2025, Vol. 49
文章信息
- 王建龙, 侯天琪, 王欣欣, 庄昀筠, 陈洪举, 刘光兴. 2025.
- WANG Jianlong, HOU Tianqi, WANG Xinxin, ZHUANG Yunyun, CHEN Hongju, LIU Guangxing. 2025.
- 固定剂和保存条件对桡足类及其肠道内容物DNA质量的影响
- Effects of the fixative and storage duration on the quality of DNA obtained from copepods and their gut contents
- 海洋科学, 49(12): 104-114
- Marine Sciences, 49(12): 104-114.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250430002
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文章历史
- 收稿日期：2025-04-30
- 修回日期：2025-06-26
2. 青岛海洋科技中心 海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266237
2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China
桡足类是海洋生态系统中数量最丰富的次级生产者, 是海洋食物网和生物碳泵的重要组成部分。它们种类多、数量大、分布广, 其多样性和种群动态不仅调控着初级生产的节律、规模和归宿, 也深刻影响着更高营养级生物的资源变动[1-2]。因此, 研究桡足类多样性及其摄食生态, 是揭示海洋生物多样性维持机制、解析次级生产过程的关键。迄今已记录桡足类超过14 882种[3], 且新物种仍陆续被发现, 展现出极高的物种、遗传及功能多样性[4-5]。桡足类食物组成多样, 包括浮游植物、原生动物、水生生物的卵和幼虫以及有机碎屑等[6], 其摄食选择性与摄食速率也是建立海洋生态系统模型的关键参数。
DNA条形码技术以其高灵敏度、标准化流程和高通量的优势, 已成为解析桡足类多样性及其摄食生态的关键技术手段[7-9]。该技术突破传统形态鉴定的局限, 发现了桡足类隐存种[4, 10], 揭示了桡足类复杂且动态变化的食物组成[7, 11-14]。然而, 这些分子检测结果的可靠性依赖于DNA的有效固定与保存: 既需满足野外操作便捷(如快速处理), 又需在一段时间内有效保存DNA(如DNA含量、完整性等)。针对桡足类现场食物组成研究, 固定剂还应具有高渗透性, 以快速穿透甲壳、抑制肠道活动, 避免桡足类消化和排粪对肠道内容物DNA的影响。
尽管液氮冷冻被视为DNA保存的“金标准”, 但其在远洋科考中的应用面临多重限制, 如海上颠簸和野外环境等加速液氮挥发, 长期野外作业难以获得有效补充, 影响样本保存稳定性。实践中更常用化学固定剂, 包括(1)直接添加型, 可保留部分海水, 简化操作流程: 如5%(体积分数)甲醛和1%~3%(质量体积分数)鲁哥氏液; (2)预处理型, 需滤除海水, 加入乙醇[15-18]或RNAlater等[19-21]。不同的化学固定剂会对DNA造成不同程度的影响, 如甲醛易引起DNA-蛋白质交联导致DNA片段化从而对DNA结构造成不可逆损伤[22], 乙醇可能造成DNA较快的降解[17]。
尽管基于DNA条形码的分子工具已广泛应用于海洋生态学研究, 但固定剂类型和保存条件对桡足类及其肠道内容物DNA保存效果尚缺乏系统评估。本研究以日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus)及青岛大扁藻(Platymonas helgolandica var. tsingtaoensis)为研究对象, 系统比较了5种固定剂(液氮、乙醇、RNAlater、中性鲁哥氏液和甲醛)对桡足类及其肠道内容物DNA含量、纯度和完整性的影响, 并进一步分析了DNA保存效果随时间(0~2个月)的变化。本研究结果可为桡足类多样性及其摄食研究的采样策略制定、固定方法选择及保存条件优化提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 桡足类及其饵料藻培养实验用日本虎斑猛水蚤(T. japonicus)由中国海洋大学海洋生命学院底栖生物实验室提供。桡足类在1 L玻璃烧杯中培养, 培养体积800 mL, 每48 h投喂青岛大扁藻(P. helgolandica)(4×104 cells /mL)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)(4×104 cells /mL)和酵母组成的混合饵料。日本虎斑猛水蚤长期培养时, 使用混合饵料喂养, 保证良好的营养供应; 在开展固定剂及保存条件实验时, 为保证实验条件可控、可重复, 避免饵料竞争、摄食偏好等的影响, 饥饿处理后只投喂单一饵料——青岛大扁藻。桡足类和藻类培养条件均为温度(20±1) ℃、盐度30、光照强度100 μmol·m–2·s–1、12L∶12D的光照/黑暗周期。藻类采用L1-Si液体培养基培养[23], 使用Sedgwick-Rafter计数板细胞计数。实验用海水采自青岛沙子口近岸水域, 经0.45 μm微孔滤膜过滤后, 高温高压灭菌。
1.2 实验设置 1.2.1 桡足类固定及保存针对每种固定和保存方法设置3个平行, 每个平行包括15只桡足类成体和15 mL无菌海水, 培养容器为50 mL聚碳酸酯离心管。将所有组别桡足类在20 ℃、光照/黑暗周期为12L∶12D的环境下饥饿培养48 h; 饥饿处理组在液氮中快速冷冻; 其他组则投喂P. helgolandica (8.25×105 cells / mL)。投喂2 h后, 即刻将饱食组在液氮中快速冷冻, 其余桡足类分别用5%甲醛(体积分数)、2%鲁哥氏液(质量体积分数)、分析级无水乙醇(Merck EMSURE®)以及RNAlater (QIAGEN 76106)固定。后续对不同保存时间的效果进行评估(表 1)。
| 样品来源 | 组别名称 | 固定方式 | 保存条件 | 样品个数 | ||
| 即时 | 1个月 | 2个月 | ||||
| 饥饿桡足类 | 液氮(饥饿) | 液氮 | / | 3 | / | / |
| 饱食桡足类 | 液氮(饱食) | 液氮 | / | 3 | / | / |
| 鲁哥氏液 | 2% 鲁哥氏液 | 2% 鲁哥氏液, 4 ℃避光 | 3 | 3 | 3 | |
| 鲁哥氏液+EDTA | 2% 鲁哥氏液 | 100 mmol/L EDTA, −20 ℃ | 3 | 3 | 3 | |
| 乙醇 | 无水乙醇 | 无水乙醇, 4 ℃ | 3 | 3 | 3 | |
| RNAlater | RNAlater | −20 ℃ | 3 | 3 | 3 | |
| 甲醛 | 5% 甲醛溶液 | / | 3 | / | / | |
| 单独培养饵料藻 | EDTA | 100 mmol/L EDTA | 100 mmol/L EDTA, −20 ℃ | 3 | 3 | / |
| 乙醇 | 无水乙醇 | 无水乙醇, 4 ℃ | 3 | 3 | / | |
| RNAlater | RNAlater | −20 ℃ | 3 | 3 | / | |
| 鲁哥氏液 | 2% 鲁哥氏液 | 2% 鲁哥氏液, 4 ℃避光 | 3 | 3 | / | |
固定方法分为直接固定及滤干水分后固定两类。其中, 鲁哥氏液和甲醛采用直接固定方式, 操作时向培养管中直接加入对应固定剂, 使鲁哥氏液终浓度达到2%(质量体积分数)、甲醛终浓度达到5%(体积分数)。液氮、乙醇和RNAlater固定前需滤干样品水分。在野外采样中, 通常使用筛绢滤干样品。在本研究中, 为模拟该步骤且避免桡足类损失, 使用塑料移液管快速、轻柔吸除培养管中的海水, 避免扰动刺激桡足类排粪。随后立即进行固定: 液氮固定将培养管置于液氮中快速冷冻; 乙醇固定时向管中加入20 mL无水乙醇; RNAlater固定向管中加入10 mL RNAlater。
为评估固定剂对DNA的初始固定效果, 固定后即刻提取DNA的组别设定为“即时组”, 作为后续长期保存效果的对照基线。样本浸没入相应固定剂后, 在室温1 h内完成所有处理组的样本固定, 并立即进行“即时组”DNA提取。
用于长期保存效果评估的样本, 均依据对应固定剂的长期保存方案处理, 保存时间分别为1个月和2个月。具体操作如下: 鲁哥氏液组样本置于4 ℃避光保存; “鲁哥氏液+EDTA”组样本经2%(质量体积分数)鲁哥氏液固定1 h后, 转移至2 mL离心管, 移除固定剂后, 用500 μL 100 mmol/L EDTA(pH 8.0)清洗6次, 浸没于200 μL 100 mmol/L EDTA(pH 8.0), 置于−20 ℃保存。乙醇组样本经无水乙醇固定后, 先置于4 ℃避光保存24 h, 完全移除固定剂后, 再次添加等量无水乙醇, 置于4 ℃避光保存。RNAlater组样本经RNAlater固定后, 先置于4 ℃保存24 h, 之后移除RNAlater, 样本置于−20 ℃保存直至DNA提取。
1.2.2 藻类固定及保存为对比桡足类肠道内容物保存效果, 分别使用100 mmol/L EDTA、鲁哥氏液、乙醇及RNAlater四种方法对单独培养饵料藻进行固定(表 1)。各处理组设置3个生物学平行, 每个平行含5.6×106个藻细胞。具体操作如下: 鲁哥氏液组直接向藻液中加入鲁哥氏液, 终浓度为2%(质量体积浓度); 其余3组均先离心收集藻细胞(3 000 r/min, 20 ℃, 15 min), 移除上清后, 分别加入1 mL 100 mmol/L EDTA(pH 8.0), 1 mL无水乙醇及1 mL RNAlater。藻类样本设置“即时组”和长期保存组(保存时间1个月), 其中100 mmol/L EDTA固定的藻类长期保存时置于−20 ℃, 其余固定剂处理组长期保存方法与桡足类对应组别一致。
1.3 DNA提取随后在100 mmol/L EDTA(pH 8.0)中解冻, 以便后续进行DNA提取, 桡足类经100 mmol/L EDTA(pH 8.0)冲洗6次, 以去除附着在其体表的藻细胞以及残留的固定剂。随后, 将桡足类分别移至1.5 mL离心管中, 使用无菌塑料研磨杵匀浆处理, 并采用十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)结合异丙醇沉淀法提取DNA。
具体操作步骤如下: 向匀浆样品中加入200 μL DNA裂解缓冲液(含1% SDS、0.1 mol/L EDTA和100 μg/mL蛋白酶K), 56 ℃温浴3 h。温浴结束后, 在每个样品中加入33 μL 7 mol/L的NaCl和33 μL 10%(质量体积分数)CTAB, 随后56 ℃温浴10 min, 加入等体积氯仿抽提。离心后, 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中, 并加入1.25 μL 10 mg/mL RNase(Takara), 室温静置15 min去除RNA。使用等体积的酚∶氯仿(1∶1)抽提。将上清液再次转移至干净的1.5 mL离心管中, 并加入等体积异丙醇, −20 ℃静置过夜。低温离心后, 用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次, 风干后溶解于30 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中。为保证DNA完整性, 所提取DNA未进行过柱纯化。
1.4 DNA含量, 纯度和完整性DNA定量采用NanoDrop 2000C分光光度计(Thermo Fisher Scientific)、Qubit® dsDNA HS检测试剂盒和Qubit® 3.0荧光计(Thermo Fisher Scientific)分别进行测定。DNA含量以每只桡足类所含DNA质量(ng/copepod)表示。DNA纯度通过NanoDrop 2000C分光光度计测定的A260/A280和A260/A230比值进行评估。DNA完整性通过0.8%(质量体积分数)琼脂糖凝胶电泳进行评估。每个处理组取约50~100 ng DNA, 在0.5×Tris-硼酸-EDTA (TBE)中以80 V电压电泳50 min。
1.5 荧光定量PCR(RT-qPCR)基于DNA降解过程中片段化的特性, 以及PCR扩增对完整模板的依赖性——当DNA发生降解时, 其双链会发生断裂, 导致长链DNA分子被切割成小片段; 而成功的PCR扩增需要引物能够特异性结合到目标序列两端, 且它们之间的模板序列必须完整连续。因此, 短片段内部存在断裂点的概率更低, 被有效扩增的概率更高, 分别定量长短片段, 可以反映降解程度[24]。采用18S rDNA通用引物18ScomF1和18ScomR1[25](表 2), 分别从饥饿处理的桡足类及其饵料藻的基因组DNA(gDNA)中扩增出约1 800 bp的18S rDNA全长片段。PCR反应体系为25 μL, 包含1 μL DNA模板(20~30 ng)、1.25 U Ex Taq DNA聚合酶(Takara)、0.2 μmol/L正反向引物、1× Ex Taq缓冲液以及200 μmol/L dNTP。扩增条件为: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s, 5个循环; 95 ℃变性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s, 30个循环; 72 ℃终延伸20 min。PCR产物经琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(Takara)纯化后测序(ABI 3730XL)。使用NanoDrop 2000测定扩增产物的浓度, 并根据其浓度及序列信息计算每微升的拷贝数。纯化后的PCR产物稀释为102~107 copies/4 μL的标准品, 用于RT-qPCR。
| 引物名称 | 序列(5′-3′) | PCR产物长度/bp |
| 18ScomF1 | GCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGC | 1800 |
| 18ScomR1 | CACCTACGGAAACCTTGTTACGAC | |
| Tigjp18SSF1N | GTCCAAGCACAAGCCGAATTAAGG | 104 |
| Tigjp18SSR1 | CTCCAGAATTACCGCAGTTATCCAAGT | |
| Tigjp18SLF4 | GCAGGCTTGACACGCTTGAATCT | 539 |
| Tigjp18SLR4 | CTCGTTCGTTATCGGAATTAACCAGACA | |
| Plahe18SSF2 | CGCTCCTACCGATTGAATGTGTTG | 125 |
| Plahe18SSR2 | CCTTGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAA | |
| Plahe18SLF1 | TCTGGCTTATCTTGTTGGTCTGTGAG | 521 |
| Plahe18SLR1 | CAGGCTGAGGTCTCGTTCGTTAC |
基于18S rDNA的全长序列, 利用Primer Premier(V6.0)分别设计T. japonicus(104 bp和539 bp)和P. helgolandica(125 bp和521 bp)的物种特异性引物(表 2)。RT-qPCR在Bio-Rad CFX96TM Touch实时荧光定量PCR系统(Bio-Rad)上完成, 采用Ssofast Eva Green Supermix试剂(Bio-Rad)。每个标准品或测试样品均设置2个技术重复。反应体系为10 μL, 其中包含6 μL Supermix、250 nmol/L正反向引物以及4 μL DNA模板。反应条件如下: 95 ℃预变性1 min; 95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸25 s, 45个循环。扩增结束后, 通过熔解曲线分析验证引物特异性, 熔解曲线分析条件为: 温度由65 ℃逐步升至95 ℃, 每5 s升高0.5 ℃。采用Bio-Rad数据分析程序计算各引物对的相关系数(R2)、标准曲线斜率及PCR扩增效率。所有产物均呈现单一熔解峰, 引物具有良好扩增特异性。
1.6 数据分析使用SPSS(V17.0)进行单因素方差分析(One- way ANOVA)及相关性分析(Pearson correlation), 结合Tukey HSD检验来评估组间差异显著性, P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 DNA含量采用Nanodrop和Qubit 2种方法测定DNA浓度, 结果显示, 桡足类样品中Nanodrop测定的单只个体DNA含量为Qubit测定值的3~25倍, 而单独培养的饵料藻样品中Nanodrop测定值是Qubit的3~5倍(图 1)。尽管2种方法测得的DNA含量存在显著差异, 但测定值呈显著正相关(P＜0.01)。
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| 图 1 不同固定剂及保存条件下桡足类和藻类DNA含量 Fig. 1 DNA yield of copepods and algae treated with different fixatives and under varied preservation conditions 注: 小写字母代表不同固定剂即时处理组之间的显著性差异, 相同字母表示组间无显著差异, 不同字母表示存在显著差异; 星号(*)代表同一固定剂处理组在不同保存时间上的显著性差异, 其中*表示P＜0.05, **表示P＜0.01。 |
不同固定剂及保存条件处理下的桡足类DNA含量存在显著差异(图 1a, b)。以液氮(饱食)组为对照, 即时处理后, 2种方法测定结果的趋势保持一致, 即液氮(饥饿)组、甲醛组、鲁哥氏液组和RNAlater组DNA含量低于对照组, 但组间差异的统计显著性在2种测定方法中存在不一致, 乙醇组与对照组在Nanodrop和Qubit两种测定方法中均无显著差异。保存1~2月后, 除乙醇组外, 其余组别DNA含量均未随时间显著下降(P > 0.05)。
针对单独培养饵料藻的DNA含量(图 1c, d), 以EDTA组为对照, 即时处理后, 2种测定方法结果的趋势保持一致: 鲁哥氏液组、乙醇组和RNAlater组的DNA含量均低于对照组, 且3组中乙醇组含量最高, 其次为RNAlater, 鲁哥氏液组最低。保存1个月后, 2种测定方式均显示各处理组DNA含量较即时处理无显著下降(P > 0.05)。
2.2 DNA纯度桡足类DNA纯度比值分析显示, 所有组别A260/A280范围为1.7~2.1, A260/A230范围为0.9~2.0(图 2a, b)。即时处理后, 各组间两类纯度比值均无显著差异; 保存1~2个月后, RNAlater组两类比值均保持稳定, 鲁哥氏液、鲁哥氏液+EDTA及乙醇组均出现显著升高(P＜ 0.05), 表明RNAlater在长期保存过程中对桡足类DNA纯度的保护效果最佳, 而其他固定剂可能导致保存过程中DNA降解产物或杂质的积累, 影响纯度。
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| 图 2 不同固定剂及保存条件下桡足类和藻类的DNA纯度 Fig. 2 Purity of the DNA isolated from copepods and algae treated with different fixatives and under varied preservation conditions 注: 小写字母代表不同固定剂即时处理组之间的显著性差异, 相同字母表示组间无显著差异, 不同字母表示存在显著差异; 星号(*)代表同一固定剂处理组在不同保存时间上的显著性差异, 其中*表示P＜0.05, **表示P＜0.01。 |
单独培养饵料藻的DNA A260/A280范围为1.9~2.0, A260/A230为1.75~2.20(图 2c, d)。两类纯度比值在所有组别间均无显著差异, 且保存1个月后, 均无显著变化。
2.3 DNA完整性评估通过琼脂糖凝胶电泳评估DNA完整性。结果显示, 不同固定剂和保存条件下样品的DNA主带均超过10 kb。所有样品在2~10 kb范围内均观察到轻微的拖尾现象, 表明DNA降解程度较低(图 3)。
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| 图 3 不同固定剂及保存条件下日本虎斑猛水蚤和青岛大扁藻gDNA电泳结果 Fig. 3 Agarose gel electrophoresis for assessing the integrity of genomic DNA isolated fromTigriopus japonicus and Platymonas helgolandica treated with different fixatives and under varied preservation conditions 注: Marker: λHind Ⅲ Digest, DL23130; (a)日本虎斑猛水蚤gDNA: 1~6(即时: 液氮(饥饿)、液氮(饱食)、5%甲醛、2%鲁哥氏液、> 95%乙醇、RNAlater), 7~9(1个月: 2%鲁哥氏液、> 95%乙醇、RNAlater), 10~12(2个月: 2%鲁哥氏液、> 95%乙醇、RNAlater); (b)青岛大扁藻gDNA: 1~4(即时: 100 mmol/L EDTA、2%鲁哥氏液、> 95%乙醇、RNAlater), 5~8(1个月: 100 mmol/L EDTA、2%鲁哥氏液、> 95%乙醇、RNAlater)。 |
DNA完整性通过qPCR检测18S rDNA长、短扩增片段的拷贝数进行评估(图 4a, b)。即时处理后, 桡足类长、短片段18S rDNA的拷贝数各组别间变化趋势一致: 液氮(饥饿)组和液氮(饱食)组无显著差异, RNAlater组拷贝数与液氮对照组相当(短片段)或略高(长片段), 显著高于其他处理组(P＜0.05), 乙醇组、鲁哥氏液组和甲醛组拷贝数依次降低。保存1~2个月后, 较第0个月, 鲁哥氏液组和RNAlater组短片段拷贝数保持稳定, 而鲁哥氏液+EDTA组和乙醇组短片段拷贝数随时间显著下降(P＜0.05)。而所有组别的长片段拷贝数均下降, 其中RNAlater组降幅不显著(P > 0.05)。
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| 图 4 不同固定剂及保存条件下桡足类和藻类18S rDNA片段拷贝数 Fig. 4 Variation in the 18S rDNA copy numbers in copepods and algae treated with different fixatives and under varied preservation conditions 注: 小写字母代表不同固定剂即时处理组之间的显著性差异, 相同字母表示组间无显著差异, 不同字母表示存在显著差异; 星号(*)代表同一固定剂处理组在不同保存时间上的显著性差异, 其中*表示P＜0.05, **表示P＜0.01。 |
肠道内容物藻类18S rDNA拷贝数分析显示(图 4c, d), 即时处理后, 除乙醇组外, 其余组别短片段拷贝数均显著低于液氮(饱食)组(P＜0.05), 排序为, RNAlater组 > 鲁哥氏液组 > 甲醛组; 长片段中, 甲醛和RNAlater组与液氮(饱食)组无显著差异, 液氮(饥饿)组显著低于液氮(饱食)组(P＜0.05), 其余三组显著高于液氮(饱食)组。保存1~2个月后, 较第0个月, 鲁哥氏液组和鲁哥氏液+EDTA组的长、短片段拷贝数中均随时间显著下降(P＜0.05), 乙醇组和RNAlater组虽出现波动, 但统计检验不显著。
针对单独培养饵料藻DNA完整性评估显示(图 4e, f), 即时处理后, 长、短片段中, 所有处理组的长、短片段拷贝数均显著低于EDTA组(P＜0.05), 其中鲁哥氏液组拷贝数最低。保存1个月后, 长、短片段中, EDTA组拷贝数显著下降(P＜0.05), 而各处理组无显著下降。
3 讨论在基于DNA分析海洋浮游动物多样性及食物组成的研究中, 样本DNA的固定与保存是保障下游分子检测可靠性的关键前提, 需兼顾野外操作便捷性和储存期内DNA的稳定性。对于桡足类等甲壳动物, 理想的固定剂还需具备高渗透性, 以快速抑制其生理活动, 从而最大程度保留肠道内容物的DNA。针对不同研究需求, 液氮、甲醛[22]、鲁哥氏液、乙醇[15-18]及RNAlater[19-21]等固定方式被广泛采用。然而, 超低温、化学固定剂等的保存效能差异显著, 针对桡足类肠道内容物DNA获取效果尚缺乏系统评估。本研究系统评估了不同固定和保存方法对桡足类及其肠道内容物DNA质量的影响, 揭示了固定剂类型和保存条件对两类目标DNA保存效果的显著差异。
通过Nanodrop与Qubit测定DNA含量发现, 虽然Nanodrop值普遍高于Qubit, 但测定值呈显著正相关。这一现象与Ponti等[26]利用这2种方法对环游离DNA的定量结果一致。分光光度法(Nanodrop)因DNA、RNA、短片段和游离核苷酸的碱基具有相同紫外吸收特性, 其吸光值在260 nm处线性叠加且无法通过单一波长区分组分, 导致测量值偏高。而Qubit通过荧光染料与双链DNA特异性结合, 荧光强度反映与染料特异性结合的DNA总质量, 几乎不受其他污染物干扰。Nanodrop适合纯度较高、成分明确的样本, 或需要同时评估纯度(A260/A280、A260/A230), 不适合污染物较多的粗提样本; 而Qubit能够精准定量低浓度、复杂样本, 或需要区分DNA/RNA的场景, 成本较高。本研究中尽管2种测定结果获得的DNA含量有显著差异, 但组间变化趋势一致, 因此我们建议结合2种方法共同评估DNA含量与纯度。
针对桡足类本体DNA的保存效果, 固定剂类型及保存时间均表现出显著影响。本研究结果显示(图 1a, b; 图 4a, b), 甲醛处理组DNA含量最低, 乙醇组含量随保存时间下降最显著; DNA纯度初始状态各组无差异, 但保存后仅RNAlater组最为稳定(图 2a, b); 更重要的是, 在DNA完整性评估上, RNAlater组效果最佳, 其18S rDNA长、短片段在保存1~2个月后均无显著降解(图 4a, b)。这些差异与固定剂的化学属性密切相关。甲醛是一种交联性组织固定剂, 主要通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用, 具有渗透性强、固定速度快及组织形态保存完整等优点[27], 广泛应用于生物组织与形态学研究中[28]。然而, 本研究证实甲醛固定会引发显著的DNA损伤(图 4a, b)。甲醛低浓度时主要导致DNA链断裂, 高浓度则通过DNA-DNA交联和DNA-蛋白质交联2种形式破坏核酸结构[25]。虽然甲醛固定样本可实现DNA提取与PCR扩增, 甚至能从保存超过百年的标本中成功提取DNA进行系统发育分析[29], 但本研究的定量分析表明其诱导的DNA片段化严重(图 4a, b), 因此难以满足混合样品分析及相对定量对DNA完整性的要求。乙醇(通常为70%~95%浓度)通过快速渗透生物组织, 使蛋白质变性凝固, 终止细胞内酶活性及微生物代谢, 从而抑制DNA酶(DNase)对核酸的降解作用。然而, 本研究观察到乙醇组桡足类DNA含量及其18S rDNA片段拷贝数随时间显著下降(图 1a, b; 图 4a, b), 这与Moreira等[30]在蜜蜂中的发现类似。这种降解可能与乙醇在长期保存中浓度变化或未能完全抑制残余酶活性有关。Stein等[31]的研究强调了使用95%乙醇即时固定和定期更换乙醇以维持浓度对维持DNA完整性的重要性, 本实验虽采用了95%乙醇并在24 h后更换一次, 但长期保存效果仍不理想(图 4a, b), 提示对于桡足类DNA, 乙醇并非长期保存的最佳选择。相反, RNAlater作为无毒液态保存剂, 通过快速抑制核酸酶活性阻断核酸降解[32], 本研究发现其对桡足类DNA保存具有显著优势(图 1a, b; 图 2a, b; 图 4a, b), 2个月内DNA含量与18S rDNA拷贝数均无显著衰减。这与Gorokhova等[19, 21]在枝角类和卤虫中的研究结果一致, 进一步证实了RNAlater在维持小型甲壳动物DNA稳定性方面的卓越性能, 尤其适合需要长期保存桡足类本体DNA的研究。
对于桡足类肠道内容物DNA的保存, 固定剂的渗透速度及其对宿主生理活动的抑制能力至关重要, 以避免消化和排粪对目标DNA的影响。本研究结果(图 4c, d)显示, 在即时固定效果上, 乙醇组和鲁哥氏液组对肠道内容物藻类18S rDNA片段的拷贝数保存效果最佳, 显著优于RNAlater组(短片段)或与之相当(长片段), 表明乙醇和中性鲁哥氏液能快速渗透甲壳并有效抑制桡足类肠道活动。这与Hu等[12-13]在桡足类原位食物研究中使用鲁哥氏液的实践相呼应, 也解释了乙醇在快速固定方面的优势。然而, 在长期保存效果上, 差异显著(图 4c, d): 鲁哥氏液及鲁哥氏液+EDTA组的长、短片段拷贝数随时间显著下降; 乙醇组虽出现波动, 但统计检验不显著; RNAlater组则相对稳定但初始值较低。对比单独培养饵料藻的保存结果(图 4e, f), 鲁哥氏液和乙醇均能快速固定藻细胞DNA, 但鲁哥氏液长期保存效果欠佳。中性鲁哥氏液作为浮游植物形态学鉴定的常用固定剂, 凭借其低毒性、易着色等优势被广泛应用[33], 也可用于浮游动物样本[12-13, 34]。Gignac等[35]指出中性鲁哥氏液能减少DNA片段化程度, 本研究结果支持其在固定初期能保留较高丰度的肠道内容物DNA(图 4c, d), 具备应用于桡足类原位摄食短期研究的潜力, 但其长期保存中显著的DNA降解问题(图 4c, d)限制了其应用范围, 且使用时需注意通过硫代硫酸钠等中和残留碘以避免PCR抑制[36]。乙醇则表现出对肠道内容物DNA更好的长期稳定作用(图 4c, d), 这与其在快速终止生理活动和良好脱水性方面的特性相符。需要指出的是, Simonelli等[37]发现80%乙醇不利于桡足类肠道内容物DNA保存, 本研究采用 > 95%乙醇并快速处理, 取得了良好效果(图 4c, d), 说明乙醇浓度和处理速度是影响其效果的关键因素, 印证了Stein等[31]关于高浓度乙醇即时固定重要性的观点。值得注意的是, RNAlater虽能有效维持桡足类DNA稳定(图 4a, b), 但在保存肠道内容物DNA时效果显著低于乙醇(图 4c, d), 表明其在快速终止宿主生理活动或穿透肠道内容物方面效果相对欠佳。Gorokhova[21]在卤虫中的研究主要关注本体DNA/RNA, 本研究则揭示其在处理肠道内容物时存在局限性。
4 结论固定剂类型与保存时间均对桡足类及其肠道内容物DNA质量具有显著影响: RNAlater在维持桡足类DNA含量和完整性方面表现最优而乙醇在固定和保存肠道内容物DNA时更为稳定, 中性鲁哥氏液亦可即时或短期固定桡足类肠道内容物DNA, 但不宜于长期保存。基于此, 建议桡足类样本保存方案需根据研究目标针对性选择。研究结果为桡足类及其现场食物组成研究的样本采样策略制定、固定方法选择及保存条件优化提供了科学依据。
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