色体的空间结构来分析其原因。构成染色质的核小体是由8个组蛋白组成的八聚体, 外被147 bp长的双螺旋DNA以左旋方式缠绕1.75圈[46-47]; 相邻两个核小体靠10~90 bp长的连接体DNA连接, 从而形成直径约11 nm的染色质纤维[46]; 在连接组蛋白H1或H5的作用下, 使染色质纤维进一步折叠, 此时折叠而成的超螺线管的直径约为30 nm[48]。本研究当利用核裂解液处理海带细胞核时, 这些组蛋白有可能未被完全处理而存留下来, 这样, DNA纤维的固缩程度在不同区域就不同, 因此在拉伸后再进行FISH分析时, 信号点的间距就有差异; 同时, 探针可及靶DNA的程度也不一样, 因而信号强度也不同。另外, 本研究使用前端引流法来拉伸DNA纤维, 操作者难以保持均匀的速度来拉伸, 也会导致不等间距的杂交信号。这最后一点从BAC质粒DNA纤维-FISH图谱(图 1右)中段Ⅰ、段Ⅱ和段Ⅲ之间的距离就可以推测到, 因为它的DNA几乎是裸露的, 不会因组蛋白没有解离而产生影响。
从本研究所提供的BAC质粒DNA分子或海带DNA纤维来看, 目前还无法分辨它们是否来自单个质粒或单条染色质丝。若同时利用双色FISH技术, 如将不同荧光标记至BAC质粒或海带端粒序列上, 这样就可以利用纤维-FISH图谱的杂交信号来判断BAC克隆625-E18的质粒中携带几个重复单元的45S rDNA; 也有利于了解海带DNA纤维上的这些杂交信号是否位于单条染色质丝上, 从而有助于科学回答海带45S rDNA是位于1条染色体[29]还是3条染色体上[37]这个问题。
4 结论本研究在海带配子体细胞核分离的基础上, 通过细胞核裂解时间及DNA纤维制备方法的优化, 利用18S rDNA探针对伸展的核DNA纤维进行FISH分析, 在藻类细胞遗传学领域首次建立纤维-FISH技术体系, 并绘制出海带45S rDNA首张高分辨率物理图谱, 将FISH技术的分辨率提高至2.09 kb。本研究表明, 纤维-FISH技术是海带基因组精细作图、染色体结构解析及比较基因组学等研究的可靠工具。
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