海洋科学  2025, Vol. 49 Issue (2): 15-24   PDF    
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240821001

文章信息

邓家珍, 彭翰阳, 曾艳波. 2025.
DENG Jiazhen, PENG Hanyang, ZENG Yanbo. 2025.
黑指纹海兔Aplysia dactylomela中的萜类化合物及其抗炎和细胞毒活性
Terpenoids with anti-inflammatory and cytotoxicity activities from the sea hare Aplysia dactylomela
海洋科学, 49(2): 15-24
Marine Sciences, 49(2): 15-24.
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240821001

文章历史

收稿日期：2024-08-21
修回日期：2024-11-10
引用本文
邓家珍, 彭翰阳, 曾艳波. 2025. 黑指纹海兔Aplysia dactylomela中的萜类化合物及其抗炎和细胞毒活性[J]. 海洋科学, 49(2): 15-24.
DENG Jiazhen, PENG Hanyang, ZENG Yanbo. 2025. Terpenoids with anti-inflammatory and cytotoxicity activities from the sea hare Aplysia dactylomela[J]. Marine Sciences, 49(2): 15-24.
黑指纹海兔Aplysia dactylomela中的萜类化合物及其抗炎和细胞毒活性
邓家珍1,2, 彭翰阳2,3, 曾艳波1,2     
1. 海南大学 海洋生物与水产学院, 海南 海口 570228;
2. 中国热带农业科学院 热带生物技术研究所 海南省海洋生物资源功能性成分研究与利用重点实验室, 海南 海口 571101;
3. 南京中医药大学 药学院, 江苏 南京 210023
收稿日期：2024-08-21；修回日期：2024-11-10
基金项目：国家自然科学基金(41776093); 中国热带农业科学院国家热带农业科学中心科技创新团队项目(CATASCXTD202416)
作者简介：邓家珍(2000—), 女, 广西玉林人, 硕士研究生, 从事海洋天然产物研究, E-mail: 22210707030020@hainanu.edu.cn.
通信作者：曾艳波(1977—), 通信作者, 男, 湖南益阳人, 博士, 副研究员, 主要从事海洋天然产物研究, E-mail: zengyanbo@itbb.org.cn.
摘要：本研究首次以中国三沙市七连屿的黑指纹海兔Aplysia dactylomela为研究对象, 对其化学成分及生物活性进行研究。运用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析和半制备型高效液相色谱等分离技术对黑指纹海兔A. dactylomela的次生代谢物进行分离纯化, 结合核磁共振波谱和质谱等波谱数据, 并与文献数据进行比对, 对所分离到的化合物进行结构鉴定。从黑指纹海兔A. dactylomela中分离鉴定了11个化合物, 其结构分别鉴定为: palisadin A (1)、(−)-aplysistatin (2)、5β-acetoxypalisadin A (3)、5-acetoxypalisadin B (4)、luzodiol (5)、pileaterpene C (6)、isoaplysin-20 (7)、isoconcinndiol (8)、cis-pachydictyol B (9)、dictytriol (10) 和brevisnoside A (11)。其中, 化合物1~5、7~8为溴化萜类化合物, 化合物6、9~11为萜类化合物。抗炎和细胞毒活性测试结果显示, 化合物1~4、6和10均具有不同程度的抗炎活性, 且无细胞毒性。其中化合物2(IC50值为(3.42±0.25) µmol/L)的抗炎活性比阳性对照槲皮素的抗炎活性(IC50值为(9.98±1.14) µmol/L)更强。化合物1和4对人慢性髓原白血病细胞(K562)具有中等抑制作用, 其IC50值分别为(27.82±0.06)和(19.99±1.96) µmol/L。
关键词：黑指纹海兔    化学成分    溴化萜类化合物    抗炎活性    细胞毒活性    
Terpenoids with anti-inflammatory and cytotoxicity activities from the sea hare Aplysia dactylomela
DENG Jiazhen1,2, PENG Hanyang2,3, ZENG Yanbo1,2     
1. College of Marine Biology and Fisheries, Hainan University, Haikou 570228, China;
2. Hainan Provincial Key Laboratory for Functional Components Research and Utilization of Marine Bio-resources, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China;
3. College of Pharmaceutical Sciences, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
Received: Aug. 21, 2024
Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 41776093; Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences for Science and Technology Innovation Team of National Tropical Agricultural Science Center, No. CATASCXTD202416
Abstract: This study investigated the chemical components and their biological activities of the sea hare Aplysia dactylomela, which was collected from Qi Lian Yu, Sansha, Hainan. The secondary metabolites of A. dactylomela were isolated and purified through silica gel chromatography, octadecylsilyl, Sephadex LH-20 gel column chromatography, and semipreparative high-performance liquid chromatography. Their structures were identified by nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry data and compared with literature data. Eleven terpenoids were identified from the sea hare A. dactylomela, including palisadin A (1), (−)-aplysistatin (2), 5β-acetoxypalisadin A (3), 5-acetoxypalisadin B (4), luzodiol (5), pileaterpene C (6), isoaplysin-20 (7), isoconcinndiol (8), cis-pachydictyol B (9), dictytriol (10), and brevisnoside A (11). The results of anti-inflammatory and cytotoxicity activity tests showed that compounds 1–4, 6, and 10 had different levels of anti-inflammatory activity and no cell toxicity. Specifically, the anti-inflammatory activity of compound 2 (with an IC50 value of (3.42 ± 0.25) µmol/L) was more pronounced than the anti-inflammatory activity of positive control quercetin (with an IC50 value of (9.98 ± 1.14) µmol/L). Compounds 1 and 4 had medium cytotoxicity activity on human chronic myeloid leukemia cells (K562), with IC50 values of (27.82 ± 0.06) and (19.99 ± 1.96) µmol/L, respectively.
Key words: Aplysia dactylomela    chemical constituent    terpenoid bromide    anti-inflammatory activity    cytotoxicity activity    

海洋是地球上最为广阔且复杂的生态系统, 其高盐等特殊的环境使得海洋天然产物具有结构多元化、生物活性显著和成药性强的特点[1]。据文献统计, 约56%的新海洋天然产物具有抗癌活性, 13%的新海洋天然产物具有抗菌活性[2]。海兔是海洋中的软体动物, 种类丰富, 色彩艳丽, 加上无坚固的外壳保护, 为了能在海洋环境中生存, 海兔选择性地食用海藻, 通过积累卤化次生代谢产物形成的化学防御机制来保护自己。更为精妙的是, 这些代谢物以天然产物存在的形式主要集中在海兔的体表, 并没有被内部转化, 这种分布方式不仅使得海兔能够迅速将这些代谢物排泄到其分泌的黏液中, 同时也避免了海兔自身受到这些代谢物毒性的影响[3]。这种化学防御机制为人类从海洋中寻求具有生物活性的化合物提供了一条高效的途径[4]。

黑指纹海兔(Aplysia dactylomela), 属软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、后鳃亚纲(Opis­thobranchia)、无循目(Anaspide)、海兔科(Aplysiidae), 是海洋无脊椎动物中卤化次生代谢物最丰富的来源之一[5]。据文献记载, 目前已经从黑指纹海兔A. dactylomela中分离出来许多次生代谢物, 包含了萜类、肽类、C-15醚脂类、大环内酯类、甾醇、生物碱等化合物[6-8], 这些化合物的生物活性显著, 例如肿瘤细胞毒活性[9-12]、体外抗神经炎活性[13]和抗炎活性等[14]。

为了进一步了解黑指纹海兔A. dactylomela的活性成分, 本文首次以三沙市七连屿水域的黑指纹海兔A. dactylomela为研究对象, 综合运用正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析以及半制备高效液相色谱(semi-preparative high performance liquid chromatography, Semi-Prep HPLC)等分离技术对黑指纹海兔A. dactylomela的甲醇提取物进行分离鉴定, 从中得到了11个化合物(化合物1~11)(图 1), 并对这11个化合物进行了抗炎和细胞毒活性测试。

图 1 化合物1~11的结构 Fig. 1 Structures of compounds 1–11
图选项
1 材料与方法 1.1 实验材料

黑指纹海兔样品由中国热带农业科学院热带生物技术研究所曾艳波副研究员于2022年9月在海南省三沙市七连屿采集, 经中国热带农业科学院热带生物技术研究所曾艳波副研究员鉴定为Aplysia dactylomela, 该样品存放在中国热带农业科学院热带生物技术研究所(编号为22-XS-1)。

1.2 主要仪器与试剂

实验过程中用到的仪器和试剂见表 1。

表 1 实验所用的材料信息表 Tab. 1 Experimental material information
仪器试剂 型号/规格 来源
旋转蒸发仪 N-1210BS-WB 东京理化器械株式会社
分析型高效液相色谱仪 Agilent 1260 美国安捷伦公司
超导核磁共振仪 BRUKER AVANCE Ⅲ-500 德国Bruker公司
质谱仪(Bruker) Autospec 300 上海昕仪仪表有限公司
全波长酶标仪 Synergy HT 日本Nacalai Tesque公司
旋光仪 MCP 5100 美国BIOTEK公司
甲醇 色谱纯 天津康科德科技有限公司
丙酮 分析纯 广东西陇科学有限公司
石油醚等有机溶剂 工业级重蒸 西陇科学股份有限公司
薄层硅胶板 GF254 青岛海洋化工有限公司
柱色谱用硅胶 60~80、200~300、300~400目 青岛海洋化工有限公司
顺铂 B21M11L110000 上海源叶生物科技有限公司
Sephadex LH-20葡聚糖凝胶 德国Merck公司
半制备高效液相色谱仪 南京元宝峰医药科技公司
氘代试剂 腾龙微波科技有限公司
人慢性髓原白血病细胞(K562) 中国科学院生命科学研究院细胞库
人肝癌细胞(BEL-7402) 中国科学院生命科学研究院细胞库
人胃癌细胞(SGC-7901) 中国科学院生命科学研究院细胞库
人肺癌细胞(A549) 中国科学院生命科学研究院细胞库
人宫颈癌细胞(Hela) 中国科学院生命科学研究院细胞库
RAW 264.7(小鼠细胞) 中国科学院生命科学研究院细胞库
表选项
1.3 实验方法 1.3.1 提取与分离

化合物提取和分离流程如图 2所示。

图 2 黑指纹海兔Aplysia dactylomela的化学成分提取与分离流程图 Fig. 2 Flowchart for the extraction and separation of Aplysia dactylomela
图选项

将冷冻干燥的样品切碎后, 甲醇超声提取, 浓缩后得甲醇粗提物, 依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次, 得到各相萃取物。将石油醚部分(1 106.0 g)用正相硅胶柱层析, 以石油醚–乙酸乙酯(体积比为1∶0~0∶1)、二氯甲烷–甲醇(体积比为9∶1、0∶1)梯度洗脱, 按极性由小到大分别为14个流分。

Fr. 5 (76.0 g)用甲醇溶解, 取少量, 经Semi-Prep HPLC(甲醇–纯水, 体积比为70∶30)得到化合物1 (1 14.2 mg, tR=17.2 min, 流速: 3 mL/min)和化合物4 (17.3 mg, tR=23.8 min, 流速: 3 mL/min)。

Fr. 6 (48.0 g)用甲醇溶解后, 取少量, 经Semi-Prep HPLC(甲醇–纯水, 体积比为70∶30)得到化合物2 (145.7 mg, tR=12.8 min, 流速: 3 mL/min)。

Fr. 10 (10.0 g)经反相硅胶柱层析, 甲醇–水(体积比为10%~100%)梯度洗脱, 得35个流分(Fr. 10A~ Fr. 10Y、Fr. 10YA~Fr. 10YJ), 第13个流分Fr. 10M (408.0 mg)经Sephadex LH-20柱层析、正相硅胶柱层析和Semi-Prep HPLC(甲醇–纯水, 体积比为65∶35)得到化合物6 (5.5 mg, tR=31.0 min, 流速: 3 mL/min)。第14个流分Fr. 10N (182.6 mg)经Sephadex LH-20柱层析、正相硅胶柱层析和Semi-Prep HPLC(甲醇–纯水, 体积比为70∶30), 得到化合物3 (2.0 mg, tR=22.0 min, 流速: 3 mL/min)。第21个流分Fr. 10U (503.2 mg)经Sephadex LH-20柱层析、经正相硅胶柱层析和Semi-Prep HPLC(甲醇–纯水, 体积比为80∶20)得到化合物5 (5.0 mg, tR=20.0 min, 流速: 3 mL/min)。

Fr. 12 (32.0 g)经反相硅胶柱层析柱, 甲醇–水(体积比为10%~100%)梯度洗脱, 得13个流分(Fr. 12A~Fr. 12M), 第4个流分Fr. 12D (3 416.5 mg)经Sephadex LH-20柱层析、正相硅胶柱层析和Semi-Prep HPLC (甲醇–纯水, 体积比为73∶27)得到化合物10 (1.0 mg, tR=20.9 min, 流速: 3 mL/min); 第3个流分Fr. 12D4E3 (56.4 mg)经反复的正相硅胶柱层析后, 经Semi-Prep HPLC(甲醇–纯水, 体积比为65∶35)得到化合物11 (2.4 mg, tR=24.4 min, 流速: 3 mL/min)。第6流分Fr. 12D4E3F (11.3 mg)经Semi-Prep HPLC(甲醇–纯水, 体积比为70∶30)得到化合物9 (4.4 mg, tR=15.8 min, 流速: 3 mL/min)。第6个流分Fr. 12F(2 019.6 mg)经Sephadex LH-20柱层析, 正相硅胶柱后重结晶得到化合物8 (23.9 mg)。第7个流分Fr. 12G (1 750.1 mg)经Sephadex LH-20柱层析, 正相硅胶柱后重结晶得到化合物7 (11.9 mg)。

1.3.2 抗炎活性测试方法

采用Griess法测定上述化合物对脂多糖(lipopolysaccharides, 以下简称LPS)刺激下的RAW264.7细胞释放NO的抑制作用。具体实验步骤和计算方法与文献[15]一致。

1.3.3 细胞毒活性测试方法

采用四唑盐比色法(MTT)测试上述化合物对人慢性髓原白血病细胞(K562)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人胃癌细胞(SGC-7901)、人肺癌细胞(A549)和人宫颈癌细胞(Hela)的体外细胞毒活性。具体实验步骤和计算方法与文献[16]一致。

2 结果与分析 2.1 结构鉴定

化合物1: 白色不定型固体, HRESIMS m/z 337.0774和339.0749 [M+Na]+ (计算值: C15H2379BrO2Na, 337.0774和C15H2381BrO2Na, 339.0753); [α]D25 =+30.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 3.41(1H, t, J=8.3 Hz, H-1a), 4.04(1H, t, J=8.1 Hz, H-1b), 4.82(1H, br s, H-2), 5.52(1H, m, H-4), 2.24(1H, m, H-5a), 2.34(1H, m, H-5b), 2.05(1H, d, J=10.5 Hz, H-6), 1.53(1H, dt, J=13.0, 3.5 Hz, H-8a), 1.78(1H, m, H-8b), 2.24(1H, m, H-9a), 2.08(1H, m, H-9b), 3.93(1H, dd, J=12.7, 4.4 Hz, H-10), 4.35(2H, q, J=12.9 Hz, H-12), 1.25(3H, s, H-13), 0.91(3H, s, H-14), 1.14(3H, s, H-15); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 72.0(C-1), 70.1(C-2), 141.9(C-3), 121.2(C-4), 26.4(C-5), 51.8(C-6), 78.0(C-7), 37.6(C-8), 32.8(C-9), 66.4(C-10), 41.0(C-11), 71.1(C-12), 22.0(C-13), 18.0(C-14), 30.9(C-15)。以上数据与文献[17]报道基本一致, 因此确定化合物1为palisadin A。

化合物2: 白色不定型固体, HRESIMS m/z 351.0580和353.0565 [M+Na]+ (计算值: C15H2179BrO3Na, 351.0566和C15H2181BrO3Na, 353.0546); [α]D25=−21.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 4.47(1H, t, J=8.8 Hz, H-1a), 3.85(1H, dd, J=9.0, 7.2 Hz, H-1b), 5.12(1H, m, H-2), 6.93(1H, dt, J=5.5, 2.6 Hz, H-4), 2.54(2H, m, H-5), 2.04(1H, dd, J=9.4, 2.4 Hz, H-6), 1.59(1H, dt, J=13.1, 3.5 Hz, H-8a), 1.78(1H, td, J=13.3, 3.9 Hz, H-8b), 2.10(1H, td, J=13.3, 3.8 Hz, H-9a), 2.26(1H, dq, J=14.0, 4.1 Hz, H-9b), 3.92(1H, dd, J=12.8, 4.4 Hz, H-10), 1.27(3H, s, H-13), 0.94(3H, s, H-14), 1.16(3H, s, H-15); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 70.0(C-1), 66.8(C-2), 132.0(C-3), 143.2(C-4), 27.3(C-5), 51.2(C-6), 79.1(C-7), 37.7(C-8), 32.5(C-9), 65.3(C-10), 41.1(C-11), 169.2(C-12), 21.8(C-13), 18.1(C-14), 30.8(C-15)。以上数据与文献[18]报道基本一致, 因此确定化合物2为(−)-aplysistatin。

化合物3: 无色油状, HRESIMS m/z 395.0830和397.0896 [M+Na]+ (计算值: C17H2579BrO4Na, 395.082 8和C17H2581BrO4Na, 397.080 8); [α]D25=−75.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 3.55(1H, t, J=8.5 Hz, H-1a), 4.14(1H, t, J=8.2 Hz, H-1b), 4.78(1H, t, J=8.0 Hz, H-2), 5.66(1H, dd, J=5.9, 2.1 Hz, H-4), 5.99(1H, d, J=6.1 Hz, H-5), 1.99(1H, s, H-6), 1.46(1H, dt, J=13.0, 3.6 Hz, H-8a), 1.86(1H, td, J=13.3, 3.9 Hz, H-8b), 2.19(1H, m, H-9a), 2.29(1H, dq, J=12.0, 4.1 Hz, H-9b), 3.93(1H, dd, J=12.7, 4.5 Hz, H-10), 4.43(2H, q, J=14.0 Hz, H-12), 1.61(3H, s, H-13), 1.05(3H, s, H-14), 1.2(3H, s, H-15), 2.11(3H, s, H-17); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 72.0(C-1), 69.8(C-2), 148.3(C-3), 119.0(C-4), 70.5(C-5), 53.8(C-6), 78.3(C-7), 39.7(C-8), 32.7(C-9), 66.9(C-10), 41.9(C-11), 70.5(C-12), 25.4(C-13), 18.9(C-14), 31.2(C-15), 170.4(C-16), 21.5(C-17)。以上数据与文献[19]报道基本一致, 因此确定化合物3为5β-acetoxypalisadin A。

化合物4: 白色不定型固体, HRESIMS m/z 459.014 1, 461.011 6和463.007 9 [M+Na]+ (计算值: C17H2679Br2O3Na, 459.014 1, C17H2679Br81BrO3Na, 461.012 0, 和C17H2681Br2O3Na, 463.010 1); [α]D25=−40.9 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 3.42 (1H, t, J=10.1 Hz, H-1a), 3.72(1H, dd, J=10.6, 3.0 Hz, H-1b), 4.45(1H, d, J=9.5 Hz, H-2), 5.71(1H, d, J=7.0 Hz, H-4), 5.80(1H, d, J=7.2 Hz, H-5), 1.74(1H, s, H-6), 1.61(1H, q, J=5.8, 4.7 Hz, H-8a), 1.86(1H, td, J=13.3, 4.2 Hz, H-8b), 2.18(1H, dq, J=13.3, 3.8 Hz, H-9a), 2.31(1H, dq, J=13.8, 4.0 Hz, H-9b), 3.88(1H, dd, J=12.7, 4.5 Hz, H-10), 1.76(3H, s, H-12), 2.10(3H, s, H-13), 1.02(3H, s, H-14), 1.21(3H, s, H-15), 1.65(3H, s, H-17); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 34.9(C-1), 70.3(C-2), 142.7(C-3), 127.1(C-4), 69.9(C-5), 54.0(C-6), 78.1(C-7), 39.5(C-8), 32.9(C-9), 66.3(C-10), 41.5(C-11), 21.4(C-12), 21.7(C-13), 18.9(C-14), 31.0(C-15), 170.6(C-16), 25.4(C-17)。以上数据与文献[17]基本一致, 因此确定化合物4为5-acetoxypalisadin B。

化合物5: 白色不定型固体, HRESIMS m/z 409.171 2和411.168 0 [M+Na]+ (计算值: C20H3579BrO2Na, 409.171 3和C20H3581BrO2Na, 411.169 2); [α]D25=+21.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 5.10(1H, dd, J=10.8, 1.0 Hz, H-1a), 5.23(1H, dd, J=17.3, 1.0 Hz, H-1b), 5.90(1H, dd, J=17.3, 10.8 Hz, H-2), 1.53(1H, dd, J=9.3, 2.1 Hz, H-4a), 1.66(1H, m, H-4b), 1.77(1H, m, H-5a), 2.02(1H, m, H-5b), 1.20(1H, t, J=3.4 Hz, H-6), 1.48(1H, m, H-8a), 1.66(1H, m, H-8b), 2.02(1H, m, H-9a), 2.41(1H, dq, J=13.2, 3.8 Hz, H-9b), 4.16(1H, dd, J=12.7, 3.8 Hz, H-10), 1.33(1H, m, H-12a), 1.44(1H, m, H-12b), 1.53(2H, dd, J=9.3, 2.1 Hz, H-13), 5.05(1H, m, H-14), 1.69(3H, s, H-16), 1.64(3H, s, H-17), 1.10(3H, s, H-18), 1.18(3H, s, H-19), 1.29(3H, s, H-20); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 112.4(C-1), 144.7(C-2), 73.1(C-3), 44.9(C-4), 21.7(C-5), 49.0(C-6), 73.1(C-7), 42.0(C-8), 30.1(C-9), 63.5(C-10), 43.2(C-11), 39.3(C-12), 21.2(C-13), 123.9(C-14), 131.8(C-15), 25.9(C-16), 17.8(C-17), 18.6(C-18), 31.0(C-19), 28.1(C-20)。以上数据与文献[20]基本一致, 因此确定化合物5为luzodiol。

化合物6: 无色油状, HRESIMS m/z 259.166 9 [M+Na]+ (计算值: C15H24O2Na, 259.166 9); [α]D25=+21.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 6.74(1H, m, H-2), 2.53(1H, m, H-3a), 2.20(1H, d, J=17.5 Hz, H-3b), 2.46(1H, m, H-4), 2.64(1H, m, H-5), 0.39(1H, m, H-6), 0.54(1H, m, H-7), 1.58(1H, dq, J=12.7, 6.3 Hz, H-8a), 1.76(1H, dd, J=14.1, 6.9 Hz, H-8b), 3.62(1H, m, H-9a), 3.68(1H, dt, J=12.4, 6.3 Hz, H-9b), 1.06(3H, s, H-12), 0.95(3H, s, H-13), 2.32(3H, s, H-14), 0.98(3H, d, J=6.9 Hz, H-15); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 149.1(C-1), 144.2(C-2), 39.7(C-3), 37.2(C-4), 43.1(C-5), 27.5(C-6), 24.5(C-7), 28.2(C-8), 63.6(C-9), 197.6(C-10), 17.3(C-11), 29.0(C-12), 16.2(C-13), 27.2(C-14), 16.4(C-15)。以上数据与文献[21]基本一致, 因此确定化合物6为pileaterpene C。

化合物7: 无色油状, HRESIMS m/z 795.355 8, 797.355 9和799.355 9 [2M+Na]+ (计算值: C40H7079Br2O4Na, 795.353 3, C40H7079Br81BrO4Na, 797.351 3, 和C40H7081Br2O4Na, 799.349 3); [α]D25=+9.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 1.71(1H, dt, J=13.1, 3.5 Hz, H-1a), 1.85(1H, m, H-1b), 2.08(1H, dq, J=13.9, 4.0 Hz, H-2a), 2.19(1H, dq, J=13.4, 3.9 Hz, H-2b), 3.99(1H, dd, J=12.7, 4.4 Hz, H-3), 0.95(1H, dd, J=12.2, 2.0 Hz, H-5), 1.47(1H, d, J=12.8 Hz, H-6a), 1.64(1H, m, H-6b), 1.01(1H, m, H-7a), 1.23(1H, m, H-7b), 0.91(1H, s, H-9), 1.23(1H, m, H-11a), 1.56(1H, d, J=13.7 Hz, H-11b), 1.51(1H, dd, J=8.8, 4.2 Hz, H-12a), 1.85(1H, m, H-12b), 1.51(1H, dd, J=8.8, 4.2 Hz, H-14), 3.91(2H, br m, H-15), 1.33(3H, s, H-16), 0.78(3H, s, H-17), 0.93(3H, s, H-18), 1.05(1H, s, H-19), 0.84(3H, s, H-20); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 41.6(C-1), 31.0(C-2), 69.7(C-3), 39.9(C-4), 56.8(C-5), 19.9(C-6), 41.9(C-7), 37.7(C-8), 60.4(C-9), 37.7(C-10), 19.2(C-11), 44.3(C-12), 74.9(C-13), 60.8(C-14), 61.1(C-15), 24.3(C-16), 17.3(C-17), 18.1(C-18), 30.6(C-19), 16.5(C-20)。以上数据与文献[22]基本一致, 因此确定化合物7为isoaplysin-20。

化合物8: 白色结晶, HRESIMS m/z 409.171 3和411.169 1 [M+Na]+ (计算值: C20H3579BrO2Na, 409.171 3和C20H3581BrO2Na, 411.169 2); [α]D25=+18.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δH: 1.19(1H, dd, J=13.4, 3.3 Hz, H-1a), 1.68(1H, dt, J=13.8, 3.4 Hz, H-1b), 2.05(1H, dd, J=13.9, 3.9 Hz, H-2a), 2.20(1H, dq, J=13.2, 3.4 Hz, H-2b), 4.06(1H, dd, J=12.7, 4.3 Hz, H-3), 1.11(1H, m, H-5), 1.44(1H, m, H-6a), 1.72(1H, m, H-6b), 1.45(1H, d, J=9.5 Hz, H-7a), 1.81(1H, m, H-7b), 1.08(1H, m, H-9), 1.25(1H, m, H-11a), 1.52(1H, m, H-11b), 1.52(1H, m, H-12a), 1.72(1H, m, H-12b), 5.89(1H, dd, J=17.4, 10.8 Hz, H-14), 5.02(1H, d, J=10.8 Hz, H-15a), 5.19(1H, d, J=17.4 Hz, H-15b), 1.23(3H, s, H-16), 1.13(3H, s, H-17), 0.93(3H, s, H-18), 1.07(3H, s, H-19), 0.84(3H, s, H-20); 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δC: 42.1(C-1), 32.0(C-2), 70.2(C-3), 40.6(C-4), 57.5(C-5), 22.9(C-6), 44.8(C-7), 74.8(C-8), 62.4(C-9), 40.5(C-10), 20.5(C-11), 46.2(C-12), 74.5(C-13), 146.5(C-14), 112.0(C-15), 28.1(C-16), 23.9(C-17), 18.6(C-18), 31.0(C-19), 16.0(C-20)。以数据与文献[23]基本一致, 因此确定化合物8为isoconcinndiol。

化合物9: 无色油状, HRESIMS m/z 343.224 4 [M+Na]+ (计算值: C20H32O3Na, 343.224 4); [α]D25=+50.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 2.57 (1H, q, J=9.1 Hz, H-1), 2.21(1H, dd, J=14.9, 7.4 Hz, H-2a), 2.48(1H, m, H-2b), 5.35(1H, s, H-3), 2.37(1H, m, H-5), 4.24(1H, dd, J=7.7, 2.5 Hz, H-6), 1.65(1H, dt, J=8.4, 3.0 Hz, H-7), 1.74(2H, m, H-8), 2.11(1H, t, J=13.1 Hz, H-9a), 2.67(1H, ddd, J=14.4, 4.9, 7.4, 2.4 Hz, H-9b), 2.45(2H, m, H-12), 5.71(1H, br m, H-13), 5.71(1H, br m, H-14), 1.31(3H, s, H-16), 1.82(3H, s, H-17), 4.75(1H, s, H-18a), 4.78(1H, s, H-18b), 1.21(3H, s, H-19), 1.31(3H, s, H-20); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 46.3(C-1), 33.9(C-2), 124.7(C-3), 140.8(C-4), 60.6(C-5), 74.5(C-6), 48.9(C-7), 21.8(C-8), 40.6(C-9), 152.0(C-10), 76.0(C-11), 44.2(C-12), 122.5(C-13), 142.2(C-14), 70.9(C-15), 30.0(C-16), 16.0(C-17), 107.8(C-18), 25.9(C-19), 30.2(C-20)。以上数据与文献[24]基本一致, 因此确定化合物9为cis-pachydictyol B。

化合物10: 无色油状, HRESIMS m/z 345.2401 [M+Na]+ (计算值: C20H34O3Na, 345.2400); [α]25 D=+61.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 2.63 (1H, m, H-1), 2.22(1H, m, H-2a), 2.51(1H, m, H-2b), 5.34(1H, br s, H-3), 2.32(1H, t, J=9.3 Hz, H-5), 4.03(1H, m, H-6), 1.47(1H, m, H-7), 1.54(2H, m, H-8), 2.13(1H, dt, J=15.2, 7.9 Hz, H-9a), 2.63(1H, m, H-9b), 1.54(1H, m, H-11), 1.57(1H, br s, H-12a), 1.87(1H, m, H-12b), 1.48(1H, m, H-13a), 1.54(1H, m, H-13b), 3.49(1H, s, H-14), 1.17(3H, s, H-16), 1.81(3H, br s, H-17), 4.74(1H, br s, H-18a), 4.75(1H, br s, H-18b), 0.99(3H, d, J=6.4 Hz, H-19), 1.17(3H, s, H-20); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 46.0(C-1), 33.9(C-2), 124.3(C-3), 141.5(C-4), 60.3(C-5), 74.5(C-6), 48.9(C-7), 24.2(C-8), 40.8(C-9), 152.6(C-10), 32.8(C-11), 29.7(C-12), 27.8(C-13), 76.8(C-14), 73.2(C-15), 23.3(C-16), 16.2(C-17), 107.2(C-18), 18.0(C-19), 27.0(C-20)。以上数据与文献[25]基本一致, 因此确定化合物10为dictytriol。

化合物11: 无色油状, HRESIMS m/z 261.1824 [M+Na]+ (计算值: C15H26O2Na, 261.1825); [α]D25=+5.0 (c 0.1, CH3OH)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH: 4.22(2H, d, J=5.1 Hz, H-1), 5.67(1H, t, J=6.7 Hz, H-2), 4.02(1H, t, J=6.3 Hz H-4), 2.27(2H, hept, J=6.2, 5.7 Hz, H-5), 5.11(1H, t, J=6.8 Hz, H-6), 2.04(2H, m, H-8), 2.08(2H, t, J=5.9 Hz, H-9), 5.06(1H, t, J=6.1 Hz, H-10), 1.68(3H, s, H-12), 1.60(3H, s, H-13), 1.69(3H, d, J=3.0 Hz, H-14), 1.64(3H, s, H-15); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC: 59.3(C-1), 124.2(C-2), 140.6(C-3), 76.2(C-4), 34.3(C-5), 119.7(C-6), 139.4(C-7), 40.0(C-8), 26.7(C-9), 124.6(C-10), 131.9(C-11), 25.9(C-12), 17.9(C-13), 12.4(C-14), 16.4(C-15)。以上数据与文献[26]基本一致, 因此确定化合物11为brevisnoside A。

2.2 生物活性测试结果 2.2.1 抗炎活性结果

抗炎活性测定结果显示, 化合物1~4、6和10对LPS刺激的RAW264.7细胞产生的NO均具有抑制作用, 且无细胞毒性。其中化合物2的抗炎活性比槲皮素的抗炎活性强, IC50值为(3.42±0.25) µmol/L。化合物4具有较强的抑制效果, IC50值为(12.58±0.63) µmol/L。化合物1具有中等的抑制效果, IC50值为(22.81±0.69) µmol/L。化合物3、6和10具有较弱的抑制效果, IC50值分别为(62.02± 3.85)、(58.14±3.02)和(56.27±2.95) µmol/L。阳性对照槲皮素的IC50值为(9.98±1.14) µmol/L(图 3)。

图 3 化合物1~4、6和10对RAW264.7细胞NO生成的IC50 Fig. 3 IC50 of compounds 1–4, 6, and 10 on NO production in RAW264.7 cell 注: c1为化合物1的浓度、c2为化合物2的浓度、c3为化合物3的浓度、c4为化合物4的浓度、c6为化合物6的浓度、c10为化合物10的浓度
图选项
2.2.2 抗肿瘤活性结果

对分离得到的11个萜类化合物使用MTT法评估化合物对5种人体肿瘤细胞的体外细胞毒性。结果显示, 化合物1、4对人慢性髓原白血病细胞(K562)具有中等的抑制作用, 其IC50值分别为(27.82±0.06)和(19.99±1.96) µmol/L。其余IC50如表 2所示。

表 2 化合物1和4对5种肿瘤细胞的细胞毒活性测试结果 Tab. 2 Cytotoxic activities of compounds 1 and 4 against five tumor cells
化合物 IC50±SD/(μmol·L–1)a
K562 BEL-7402 SGC-7901 A549 Hela
1 27.82±0.06 42.82±0.29 51.2±0.06 74.35±0.89 79.56±0.32
4 19.99±1.96 39.53±0.37 40.46±0.32 68.74±0.21 75.1±1.03
顺铂b 3.08±0.05 4.02±0.08 4.11±0.02 1.93±0.02 11.29±0.15
注: a: 基于3次平行实验的平均值; b: 阳性对照
表选项
3 讨论

根据文献记载, 已有研究者对多个地方的黑指纹海兔A. dactylomela进行了化学成分研究, 包括西班牙的特内里费岛、新西兰北部的利港、日本小滨岛、比米尼群岛、加那利群岛、巴西海域、马达加斯加、拉帕尔马岛西南海域、越南海域、加勒比海、婆罗洲水域、婆罗洲的塞邦加尔水域以及中国海南岛沿岸水域[27]。目前, 三沙市七连屿海域黑指纹海兔A. dactylomela的化学成分研究尚未报道。卤化次生代谢物并不是由海兔产生的, 而是通过选择性摄食海藻, 在消化腺中积累形成的[28]。溴化萜烯类天然产物的生物合成与钒溴过氧化物酶(V-BrPO)的调节有关[29]。钒溴过氧化物酶在海洋生物的化学防御机制中起着重要作用, 它通过产生一系列具有刺激性或毒性的活性物质, 如卤化有机物、单线态氧和卤胺等, 来有效地阻止捕食者接近海洋生物[30]。不同海域的黑指纹海兔A. dactylomela因食物多样性而展现出次生代谢产物的化学多样性。探索新的采集地点可能揭示新的化学结构和食物链关系。以Laurencia红藻为食的黑指纹海兔A. dactylomela体内的次生代谢产物较为丰富, 包括了C-15大环内酯类、倍半萜、二萜以及三萜, 采集地涉及北婆罗洲岛海域[28]、越南海域[12-13, 31]、波多黎各莫纳岛海域[32]和波多黎加勒比海域[33]。以Dyticotacae褐藻为食的黑指纹海兔A. dactylomel体内的次生代谢产物较为单一, 主要有二萜, 采集地有加利福尼亚海域[34]、加那利群岛特内里费岛海域[35]。本文是首次对在三沙市七连屿海域采集的黑指纹海兔A. dactylomela进行化学成分研究, 从中分离得到11个萜类化合物, 其中有7个是溴化萜类化合物, 丰富了三沙市七连屿海域的黑指纹海兔A. dactylomela的化学成分。

据文献报道, 化合物2对小鼠淋巴细胞白血病(P-388)具有显著的抑制活性, 且已实现体外合成[36]。化合物2通过抑制诱导型一氧化氮合酶iNOS(inducible nitric oxide synthase)的表达, 降低了NO的释放, 从而减轻炎症和组织损伤, 此外还可抑制前列腺素(PGE2)的产生[10]。化合物6和化合物11分别首次从黑指纹海兔A. dactylomela中发现, 它们最早分别来源于短角湿生冷水花(Pilea aquarum subsp.brevicornuta)的地上部分和灯盏花属植物(Erigeron breviscapus)。化合物6对IL-Iβ刺激的HT-29细胞产生的IL-8具有显著的抑制作用, 可用于研发治疗抗生素相关腹泻以及相关疾病的药物[37]。除了化合物6和11外, 其余化合物最初均从海洋中的藻类, 如红藻(Lauretzcia fixilis、Laurencia luzonensis)和褐藻(Dictyota dichotom、Lmrencio snyderae)中分离得到, 此后陆续从黑指纹海兔A. dactylomela中分离得到[17-24]。这为研究黑指纹海兔A. dactylomela与海藻之间的捕食关系提供了一定的理论依据, 这种捕食关系的探索不仅有助于我们更深入地理解海洋生物与环境的相互作用, 还可能为药物研发、生态保护等领域提供新的思路和方法[28]。此外, 本研究也进一步丰富了黑指纹海兔A. dactylomela的化学多样性, 尤其是丰富了具有抗炎活性和细胞毒活性结构的多样性。

4 结论

从黑指纹海兔A. dactylomela中共分离得到了11个萜类化合物(1~11)。主要包括了4个溴化倍半萜(1~4)、3个溴化二萜(5、7、8)、2个倍半萜(6、11)和2个二萜(9、10)。对化合物1~11进行抗炎和细胞毒活性测试, 发现化合物1~4、6和10均具有不同程度的抗炎活性, 其中化合物2(IC50值为(3.42±0.25) µmol/L)的抗炎活性, 相较于槲皮素的抗炎活性(IC50值为9.98± 1.14 µmol/L)更为显著, 且无细胞毒性。化合物1和4对人慢性髓白血病细胞(K562)、人肝癌细胞(BEL-7402)、人胃癌细胞(SGC-7901)的均具有一定的细胞毒活性。其中, 化合物1和4对人慢性髓白血病细胞(K562)具有中等的抑制活性, 其IC50值分别为(27.82±0.06)和(19.99±1.96) µmol/L。

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