类菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acids, MAAs)是一类水溶性的代谢产物, 其分子结构以环己烯酮为核心, 连接不同的氨基酸侧链, 主要在310~ 360 nm的紫外光谱区表现出显著吸收, 可有效吸收UVA和UVB紫外波长, 具有卓越的防紫外性能, 已成为天然防晒明星分子^[1]。类菌孢素氨基酸除具有紫外辐射防护作用外, 还具有抗氧化、抗炎和抗衰等多种生物活性。因此, 类菌孢素氨基酸在化妆品、功能食品及医药等领域具有重要的应用价值^[2]。类菌孢素氨基酸广泛存在于海洋生物尤其是海洋藻类中, 但不同海藻中类菌孢素氨基酸含量差异显著, 例如, 从哥伦比亚加勒比海采集的红藻Bryocladia cuspidata中总类菌孢素氨基酸质量浓度高达15.93 mg/g(干质量), 而Hypnea cf. caraibica和Gracilaria tikvahiae等的质量浓度约为3 mg/g(干质量)^[3]; 从球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)中提取的类菌孢素氨基酸质量浓度可达9.143 mg/g^[4]。在众多海藻中, 红藻是类菌孢素氨基酸的重要来源, Sun等^[5]研究发现572种海洋大型海藻含有类菌孢素氨基酸, 其中红藻门(Rhodophytes)物种多达486种。

随着合成生物学的发展, 利用合成生物学方法也实现了多种类菌孢素氨基酸的合成^[6], 但从海藻中直接提取类菌孢素氨基酸具有独特优势: 海藻属天然来源, 符合消费者对“绿色”产品的偏好^[7]; 其养殖技术成熟, 原料供应稳定可持续; 提取工艺简单, 易于工业化生产。目前, 国外商用类菌孢素氨基酸主要从藻类中提取, 国内暂未见商用, 甚至购买类菌孢素氨基酸标准品都非常困难。影响类菌孢素氨基酸商业化应用的主要因素是制备成本高。因此, 如何充分利用我国丰富的藻类资源, 降低其制备成本, 对类菌孢素氨基酸商业化应用具有重要意义。

条斑紫菜(Pyropia yezoensis)是我国重要的经济红藻, 广泛栽培于我国黄海、东海和渤海沿岸, 其年产量居于世界前列, 是我国海水养殖业的支柱性物种之一^[8]。紫菜富含优质蛋白质、多糖、矿物质及多种功能性次级代谢产物^[9], 目前, 紫菜主要作为食品进行售卖, 但末期紫菜后期由于口感差, 大大影响了紫菜价格。实际上, 紫菜含类菌孢素氨基酸, 主要为porphyra-334、shinorine及mycosporine-glycine等3种(如图 1所示), 其中porphyra-334最高, 约占MAAs总量的60%以上^[10]。紫菜中类菌孢素氨基酸总质量浓度约为9.1 mg/g^[11], 这一数值远超多数红藻3~6 mg/g的常规范围, 在已报道的大型海藻中位居前列^[12]。紫菜因其巨大的养殖规模与较高的类菌孢素氨基酸含量, 被认为是规模化制备类菌孢素氨基酸的潜在优质生物资源。特别是以次等紫菜或废料为原料提取类菌孢素氨基酸, 不但能为类菌孢素氨基酸相关功能性产品的开发提供稳定可靠的原料来源, 还可进一步提高紫菜的利用价值。

目前, 提取类菌孢素氨基酸的常用方法是有机溶剂浸提法, 其中甲醇以其对类菌孢素氨基酸良好的溶解性能和高提取效率而被广泛应用^[13]。尽管已有研究对江蓠、坛紫菜等藻类中类菌孢素氨基酸的提取工艺进行了研究^[14], 但相关工艺依然存在提取率低、成本高等问题, 仍需要进一步优化。在优化类菌孢素氨基酸提取条件的研究中, 正交实验虽应用广泛, 能有效识别关键影响因素, 但其在解析因素间复杂交互作用及非线性关系方面仍存在一定局限^[15], 因此, 亟须研究利用新的模型方法优化类菌孢素氨基酸提取工艺。响应面法(response surface methodology, RSM)是一种结合统计学和数学建模的实验优化技术, 可通过有限实验数据, 构建优化模型。人工神经网络(artificial neural network, ANN)是人工智能技术领域的研究热点之一, 具有高容错性、智能化、自主学习等特点, 模拟处理工艺优化条件具有得天独厚的优势。这2种模型方法都能够通过建立高精度的数学模型, 有效揭示各因素之间的协同效应, 实现工艺参数的系统优化^[16-17]。响应面在类菌孢素氨基酸提取工艺优化特别是在紫菜中最优提取工艺的建立鲜有应用研究, 目前未见基于人工神经网络模型的类菌孢素氨基酸提取工艺优化研究的报道。

本研究将以条斑紫菜为原料, 在通过单因素实验探究提取温度、时间、料液比、提取次数及甲醇浓度对类菌孢素氨基酸提取率影响的基础上, 分别构建响应面模型与基于多层前馈神经网络的人工神经网络模型, 通过对比评估2种模型的预测精度与适用性来筛选最优提取条件, 建立一套高效的类菌孢素氨基酸提取工艺, 为条斑紫菜中类菌孢素氨基酸的资源化利用提供理论与技术支撑。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

新鲜的条斑紫菜采集于山东省青岛市即墨田横岛, 经无菌海水冲洗后沥干, 置于−80 ℃超低温冰箱中保存备用。Porphyra-334标准品由中国科学院海洋研究所海洋藻类分子生理与精准育种研究组分离纯化获得(纯度 > 90%); 甲醇(优级纯)购自国药集团化学试剂有限公司; 实验用水为超纯水。

1.2 主要仪器设备

紫外-可见分光光度计(日本岛津UV-1900); 恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司, DK-S24); 小型高速冷冻离心机(美国赛洛捷克公司, D3024R); 分析天平(瑞士梅特勒公司, PL602E); 旋涡混合器(塞洛捷克公司, MX-S); 全自动样品研磨机(上海净信实业发展有限公司, JX-FSTPRP-24)。

1.3 实验方法 1.3.1 Porphyra-334制备

Porphyra-334标准品由条斑紫菜中分离纯化获得。取新鲜的条斑紫菜, 经甲醇提取、离心收集上清液, 减压浓缩后加入适量80%无水乙醇, 于−20 ℃条件下醇沉6 h, 然后在4 ℃、8 000 r/min离心10 min, 收集上清液并于40 ℃减压蒸干。超纯水复溶后, 依次通过硅胶柱层析、反相柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析进行纯化, 冷冻干燥48 h, 得到高纯度porphyra-334标品。采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)和质谱(MS)对标准品进行纯度分析与结构鉴定, 其纯度 > 90%。

1.3.2 类菌孢素氨基酸的提取

称取冷冻保存的条斑紫菜0.5 g, 按设定料液比加入不同浓度的甲醇溶液, 使用全自动样品研磨机磨碎(研磨参数: 研磨频率70 Hz, 研磨时间50 s, 间歇时间10 s, 循环5次), 于恒温水浴中避光浸提。提取结束后, 冷却至室温, 于4 ℃、8 000 r/min离心10 min, 收集上清液^[18]。残渣重复提取设定次数, 合并提取液, 待测。

1.3.3 类菌孢素氨基酸含量的测定

参考Nikzad等^[19]的方法, 采用紫外分光光度法测定总类菌孢素氨基酸含量。取适量待测溶液, 以超纯水为空白, 在334 nm波长处测定吸光度值绘制标准曲线, 计算样品中总类菌孢素氨基酸含量。提取率计算公式为:

$ R(\%)=\frac{m_1}{m_2} \times 100\text{，} $

(1)

式中, ${m_1}$为提取的类菌孢素氨基酸质量, g; ${m_2}$为新鲜紫菜质量, g; R为提取率, %。

1.3.4 标准曲线绘制

紫菜中类菌孢素氨基酸主要包括porphyra-334、shinorine及mycosporine-glycine等3种, 其中porphyra-334和shinorine的最大吸收波长均为334 nm, 而mycos­porine-glycine含量较少。因此, 本研究采用porphyra-334为标准品, 虽存在一定误差, 但在334 nm波长处测定的吸光度可真实反映类菌孢素氨基酸中主要成分的含量变化。

精确称取1 mg的porphyra-334标准品, 用超纯水溶解并定容至1 mL, 得到1 mg/mL的储备液。将porphyra-334标准液用超纯水进行梯度稀释, 得到质量浓度0.000 1、0.000 5、0.001、0.005、0.01、0.05 mg/mL的系列浓度溶液。以超纯水为参比溶液, 在334 nm处测定类菌孢素氨基酸溶液的吸光度, 绘制标准曲线, 得到回归方程。每个浓度平行测定3次取平均值。以质量浓度(C, mg/mL)为横坐标, 吸光度(A_{334 nm})为纵坐标绘制标准曲线, 得到porphyra-334的线性方程为: A_{334 nm}=88.779 C+0.005 1, R²为0.999 5, 可见porphyra-334浓度在0.000 1~0.05 mg/mL之间时, 峰面积与浓度的线性关系非常良好。

1.3.5 单因素实验设计

各因素水平范围基于前期预实验及相关文献确定^{[18, 20-21]}, 分别考察提取温度(20、30、40、50、60 ℃)、提取时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)、甲醇浓度(10%、20%、30%、40%、50%)及提取次数(1、2、3、4、5次)对类菌孢素氨基酸提取率的影响。每次实验仅改变1个因素, 其他因素固定为: 温度40 ℃、时间2 h、料液比1∶20、甲醇浓度20%、提取2次。每组实验重复3次, 结果以均值±标准差表示。

1.3.6 响应面优化设计

基于单因素实验结果, 选取提取温度(A)、浸提时间(B)、料液比(C)、提取次数(D)和甲醇浓度(E)5个因素。采用五因素三水平的响应面设计, 以类菌孢素氨基酸提取率(R)为响应值, 进行响应面优化实验。因素水平编码见表 1。

1.3.7 人工神经网络数据模型

本研究基于响应面设计获得的实验数据, 构建一个包含输入层(5个神经元, 对应提取温度、时间、料液比、甲醇浓度和提取次数)、隐藏层(32个神经元, ReLU激活函数)和输出层(1个神经元, 预测类菌孢素氨基酸提取率)的三层前馈神经网络模型, 其中加入dropout层(丢弃率0.2)以防止过拟合, 模型总参数量为2 497个。全部27组数据在归一化处理后, 按7∶2∶1的比例划分为训练集、验证集和测试集, 模型采用adam优化器(学习率0.001)进行训练, 并辅以早停策略和L2正则化, 通过网格搜索确定最优超参数组合。模型性能采用R²、RMSE和MAE指标评估, 并利用置换重要性方法量化各工艺参数对预测结果的贡献度。

1.3.8 数据处理

采用Design-Expert 13.0和SPSS 13.0对实验数据进行统计分析, 采用Origin 2018绘制图像。

2 结果与讨论 2.1 单因素实验 2.1.1 提取温度的影响

提取温度是影响类菌孢素氨基酸提取效率的关键因素之一。如图 2(a)所示, 条斑紫菜中类菌孢素氨基酸的提取率随温度变化呈现先升高后趋于平稳的趋势。当温度从20 ℃升至40 ℃时, 提取率显著提升, 从0.26%增至0.34%, 表明适当升高温度有利于增强溶剂分子动能, 促进类菌孢素氨基酸从紫菜组织中的溶出与扩散。然而, 当温度继续升至50 ℃和60 ℃时, 提取率维持在0.33%~0.34%之间, 没有明显升高。这可能是由于高温导致类菌孢素氨基酸降解, 溶剂挥发加剧, 以及溶解平衡限制, 这些因素共同限制了提取率的上升^[4]。此外, 高温可能导致紫菜基质中其他杂质溶出增加, 影响提取选择性。因此, 提取温度对类菌孢素氨基酸提取率的影响存在明显的阈值效应, 最佳提取温度宜控制在40 ℃附近, 以实现提取效率与稳定性的平衡。

2.1.2 提取时间的影响

提取时间对类菌孢素氨基酸提取效率的影响如图 2(b)所示, 在0.5~2.0 h范围内, 提取率随提取时间的延长呈显著上升趋势, 从0.18%提升至0.30%(增幅约66.7%), 这主要得益于较长的提取时间有利于溶剂向紫菜组织内部渗透, 促进类菌孢素氨基酸从细胞结构中的释放与溶解, 该现象与Xu等^[11]在红藻类菌孢素氨基酸提取研究中观察到的溶出动力学规律相近。当提取时间超过2.0 h(如延长至2.5 h)后, 提取率仅微增至0.31%, 增长趋势明显趋缓, 表明此时可提取类菌孢素氨基酸已基本溶出, 进一步延长提取时间并没有显著提高提取率, 同时还增加工艺能耗与时间成本。因此, 提取时间控制在2.0 h左右可在保证较高提取效率的同时兼顾工艺经济性。

2.1.3 料液比的影响

从图 2(c)可以看出, 类菌孢素氨基酸提取率随料液比增大而提高, 在1∶20时达到峰值(0.24%), 之后进入平台期, 继续增大溶剂用量至1∶30, 提取率未进一步提升。这表明在1∶20的料液比下, 溶剂已足以充分浸润和提取样品中的目标成分, 继续增加溶剂并未带来提取效益的提升, 反而可能导致后续浓缩工序能耗增加和溶剂浪费^[22]。这一现象与Sun等^[23]在红藻类菌孢素氨基酸提取中的发现相似, 即适当的料液比有助于提取率升高, 但超过临界点后, 提取率可能会受溶质在细胞内的扩散速率限制, 而非溶剂体积。因此, 在实际工艺优化中, 选择1∶20至1∶25的料液比, 在保证提取效率的同时兼顾经济性与环保性。

2.1.4 提取次数的影响

提取次数对提取效率的影响如图 2(d)所示。当提取次数从1次增加到2次时, 类菌孢素氨基酸提取率从0.18%显著提升至0.24%, 增幅达33.3%; 继续增加至3次时, 提取率仅微增至0.25%, 此后维持平台期。这表明大部分类菌孢素氨基酸(约96%)在前2次提取中已被有效释放, 后续提取的效率明显递减。初期提取主要溶解的是容易释放的游离态和弱结合态成分, 提取效率高; 后期则需要克服较强的分子间作用力, 提取难度增大, 效率下降。因此, 从提取效率、时间成本和溶剂消耗综合考量, 2次提取是最优选择, 既保证了较高的提取率, 又符合绿色提取的原则。

2.1.5 甲醇浓度的影响

甲醇浓度对提取效率的影响如图 2(e)所示。当甲醇浓度从10%提高到20%时, 类菌孢素氨基酸提取率从0.29%大幅增至0.44%; 但继续提高浓度至30%~ 50%, 提取率反而轻微下降至0.41%~0.43%。这一结果表明, 20%的甲醇浓度已达到该体系中类菌孢素氨基酸溶解度和细胞渗透性的最优平衡点。低浓度甲醇可能因极性过高而无法有效提取部分疏水性类菌孢素氨基酸类似物, 而过高浓度则可能因溶剂极性降低、细胞脱水过快导致蛋白质变性包裹目标成分, 反而阻碍提取^[24]。这与Chaves-Peña^[25]等的研究结论相似, 他们发现采用20%的甲醇水溶液提取类菌孢素氨基酸, 其提取效果优于100%的甲醇。这与本研究观察到的趋势相吻合。因此, 20%甲醇浓度可作为提取优化的最优选择。

2.2 响应面模型建立与数据分析 2.2.1 回归方程

响应面实验设计及结果见表 2。通过多元二次回归拟合, 得到类菌孢素氨基酸提取率(R)与各因素之间的回归方程:

$ \begin{aligned} R= & 0.445\;3-0.020\;2 A+0.050\;3 B+0.057\;9 C+0.016\;6 D+ \\ & 0.010\;8 E+0.019\;3 A B+0.022\;8 A C+0.020\;2 A D- \\ & 0.056\;1 A E+0.026\;0 B C+0.004\;9 B D-0.014\;8 B E+ \\ & 0.010\;9 C D-0.002\;2 C E-0.034\;6 D E-0.048\;6 A^2- \\ & 0.032\;8 B^2-0.039\;5 C^2-0.067\;3 D^2-0.049\;5 E^2 . \end{aligned}$

(2)

二次拟合方程表示影响提取率的五因素显著性比较关系为C > B > A > D > E, 即料液比 > 时间 > 温度 > 提取次数 > 甲醇浓度。

2.2.2 方差分析

方差分析结果表明, 模型总P值＜0.000 1、F值为24.63, 表明回归模型极显著。各因素中, 温度(A)、时间(B)、料液比(C)、提取次数(D)的P值分别为0.000 4、＜0.000 1、＜0.000 1、0.002 4, 均达极显著水平(P＜0.01); 甲醇浓度(E)P值为0.036 5, 达到显著水平(P＜0.05)。交互项中, 温度与料液比(AC)、温度与提取次数(AD)、时间与料液比(BC)、提取次数与甲醇浓度(DE)的P值分别为0.028 0、0.049 3、0.013 6、0.0016, 均达到显著水平; 温度与甲醇浓度(AE)的P值＜0.000 1, 为极显著水平。二次项A²、B²、C²、D²、E²的P值均小于0.001, 为极显著水平。失拟项P值为0.199 2(> 0.05), 不显著, 表明模型拟合良好。模型决定系数R²=0.951 7, 调整决定系数Adj R²=0.913 1, 预测决定系数Pre R²=0.819 6, 变异系数CV=5.40%, 标准差为0.019 6, 均值0.362 7, 说明模型预测值与实测值吻合度高, 可用于类菌孢素氨基酸提取率的分析和预测。

2.2.3 响应面分析

不同提取条件对提取率的交互影响如图所示。其中R为提取率, A为温度, B为时间, C为料液比, D为提取次数, E为甲醇浓度。图 3(a)为温度与时间对提取率的影响, 图 3(b)为温度与料液比对提取率的影响, 图 3(c)为温度与提取次数对提取率的影响, 图 3(d)为温度与甲醇浓度对提取率的影响, 图 3(e)为时间与料液比对提取率的影响, 图 3(f)为时间与提取次数流速对提取率的影响, 图 3(g)为时间与甲醇浓度对提取率的影响, 图 3(h)为料液比与提取次数对提取率的影响, 图 3(i)为料液比与甲醇浓度对提取率的影响, 图 3(j)为提取次数与甲醇浓度对提取率的影响。

根据图 3(a)可知, 在温度与时间的交互作用下, 提取率的变化呈现不同趋势。随温度升高, 提取率先增后降, 在40 ℃左右达到峰值0.45%; 随时间延长, 提取率则先增后趋于平缓, 在约1.5 h时进入平台期, 对应提取率亦接近0.45 %。总体而言, 温度与时间对提取率均表现为正效应, 其中在考察的温度区间内, 提取率的增幅大于降幅; 根据图 3(b)可知, 温度与料液比的交互作用显著。在该交互作用下, 二者对提取率的影响均为正效应。其中, 在设定的料液比区间内, 增大料液比有助于提高提取率, 当料液比为1∶20时, 提取率的增长开始趋于平缓; 根据图 3(c)可知, 在温度与提取次数的交互作用下, 二者对提取率的影响呈现相似的趋势, 交互效应显著。随着提取次数的增加, 提取率先快速上升, 在约2次时达到峰值0.45 %, 之后增长趋于减缓。从响应曲面的几何特征来看, 其切面坡度由缓变陡, 对应切线斜率呈先减小后增大的变化规律; 根据图 3(d)可知, 提取率在料液比与甲醇浓度的交互影响下, 当甲醇浓度值约为20%时有提取率近似取得最佳效果, 这时值约为0.45%, 二者交互作用极显著。根据图 3(e)可知, 在时间与料液比的交互作用下, 二者对提取率均呈正效应, 且作用效果相似: 提取率均随因素的增加呈现先上升后趋于平缓的变化趋势; 根据图 3(f)可知, 时间与提取次数的交互作用对提取率产生正向影响, 二者均表现为正效应。其中, 时间因素的影响显著性优于提取次数; 根据图 3(g)可知, 提取率在时间与甲醇浓度的交互影响下, 相较于甲醇浓度, 时间对其增长的促进作用更为显著; 根据图 3(h)可知, 提取率在料液比与提取次数的交互影响下, 响应曲面为凸形, 可求得提取率的最大值; 根据图 3(i)可知, 提取率在料液比与甲醇浓度的交互影响下, 提取率受料液比的影响效果更为显著, 在二者影响下, 其增长的显著性分别表现为最强与最弱; 根据图 3(j)可知, 提取率在料液比与甲醇浓度的交互影响下, 二者交互作用效果显著。

图 4为5个因素在响应面下对提取率交互作用影响的等高线图。响应点位于图中红色处, 可预测计算得到提取率的最大值。根据Design-Expert软件计算结果可知, 当温度大小为42.032 ℃、时间大小为1.51 h、料液比大小为1∶24.91、提取次数为1.414次、甲醇浓度为19.965%时, 有提取率最大值为0.475%。考虑到实际实验可控制性, 取温度大小为42 ℃、时间大小为1.51 h、料液比大小为1∶25、提取次数为2次、甲醇浓度为20%时, 有预测提取率最大值为0.475%。

2.2.4 模型验证

在最优条件下进行3次验证实验, 类菌孢素氨基酸提取率分别为0.461%、0.460%、0.470%, 平均值为0.464%, 与预测值相对误差为2.32%, 说明模型可靠, 工艺重复性好。本研究优化条件下条斑紫菜类菌孢素氨基酸提取率为0.464%(4.64 mg/g干质量), 提取率较高。与其他藻类相比, de la Coba等^[18]从红藻Porphyra umbilicalis中提取类菌孢素氨基酸的回收率约为3~5 mg/g; Sinha等^[26]综述表明, 多数红藻类菌孢素氨基酸质量浓度在2~8 mg/g范围。本研究的提取率(4.64 mg/g)处于该范围的上限, 且提取条件温和(42 ℃、1.51 h、20%甲醇), 具有较好的经济性和可操作性。本研究以总类菌孢素氨基酸计, 而部分研究采用HPLC对各单体分别定量, 造成一定含量差异。后续研究可考虑采用HPLC法对porphyra- 334、shinorine等单体分别定量, 以获得更精确的组成信息。

2.3 人工神经网络建模与数据分析 2.3.1 模型结构与性能评估

本研究构建的多层感知器神经网络包含一个具有64个神经元的输入层、一个含32个神经元的隐藏层及一个输出层, 总参数量为2 497个。模型在训练过程中表现出良好的收敛性, 训练损失与验证损失随迭代次数增加呈稳定下降趋势, 并在约250轮后趋于平稳, 未出现明显的过拟合现象(图 5)。

最终模型在训练集、验证集和测试集上的决定系数(R²)分别为0.945 5、0.932 0和0.864 1, 均方根误差(RMSE)相应为0.015 89、0.012 36和0.025 86(表 4)。这些指标表明, 该神经网络模型对类菌孢素氨基酸提取工艺具有良好的拟合能力和预测精度, 能够较好地反映提取参数与提取率之间的非线性关系。

2.3.2 特征重要性分析

通过置换特征重要性分析, 本研究量化了各提取参数对类菌孢素氨基酸提取率的相对影响程度(图 6)。结果表明, 料液比对提取率的影响最为显著(重要性得分0.639), 其次是提取时间(0.428)和甲醇浓度(0.270), 而提取次数(0.258)与提取温度(0.247)的影响相对较小。这一排序与单因素实验中观察到的趋势基本一致, 但神经网络模型进一步揭示了各因素间复杂的协同效应。料液比的高度重要性说明溶剂体积是决定类菌孢素氨基酸从细胞基质中溶出效率的关键限制因素。足够的溶剂可建立有效的浓度梯度, 促进传质过程, 但过大的料液比可能导致后续浓缩工序能耗增加, 这与经济性考量形成平衡。提取时间的重要性居次, 表明延长提取时间有利于类菌孢素氨基酸的充分释放, 但需避免过长时间导致的热降解或溶剂损失风险。

2.3.3 模型验证

与传统的二次多项式响应面模型相比, 人工神经网络模型在测试集上表现出了更高的预测值(提取率0.477 4)。提取条件分别为: 温度50 ℃、时间2 h、料液比1∶25、提取次数3次、甲醇浓度14.47%。在此条件下进行3次验证实验, 类菌孢素氨基酸提取率分别为0.285 5%、0.290 6%、0.309 2%, 平均值为0.295 1%, 与预测值相对误差为38.2%。

此外, 人工神经网络模型在训练集与验证集上表现出较高的拟合优度(R² > 0.93), 但其在独立测试集上的预测误差较大(相对误差达38.2%)。为更全面评估2种模型的泛化能力, 本研究进一步比较了二者在多个预测点上的表现。采用留一法交叉验证对两种模型进行测试, 结果显示: 响应面模型的平均预测相对误差为5.8%, 而ANN模型的平均预测相对误差为12.4%; 在5个随机选取的验证点中, 响应面模型的预测值与实测值的相关系数(R)为0.943, 高于ANN模型的0.876。这一结果与文献报道的趋势一致, Singh等^[27]在发酵培养基优化研究中发现, RSM的平均预测误差为8%, 而ANN为2%, 但该研究中ANN采用了遗传算法优化且训练样本量较大(n=50); Gendy等^[28]在燃烧器火焰温度预测研究中, ANN的R²(0.964~0.987)优于RSM(0.868~0.947), 但该研究同样使用了较大规模的数据集。这表明ANN的性能高度依赖于样本量, 在小样本条件下, 基于多项式回归的RSM模型更为稳健。本研究中ANN预测误差较大, 可能由于实验样本量有限(n=20), 导致模型出现过拟合。尽管如此, ANN的特征重要性分析仍具参考价值, 其结果显示料液比(重要性得分0.639)和提取时间(0.428)对提取率的影响最为显著, 与响应面分析结论一致。

3 结论与展望

本研究在单因素实验考察基础上设计构建了响应面模型和人工神经网络模型, 系统考察了提取温度、时间、料液比、提取次数及甲醇浓度对条斑紫菜中类菌孢素氨基酸提取率的影响, 并对2种模型方法进行了比较分析和验证。结果表明, 各因素对提取率的影响程度排序为料液比 > 提取时间 > 温度 > 提取次数 > 甲醇浓度, 其中料液比与提取时间为关键控制参数; 确定最佳提取工艺为: 温度42 ℃、时间1.51 h、料液比1∶25(g/mL)、提取2次、甲醇浓度20%, 在此条件下提取率达0.464%(湿质量)。该工艺在接近室温、较短时间和较低甲醇浓度条件下实现良好提取效果。

然而, 本研究尚存在一定局限性, 未来研究可进一步增加模型训练数据量, 以提升人工神经网络模型的泛化能力, 探索ANN与遗传算法等优化算法结合的可能性。在现有优化工艺基础上进一步放大样品量, 考察工艺在更大规模下的提取效率和稳定性, 探索规模化制备工艺条件。该研究将为条斑紫菜中类菌孢素氨基酸的制备和利用提供重要参考。