2025, Vol. 49
文章信息
- 郑丽华, 韩笑天, 徐秀丽. 2025.
- ZHENG Lihua, HAN Xiaotian, XU Xiuli. 2025.
- 催化报告沉积-荧光原位杂交CARD-FISH技术在有害藻华研究中的应用前景及与主流分子检测技术的比较
- Application prospects of catalyzed reporter deposition-fluorescence in situ hybridization in the research of harmful algal blooms and comparison with mainstream molecular detection techniques
- 海洋科学, 49(12): 81-91
- Marine Sciences, 49(12): 81-91.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250725001
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文章历史
- 收稿日期：2025-07-25
- 修回日期：2025-10-24
2. 中国科学院海洋研究所, 长江口海洋生态系统研究站, 山东 青岛 266000
2. Yangtze Estuary Marine Ecosystem Research Station, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266000, China
微藻、浮游植物和细菌在一定条件下大量聚集爆发形成有害藻华(Harmful Algal Blooms, HABs)[1], 不同物种引起的藻华现象不同, 如米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)藻华呈现红色, 抑食金球藻(Aureococcus anophageffereus)藻华呈现褐色, 微球藻(Nannochloris sp.)藻华呈现绿色[2]。许多引发藻华的藻种会产生藻毒素, 影响水生动物的生存甚至致其死亡。藻华的暴发不仅是“绿水”“红水”的视觉污染, 更是一种复杂的生态灾难信号, 对海洋生态系统构成威胁, 影响沿海地区经济和公共健康。(20世纪以来随着经济的发展, 赤潮暴发呈逐渐增加的态势, 严重影响人类的水产渔业生产活动[3]。要预防和治理赤潮, 首先要清楚暴发赤潮的具体藻种。研究表明, 常见的赤潮藻种类有中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、星脐圆筛藻(Coscinodiscus asteromphalus)、夜光藻(Noctiluca scintillans)、大洋角管藻(Cerataulina pelagica)等[4], 传统的基于显微镜的形态学检测依据微藻特有的结构, 如依据硅藻细胞形态结构及硅质壳的种间特异性花纹来分类硅藻[5]; 甲藻根据细胞的大小、形态、颜色及表面修饰物来分类[6], 但一些细胞形态微小, 或形态相似难以区分不易观察, 检测费时费力需要较强的分类学专业知识, 而且易受研究者经验的影响, 因此检测结果可能稍有偏差[7]。分子生物技术的发展为赤潮藻的鉴定开辟了新道路, 成为构建赤潮藻系统发育树的重要手段。基于DNA的非细胞培养的分子生物学检测, 如高通量测序技术HTS和实时荧光定量PCR被广泛应用, 但是高通量测序技术的检测结果并不是环境中的实际细胞丰度, 目前可以通过分子标签识别结合显微镜荧光技术可以同时解决定性和定量问题, 如FISH方法, 是一种将荧光标记的核苷酸探针与目标细胞中的DNA或RNA结合的技术, 通过观察荧光信号的数量来确定目标序列的位置和数量, 其存在的主要问题是当目标分子的数量有限时, 信号强度有时不够强[8]。CARD-FISH是一种具有酶促信号放大的FISH的改进版本, 适用于低拷贝数的目标分子, 检测灵敏度较高[9]。
近年来有关有害藻华(HABs)的研究多集中于物种组成鉴定和定量方面, 而如何从群落构成的静态描述迈向赤潮爆发的动态过程, 其核心瓶颈在于在自然环境中揭示藻种的状态及种间互作的关系。催化报告沉积-荧光原位杂交(CARD-FISH)技术, 凭借其单细胞水平的高灵敏度与原位可视化能力, 成为破解这一瓶颈的关键手段。本文列举了几种量化赤潮藻的分子生物学技术, 重点阐述CARD-FISH的应用, 最后就CARD-FISH的技术优化和应用潜力提出展望, 为后续研究者提供一些参考与帮助。
1 量化有害微藻的三种主流技术 1.1 高通量测序技术(HTS)高通量测序(HTS), 或称下一代测序(NGS), 以其超高的通量广泛应用于微生物多样性检测[10], 如宏基因组测序, 不仅能识别已知的物种, 还能发现新物种; 16SrRNA基因测序, 是一种特异性测序16SrRNA基因的靶向方法, 侧重于识别和相对定量不同的物种, 以确定样本中不同物种的相对丰度和多样性[10]。乔玲等[11]利用形态学鉴定结合HTS的技术, 共鉴定了8个门, 49个属, 其中仅有5个属为2种方法的共同鉴定结果, 以此更全面地了解海水养殖生态系统中的浮游植物结构及多样性; Zhang等[12]对秦皇岛沿海水域中绿潮区的18SV4区为靶基因进行高通量测序技术分析, 发现微粒真核浮游植物群落具有从硅藻为主到甲藻为主的季节性演替; 宋伦等[13]运用高通量测序技术对黄海北部海域真核微藻粒级结构进行研究, 发现不同季节的不同微粒等级的优势物种, 中粒级的剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)在春季占优势(21.3%), 大粒径的平野亚历山大藻(A. hiranoi)在夏季占优势(23.6%), 大粒径的多纹膝沟藻(Gonyaulax polygramma)在秋季占优势(56.6%); 有研究表明采用direct PCR(dPCR)技术即直接PCR, 省去了传统的DNA提取、纯化和扩增步骤, 节约时间并减少DNA损伤的风险, HTS同时处理大量样本加快数据搜集的速度, 成功在几周内从自然浮游植物群落分离并分类鉴定藻种[14]。HTS能在短时间内对目标DNA分子进行大规模测序获得数据, 但从复杂的环境样本中获取纯净且完整的DNA仍是挑战, 而且包括敏感性、特异性、数据分析的问题依然存在。此外, 根据实验对象选择合适的测序平台也是一个重要的考量因素, 在选择HTS平台时, 在数据读取量和读段长度之间不可避免地存在权衡, 一般来说, 较大的数据通量可以适用于研究复杂的微生物群落, 而较长的读段长度适用于区分相近的物种[15], 因此选择哪种平台高度依赖于研究目的, 基于以上局限性, 该技术的发展仍面临挑战[16]。
1.2 实时荧光定量PCR(qPCR)qPCR是通过荧光嵌入染料或荧光杂交探针对指数增长期实时监测, 再与标准曲线比较, 可以计算样品中最初存在的DNA的含量[17], 原理与标准PCR相同, 关键区别在于对扩增的DNA反应实时监测[18], qPCR可以利用特定的探针和引物定量目的基因的表达水平, 从而间接评估有毒微藻的存在和丰度, 在监测微藻方面显示出极大的应用潜力。Engesmo等[19]利用qPCR对挪威沿岸水域检测, 列举了米氏凯伦藻、有毒卡尔洛藻(Karlodinium veneficum)、赤潮异弯藻和日本纤维囊藻(Fibrocapsa japonica)并与细胞计数比较, 表明了qPCR具有更高的灵敏度和更低的检出限。qPCR不仅可以提供有害藻华的定量信息, 还能利用特定的探针和引物对特定物种进行特异性检测[20], 王蒙[21]开发的米氏凯伦藻qPCR检测方法灵敏度极高, 且通过熔解曲线和自然样本验证(误差率≤18.3%), 符合行业规范(≤20%), 表明该方法具有一定的可靠性。
随着分子生物技术的发展, qPCR技术因其显著优势已成为监测有害藻华的重要工具。它具有极高的灵敏度, 与传统显微镜观察法相比能更早、更准确地预警藻华事件, 而且反应速度快、成本低廉、数据分析简便, 其引物特异性强, 可实现对目标藻种准确的定性和定量分析[22]。然而, 该技术在实际应用中面临一些限制, 虽然在实验室培养藻类的检测中表现出优异的DNA提取效率和定量精度, 但无法区分活细胞与游离DNA的差异, 而且由于海洋微藻中某些功能基因的拷贝数存在高度变异性[23], 所以标准曲线的建立需格外谨慎, qPCR扩增过程中可能出现的属/种水平特异性偏差[24], 必须结合显微镜观察或CARD-FISH等多种研究方法进行验证, 才能确保监测数据的可靠性。
1.3 荧光原位杂交(FISH)FISH是将荧光色素标记的核酸探针与目标细胞中特定的DNA或RNA杂交, 然后在荧光显微镜下进行荧光信号观察的技术。FISH是一个强大的分子生物学鉴定的工具, 可以靶向DNA, 标记基因在染色体的位置, 识别并诊断微生物; 也可以靶向RNA, 从而在原位可视化基因表达[25]。FISH在赤潮藻的鉴定上发挥重要作用, Hosoi-Tanabe等[26]建立的FISH方法, 可实现塔玛亚历山大藻(A. tamarense)与链状亚历山大藻(A. catenella)这两种产麻痹性贝毒藻种的30 s快速鉴别; Chen等[27]为了检测和计数赤潮异弯藻, 用于FISH的rRNA和rDNA靶核苷酸探针一个小时内能够定量和识别生长周期的70%~80%的靶细胞, FISH被证实有望能为赤潮异弯藻进行特异性、快速、精确和定量的检测; Edvardsen等[28]通过斑点印迹杂交实验, 验证了所设计的探针能精准识别产毒鳍藻(Dinophysis)与Phalacroma, 并成功利用FISH监测种群的动态变化。
FISH为监测有害藻华提供了有价值的信息, 能够帮助研究者快速识别和定量赤潮藻的种类和数量, 采取必要治理措施保护公众健康, 这对其预防和治理尤为重要。FISH不仅可以分析在实验室最佳条件下微生物群落结构, 也可以分析复杂环境样品如受污染的地下水、土壤、淤泥等, 是目前研究环境微生物学常用的工具之一, 但由于目标细胞中分子的数量有限, 有时信号强度不够强[29]。
2 催化报告沉积-荧光原位杂交(CARD-FISH)CARD-FISH或称酪胺信号扩增荧光原位杂交(Tyramide signal amplification-FISH, TSA-FISH)是FISH的改良版, 是基于酶促信号放大提高微生物细胞检测的一种技术, 实验原理即辣根过氧化物酶(Horse reddish peroxidase, HRP)标记的探针与目标rRNA或rDNA结合后, 洗去游离的探针, 在HRP的催化作用下, 带有荧光标记的酪胺分子大量快速结合在探针周围, 起到信号放大的作用, 同时减少背景荧光, 增强在显微镜下的可见性[30]。Dijk等[31]使用2种寡核苷酸探针对脱卤球虫(Dehalococcoides)进行定量检测, 发现尽管FISH使用更高浓度的探针和持续更久的曝光时间, 但CARD-FISH产生了更强烈的荧光信号。Thiele等[32]应用CARD-FISH和显微镜计数的方式直观准确验证了棕囊藻属(Phaeocystis)和微单胞藻属(Micromonas)的实际细胞优势, Lau等[33]通过形态学检测发现一种类似Chattonella subsalsa有害藻华的特征, 并用分子生物学得到进一步证实, 为了精确检测环境中该细胞, 采用TSA-FISH进行测试, 结果显示探针对靶细胞的特异性, TSA-FISH被证明是一种检测环境中有害藻华的潜力工具。CARD-FISH因其较高的灵敏度和较强的荧光信号, 常被用作识别和定量微生物细胞的工具, 在检测有害藻华方面有极大的应用潜力。
自1980年FISH首次应用于原位检测以来[34], 该技术经历了显著的发展(见表 1), 包括双色检测、与CARD结合提高灵敏度及特异性, 以及应用于微生物群落和单细胞水平的分析, 特别是CARD-FISH显微观测技术的发展, 使得环境微生物群落结构的详细解析成为可能, 并推动了非培养依赖型微生物研究的发展。
| 年份 | 应用 | 参考文献 |
| 1980 | FISH首次原位检测应用 | [34] |
| 1986 | FISH双色检测 | [35] |
| 1989 | CARD利用报告酶(Analyte-Dependent Reporter Enzyme, ADRE)用于固相免疫分析 | [36] |
| 1990 | 多重荧光原位杂交(mFISH)检测染色体畸变 | [37] |
| 1991 | CARD用于非放射性膜分析 | [38] |
| 1995 | CARD-FISH应用于组织学和细胞学样本上的特定基因DNA探针 | [39] |
| 2000 | FISH可视化单个微生物细胞 | [40] |
| 2001 | Q-FISH量化单个染色体末端的端粒长度 | [41] |
| 2003 | FISH可应用于非依赖培养的微生物群落 | [42] |
| 2012 | 通过信号放大策略的FISH技术检测单个微生物细胞内的特定基因 | [43] |
| 2013 | CARD-FISH检测环境微生物群落结构 | [44] |
| 2016 | 通过MiL-FISH分析, 可以清晰地观察到单个共生体细胞的分布 | [45] |
| 2020 | Double CARD-FISH检测鞭毛虫群体食物泡内容物 | [46] |
| 2022 | CARD-FISH量化浮游淡水纤毛虫 | [31] |
| 2025 | CARD-FISH和斑点酶联免疫吸附检测水生传播阶段的微孢子 | [47] |
| 2025 | 利用CARD-FISH通过超分辨率显微镜对海洋沉积物的Hodarchaeales相关细胞进行成像 | [48] |
CARD-FISH检测步骤大致分为以下几步: (1)细胞固定, (2)细胞通透性的处理和内源性过氧化酶的失活, (3)杂交和洗涤, (4)酪胺信号放大和DAPI染色, 完成以上步骤之后用荧光显微镜进行荧光检测[29], 如图 1所示。
在检测赤潮藻方面以上4种技术各自发挥着不同的作用, 并具有各自的优势和局限性, 本文梳理了4种技术的优缺点、适用性及案例(见表 2)。HTS在大规模的筛选阶段发挥重要作用, 如可以筛选能产生毒素或具有特定生态位适应性的藻株[12], 但其定量功能存在局限性, 不能很好地反应各个谱系的实际相对丰度且特异性不高[14]; 而qPCR能精确定量特定种类赤潮藻的丰度, 灵敏度高, 特异性强, 但需已知目标序列的详细信息, 且当样品溶液中目标细胞较少时qPCR灵敏度不如CARD-FISH[50], 此外许多赤潮藻的毒素合成与细胞活性直接相关, qPCR无法区分细胞生理活性, 而CARD-FISH能反映细胞产毒阶段, 也因qPCR无法定位细胞而不能提供目标藻类的分布模式, 而这对于赤潮的形成机制很重要; FISH也具有较强的特异性, 可以直观地反映赤潮藻的种类和数量, 但灵敏度较低且信号强度较弱, 而CARD-FISH较FISH而言增强了信号强度, 又兼具qPCR的高灵敏度, 适用范围广, 不仅适用于良好的室内实验环境, 还可以应用于受污染的地下水、污泥、土壤等[51], 需要注意的是, CARD-FISH的优势常伴随着更高的成本, 昂贵的酪胺试剂、HRP标记探针和更长的试验周期, 这在一定程度上限制了该技术在大规模样本的应用。
| 鉴定技术 | 优点 | 缺点 | 适用性 | 案例 |
| HTS | 通量大、灵敏度高 | 成本高、操作较复杂、广泛但需要已知序列 | 复杂样本的全面分析、微生物群落组成和功能研究 | 宋伦等[13]对黄海北部海域真核微藻粒级结构研究发现不同季节的不同微粒等级的优势物种 |
| qPCR | 灵敏度高、准确性强、特异性高、快速检测特定目标基因或微生物 | 仅限于已知序列的目标检测、无法提供微生物的空间分布信息 | 快速定量已知藻种且样本清洁 | 王蒙[21]开发的米氏凯伦藻qPCR检测方法灵敏度极高, 误差率≤18.3%, 符合行业规范(≤20%) |
| FISH | 提供微生物的空间分布信息、无需培养、可视化微生物在环境中的位置 | 灵敏度低、定量准确性差、信号强度低 | 目标藻类rRNA含量高且无需信号扩增 | 陈国芳等[27]设计探针能在1 h内定量和识别生长周期的70%~80%的靶细胞赤潮异弯藻 |
| CARD-FISH | 特异性高、灵敏度高、提供微生物的空间分布信息、应用广泛 | 操作复杂、成本较高 | 复杂样本中低丰度微生物的检测 | Thiele等[34]应用CARD-FISH和显微镜计数的方式直观准确验证了棕囊藻属和微单胞藻属的实际细胞优势 |
Giner[52]用CARD-FISH技术量化了来自欧洲6个沿海站点的13个浮游样品中6种微型真核生物的相对细胞丰度, 随后将结果与使用DNA和RNA提取物对18S核糖体DNA(rDNA)V4区域的454测序(DNA-V4和cDNA-V4)以及对V9区域的Illumina测序(cDNA-V9)三项独立的分子调查结果作了比较, 发现HTS结果与显微镜观察到的细胞丰度存在相关性, 但这种关系并非线性, 因此虽然HTS可用作定量分析但不能作为细胞丰度的指标。Touzet等[20]采用杂交探针技术, 对内部转录间隔区1-5.8 SrRNA进行了潜在毒量的实时定量PCR, 用这种方法检测和定量海水样本中微小亚历山大藻(A. minutum), 将结果与全细胞FISH和形态学观测进行比较, 在9个样本比较中, qPCR、全细胞FISH和形态学的8个样本无明显差异, 微小亚历山大藻qPCR检测提供了高通量样本分析, 可能适合于目标微藻监测项目, 并有助于该物种的种群动态研究。像HTS和qPCR这类技术需先将样品磨碎提取DNA或RNA, 虽然能获得细胞的定性信息, 但它们原本在空间中的分布信息情况完全丢失, 如某些藻细胞是聚集还是均匀分布、是附着生存还是自由分布这些信息我们无从可知, CARD-FISH弥补了单一使用测序技术来解决生态问题的缺陷。Piwosz等[29]指出CARD-FISH能将微生物的身份与具体的空间位置联系起来, 这是只能提供物种列表和相对丰度的HTS所不具有的功能, 而CARD-FISH是填补这一空白的核心技术。CARD-FISH是实现在复杂环境中进行原位定量的强大工具, 在提供绝对数量和空间原位信息方面比分子定量方法更具优势[44], 这对研究赤潮的暴发过程具有重要指示作用。此外, 将以上技术结合使用能发挥不同的功能和效果, 从而获得更全面的信息, 如将HTS和FISH结合, 有助于更好地研究活跃微型生物的代谢潜力和基因表达[53]。CARD-FISH作为一种能够验证存在的方法, 可能会更加可靠, 尤其是在需要高灵敏度检测的时候。
虽然CARD-FISH适用于低拷贝数的分子, 其检测灵敏度要高于FISH, 但它常用于研究原核生物群落的定量检测, 而对真核微生物研究较少[11], 这种研究发展的不平衡可能是该领域的知识空白之一, 这也是本文综述撰写的意义所在。
4 CARD-FISH展望 4.1 限制与优化CARD-FISH是研究微生物生态学的一种分子技术, 广泛在土壤、沉积物、水生环境和工程污泥中使用, 主要缺点是, 与传统的FISH相比, 需要额外的优化步骤, 如HRP是一个较大的分子(40 kDa), 相比于传统寡核苷酸上使用的荧光染料(通常在400~800 Da之间), 它们穿透细菌细胞壁的能力要弱得多[44]。因此, 细胞通透性的处理和固定步骤变得极其重要, 为了使寡核苷酸探针渗透进细胞, 必须对细胞进行严格的预处理, 但如乙醇、甲醛等固定剂不能完全确保细胞的完整性, 为了改善以上缺陷, 也有使用荧光标记的肽核酸PNA和锁定核酸LNA探针, 前者是一种具有良好稳定性和杂交特性的DNA模拟物, 突出优点是具有中性骨架, PNA寡聚体在许多应用上性能优于DNA[54]。LNA单体可显著增强与核酸分子的亲和力, 进而提升检测的信噪比、灵敏度与特异性。Zhu等[55]采用的LNA-FISH虽难以精确定量miRNA, 但其改进技术LNA-ELF-FISH通过酶促荧光信号放大, 能实现细胞中RNA的较准确定量。Chen等[56]的研究表明, 针对东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense), PNA探针相较于DNA探针显示出更强的荧光信号及更高的检出灵敏度, 证实其敏感性更优。此外, 对于细胞膜脆弱的藻类, 建议采用更温和的固定与通透条件, 并在实验中优化处理浓度。
CARD-FISH技术的鉴定能力, 很大程度上取决于探针的特异性和目标藻类的遗传多样性。在理想情况下, 通过精心设计的特异性探针, CARD-FISH技术能够实现对赤潮藻的精确鉴定, 达到种甚至亚种水平。然而在实际应用中, 由于不同种类赤潮藻之间的遗传差异可能较为微妙, 或者存在近缘种和复合种的情况, 这都对鉴定工作提出了更高的挑战。其次, 使用CARD-FISH针对单一样本中的多个感兴趣群体是非常耗时的, 因为每个目标群体都需要杂交, 同时检测样本中多种微生物时该技术受制于不同颜色荧光染料的数量和荧光信号的重叠, 因此在一项实验中能检测到的目标物种有限, Schimak等[45]提出多标签寡核苷酸探针MiL-FISH(Multilabeled Oligonucleotides for Fluorescence In Situ Hybridization, MiL-FISH), 该方法可以通过单个寡核苷酸探针的组合标记来同时靶向多达7个微生物群体, 其中可用的荧光染料的标签数量决定了可检测的目标数量, 后通过现代共聚焦激光扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)的线性解混和光谱成像FISH(Confocal Laser-Assisted Spectral Imaging - Fluorescence In Situ Hybridization, CLASI-FISH)来揭示, 这种多标签寡核苷酸探针的方法允许同时检测和区分多个不同的微生物种类, 提高了CARD-FISH应用广泛性和灵活性, 对于研究复杂微生物生态系统中的多样性和功能分布特征很重要。
此外, 非特异性荧光信号的产生是对该实验造成的主要干扰, 其一是由于所设计的探针特异性不够强或与非目标区域杂交, 探针的选择是该实验成功的关键; 其二是内源性过氧化物酶的未完全灭活, 有研究表明盐酸、过氧化氢、二乙基焦碳酸酯DEPC能有效抑制过氧化物酶的活性, 在实验设计时应根据样品的特点选择合适的试剂, 不断优化实验方案[57]; 其三可能由于洗涤不够彻底, 未良好去除与目标序列弱杂交或非杂交的游离探针而造成背景染色。为了减少非特异性荧光信号的产生, 可以优化实验条件, 如提高杂交缓冲液中甲酰胺和盐的浓度、适当提高溶液中酪胺的浓度、适当提高洗涤反应温度等。Medlin[58]探究了不同洗涤温度对杜氏盐藻(Dunaliella salina)假阳性信号的影响, 发现适当提高温度可以提高杂交反应的严格性, 使假阳性信号降到阈值以下。有研究表明, 在富含颗粒的环境样本(如海底沉积物)中, 由于荧光探针的非特异性吸附导致的非生物颗粒高背景荧光阻碍了微生物检测, 在杂交缓冲液中替代氯化钠添加高浓度的EDTA, 能有效减少探针的吸附, 而不影响基于FISH的微生物检测功能, 这对研究复杂环境中的微生物群落组成尤为重要[59]。
通过以上优化措施, CARD-FISH技术可以在保持其信号放大优点的同时, 克服传统FISH技术中的一些限制, 使其成为一种更加强大和可靠的检测工具, 但开展具体的某项实验需要研究者根据实验对象和已有的技术方案不断尝试, 探索最佳的实验条件。
4.2 应用潜力FISH技术因其能够定位和检测复杂样品中的微生物而占据重要地位, 在过去几十年中, FISH发生着重要变化, 其信号强度、成像采集、稳定性等方面取得进步, 随着FISH方法的不断增加, 试剂、探针类型和检测方法也越来越多, 这增加了研究的可选择性, 如RNA-FISH技术的进步已实现单细胞内单个RNA分子的成像与定量[60]; 2010年, Moraru等[61]提出的gene-FISH技术, 通过CARD-FISH与地高辛标记探针及抗体级联放大相结合, 实现了环境样本中细胞身份与基因存在的直接关联, 尽管信号稳定, 步骤仍较为繁琐, 且无法定量基因拷贝数; 2017年发表的direct-geneFISH是对gene-FISH技术的进一步优化, 避免使用CARD技术, 直接使用荧光染料标记的探针同时检测目标细胞中的RNA和基因, 首先应用在携带目标基因的质控载体的埃希氏菌(Escherichia coli), 结果显示细胞内的基因拷贝数与gene-FISH信号之间存在相关性[62], 既保持了传统gene-FISH的优势, 还在信号稳定性、操作简便性等方面得到了改善。此外, CARD-FISH与其他仪器联用极大地拓展了其功能维度, 如与纳米二次离子质谱(Nano SIMS)联用, 利用同位素或放射性同位素底物评估微生物代谢活动, 但Nano SIMS不是一种基于显微镜的方法, 不能观察荧光信号[63]; 与微放射自显影(Microautoradiography, MAR)连用, 可以实现单细胞水平上的高分辨率定位[64]; 与流式细胞仪连用, 能对特定细胞群体快速、高通量和分选, 识别和量化微生物, Hazeem等[65]使用CARD-FISH与流式细胞仪已成功监测巴林沿海水域潜在有害物种米氏凯伦藻(K. mikimotoi)细胞的数量变化, 流式细胞术和CARD-FISH的结合不仅能提高样本分析的速度和效率, 还能提高数据的准确度, 有助于更好地管理藻华, 随着学科的发展和技术的进步, 相信未来会在藻华监测和研究中发挥更大的作用。
该技术的核心优势是在复杂环境样本中对低丰度微生物有较高的检出率与定量可靠性, 较传统FISH提高约30%[59], Avci等[48]成功检测了相对丰度仅为0.1% 的Hodarchaeales细胞, 其检测高灵敏度表明CARD-FISH完全有能力在赤潮非暴发时期或休眠体阶段进行精准的原位检测, 这对赤潮的早期预警有重大意义。更重要的是, CARD-FISH在复杂环境样本中解析微生物生态功能方面表现出卓越潜力, 该技术已成功应用于浮游原生生物定量与空间分布研究, 通过揭示原生生物的身份和策略来研究它们之间的相互影响和对环境的适应性, 为生态学提供新的见解。Double CARD-FISH双杂交即结合两种或两种以上的探针, 可以同时瞄准不同营养水平的原生生物, 即捕食者和被捕食者食物泡含量, 为研究特定纤毛虫种或属在湖泊远洋环境的生态作用提供可能。Dirren-Pitsch等[46]通过Double CARD-FISH技术观察到尾核杆菌(Urotricha cf. Pseudofurcata)摄食软骨杆菌细胞(Methylobacterium chlorelligerum)的过程, 表明该技术能够直接在原位可视化食物链中的营养关系, 这是任何基于DNA分子提取的测序或qPCR技术都无法实现的。FISH和双杂交的结合应用颠覆了我们目前对较大鞭毛虫的认知, 如某些大型鞭毛虫实为杂食而非仅食细菌[35]。此外, CARD-FISH应用潜力还体现在与多技术的联用上, Li等[47]将5种常见藻类微小原甲藻(P. minimum)、海洋原甲藻(P. micans)、亚历山大藻属、赤潮异弯藻、Akashiwo sanguinea (血红裸甲藻)作为对照样本进行检测, 证实了新建立的CARD-FISH和斑点酶联免疫吸附检测Dot-ELISA方法对寄生性甲藻(Hematodinium perezi)具有高度特异性, 不会发生交叉反应。该研究表明CARD-FISH技术具备扩展用于多种赤潮藻及其关键生活史阶段的监测潜力, 为早期赤潮预警和针对性防控措施的制定提供关键生物学依据; Avci等[48]利用CARD-FISH结合超分辨率显微镜, 成功解析了Hodarchaeale的奇特形态和内部结构, 这项研究为CARD-FISH技术在赤潮藻的研究带来启示, 通过设计高特异性探针与高分别率成像技术的结合使用, 有望实现对赤潮藻细胞精细结构、生活史阶段以及与其他微生物互作的解析, 从而深化对藻华发生、发展和消退机理的理解。
在众多鉴定技术中, CARD-FISH技术作为一种高灵敏度、高特异性的赤潮藻鉴定手段, 在赤潮藻的鉴定中展现出了巨大的潜力, 如图 2所示, 该技术围绕藻华生态学问题展开, 样品采集处理后进行CARD-FISH技术鉴定, 通过显微镜的观察进行分析与定量, 实现赤潮藻种鉴定等生态学应用, 这有助于科研人员更好地理解不同赤潮藻之间的相互影响和对环境的适应性; 通过定期监测海水样本中的赤潮藻密度, 可以及时发现潜在的风险, 为采取预防措施提供依据。CARD-FISH凭借酶促信号放大的机制显著提高了检测灵敏度和特异性, 有效弥补了HTS在定量准确性、qPCR缺失原位空间信息及FISH信号强度方面的局限性。虽然该技术存在以上提到的弊端, 如假阳性信号的产生、操作较复杂等, 但其在揭示藻华发生机制、动态监测和生态互作方面有不可忽视的优势。随着技术的进步和探针的优化, 使得该技术的物种鉴定更加标准, 未来可以整合基因组学、转录组学和蛋白组学, 全面理解有害藻华的生物学特性及影响, 相信该技术在赤潮藻的研究和监测中发挥越来越重要的作用。
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| 图 2 CARD-FISH技术在藻华生物生态学应用的概念图 Fig. 2 Concept map of catalyzed reporter deposition-fluorescence in situ hybridization application in harmful-algal-bloom biological ecology |
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