海洋科学  2025, Vol. 49 Issue (3): 40-50   PDF    

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刘涛, 安明明, 裴炎沼, 秦梓凌, 王淑敏, 周斌. 2025.
LIU Tao, AN Mingming, PEI Yanzhao, QIN Ziling, WANG Shumin, ZHOU Bin. 2025.
石油烃对鳗草(Zostera marina)幼苗光合作用的毒性效应研究
Toxicity and mechanisms of water-accommodated fractions on photosynthesis in Zostera marina
海洋科学, 49(3): 40-50
Marine Sciences, 49(3): 40-50.
http://dx.doi.org/10.11759/hykx20231022001

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收稿日期：2023-10-22
修回日期：2024-03-05
引用本文
刘涛, 安明明, 裴炎沼, 秦梓凌, 王淑敏, 周斌. 2025. 石油烃对鳗草(Zostera marina)幼苗光合作用的毒性效应研究[J]. 海洋科学, 49(3): 40-50.
LIU Tao, AN Mingming, PEI Yanzhao, QIN Ziling, WANG Shumin, ZHOU Bin. 2025. Toxicity and mechanisms of water-accommodated fractions on photosynthesis in Zostera marina[J]. Marine Sciences, 49(3): 40-50.
石油烃对鳗草(Zostera marina)幼苗光合作用的毒性效应研究
刘涛1, 安明明1, 裴炎沼2, 秦梓凌2, 王淑敏2, 周斌2     
1. 中海油研究总院有限责任公司, 北京 100027;
2. 中国海洋大学 海洋生命学院, 山东 青岛 266003
收稿日期：2023-10-22；修回日期：2024-03-05
基金项目：国家自然科学基金（42076147）
作者简介：刘涛(1980—), 男, 硕士, 河北沧州人, 研究方向为环境工程、海洋工程安全环保, E-mail: liutao1@cnooc.com.cn.
通信作者：周斌(1981—), 通信作者, 内蒙古呼伦贝尔人, 从事海草生理生态学研究, E-mail: zhoubin@ouc.edu.cn.
摘要：为评估石油烃对鳗草幼苗光合作用的影响, 设置0、2.5、5、10、20、40 mg/L 0号柴油水溶液(water-accommodated fraction, WAF)胁迫培养8 d, 研究鳗草幼苗光合色素含量(叶绿素a、b)、最大光化学量子产量(Fv/Fm)、荧光淬灭参数(NPQ、qL)以及光合电子传递速率的变化; 并结合0 (对照组)、5、10、20、40 mg/L处理组转录组分析, 观察光合系统差异表达通路, 探讨了石油烃胁迫下鳗草幼苗光合系统的毒性效应和机制。结果表明: 在8 d的实验周期内, 鳗草幼苗叶绿素a、叶绿素b含量以及Fv/Fm、qL和rETR等叶绿素荧光参数与石油烃浓度呈负相关, 在40 mg/L处理组中较对照组分别降低12.47%、16.65%、6.01%、59.82%和58.12%; 鳗草幼苗NPQ参数随浓度增加, 呈现先升高后降低的趋势, 在10 mg/L处理组达到最大, 表明随着石油烃浓度升高, 鳗草幼苗光合活性和光保护能力降低, 光合系统被显著抑制; 转录组分析结果显示与对照组相比, 5、10 mg/L处理组差异表达基因较多, 分别为4 272和3 254个。5 mg/L处理组差异表达基因上调最多达3 219个, 20 mg/L处理组差异性表达基因下调最多达1 135个。胁迫期间多种与植物光合作用和生长相关基因表达受到影响, 如GIL1、ELIP1和FLU上调, SRR1和WEL2下调, 表明在高浓度石油烃胁迫下, 鳗草幼苗光合作用被抑制, 与光合色素以及叶绿素荧光参数变化一致。
关键词：石油烃    鳗草幼苗    光合系统    荧光参数    
Toxicity and mechanisms of water-accommodated fractions on photosynthesis in Zostera marina
LIU Tao1, AN Mingming1, PEI Yanzhao2, QIN Ziling2, WANG Shumin2, ZHOU Bin2     
1. China National Offshore Oil Corporation, Beijing 100027, China;
2. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
Received: Oct. 22, 2023
Foundation: the National Natural Science Foundation of China, No.42076147
Abstract: To evaluate the effects of water-accommodated fractions (WAFs) on photosynthesis in Zostera marina seedlings, 0, 2.5, 5, 10, 20, and 40 mg/L WAFs were applied for 8 days. The changes in photosynthetic pigment content (chlorophyll a and b), maximum photochemical quantum yield (Fv/Fm), fluorescence quenching parameters (QNP and qL), and photosynthetic electron transfer rate of the seedlings were studied. It was combined with the transcriptomics of 0 (Group CG), 5 (Group A), 10 (Group B), 20 (Group C), and 40 mg/L (Group D) treatment groups to observe the differential expression of genes associated with the photosynthetic pathways. The toxic effects on the photosynthetic system and underlying mechanisms under WAF stress were explored. The results showed that during the 8-day experimental period, a WAF concentration of less than 5 mg/L did not significantly impact chlorophyll a, chlorophyll b, and Fv/Fm in the seedlings. At concentrations greater than 5 mg/L, these parameters were markedly reduced by 12.47%, 16.65%, and 6.01%, respectively in the 40 mg/L group. A WAF concentration of less than 10 mg/L had no remarkable effects on the qL and rETR. However, at concentrations greater than 10 mg/L, these parameters were significantly suppressed by 59.82% and 58.12% in the 40 mg/L group. At a WAF concentration of greater than 2.5 mg/L, the QNP increased markedly by 6.6%, 9.03%, 13.11%, 11.92%, and 10.72%, respectively, in each treatment group on the 8th day. These findings indicate that low concentrations (2.5 and 5 mg/L) of WAF had a relatively small impact on the photosynthetic system of Z. marina seedlings; however, the photosynthetic system was damaged under medium-high concentrations (10, 20, and 40 mg/L). Transcriptomics indicated that the number of differentially expressed genes in Groups B and C were 4 272 and 3 254 genes, respectively, compared to Group CG. The maximum number of differentially upregulated genes in Group B was 3 219, and that of downregulated genes in Group D was 1 135. Transcriptomics revealed that the photosynthesis pathway was significantly affected by WAF stress.
Key words: water-accommodated fraction (WAF)    Zostera marina seedlings    photosynthesis    chlorophyll fluorescence    

随着世界石油工业和海上运油业的发展, 石油在世界范围内开采和运输量激增, 与此同时, 石油污染问题也引起了世界范围内生态环境保护领域的重视。根据《2021年中国海洋生态环境状况公报》, 我国海洋油气平台污染在2019年产生并排放的钻屑达到峰值, 四大海区中, 东海和黄海的石油类排污量达到了377和119 t [1]。

石油作为成分复杂的混合物, 含有大量的芳香烃和其衍生物等毒性有机物, 对于海洋生态存在危害[2-3]。其对海洋生物的影响包括物理作用和化学毒性两个方面, 其中化学毒性分为两类: 一类是短时间内大量原油造成的急性中毒; 另一类是长期的低浓度石油烃, 即石油水溶液成分(water-accommodated fraction, WAF)的毒性效应[4]。石油烃对海洋生物的毒性效应研究已在多种生物中展开: 对海洋双壳贝类, 石油烃污染破坏其抗氧化酶系统, 对基因亦有破坏作用, 同时会在双壳贝类中富集, 随食物链传递危害人类[5-6]; 对双齿围沙蚕, 在石油烃暴露期间, 双齿围沙蚕表现出体重随时间明显下降, 抗氧化酶系统活性下降, 体腔细胞损伤明显, 遗传多样性被破坏等多种特征[7-8]; 对浮游植物, 石油烃作为石油团块的基本成分之一, 能够在浮游植物的体内富集, 缓慢而长期地产生毒性效应, 如石油烃中的多环芳烃等有机污染物会在浮游植物类囊体膜上富集, 破坏类囊体膜结构, 显著抑制光合作用[4, 9-10]。

鳗草(Zostera marina) 为单子叶草本植物, 广泛分布于我国北方近海, 是北方海草床的重要基础物种之一, 提供了重要的生态系统服务价值[11-12]。但是, 受环境变化和人类活动影响, 超过1/3的海草床已完全退化, 而船舶污染及海洋油气开发造成的石油污染是重要的影响因素之一[13]。我国沿海及海湾自然水体中石油烃调查显示, 2008年流沙湾表层水体石油烃质量浓度为0~1.930 mg/L, 平均值为0.08 mg/L; 2010年莱州湾、渤海湾和辽东湾表层水体石油烃浓度分别为0.017~0.080 mg/L、0.013~0.015 mg/L和0.008~0.018 mg/L; 2000—2009年及2013年10年间长江口表层水体石油烃浓度为0~0.41 mg/L, 平均浓度为0.08 mg/L; 2015年大亚湾表层水体石油烃浓度为0.005~0.268 mg/L, 均值为0.067 mg/L[14–16]。表明我国沿海大部分海湾均受到石油污染。此外, 根据杨庆霄等[17]对海上溢油溶解过程的研究, 溢油24 h后石油烃在水体中浓度较高, 在2 m水深也可达357 mg/L, 因此研究高浓度WAF对鳗草的影响有现实意义。目前, 石油烃胁迫对鳗草影响的研究较少, 部分研究表明在不同浓度的石油烃水溶液胁迫下, 鳗草成体会迅速做出响应, 高浓度WAF胁迫下鳗草的光合作用和抗氧化系统受到显著抑制, 据此进行IBR结果计算, 可知随石油烃浓度增加和时间延长, 鳗草的损伤程度加剧[18-19]。本研究分析了鳗草幼苗暴露于0号柴油WAF, 其光合作用参数的变化特征, 旨在为海草床保护和石油污染控制提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 鳗草幼苗采集及处理

鳗草幼苗采集于河北唐山(39°5'40.45" N, 118°40'57.15" E)潮间带海草床。于2023年2月下旬低潮期时采集, 采集时从鳗草植株底部挖取, 在水中轻轻抖落覆盖的沉积物, 尽量保证鳗草植株匍匐茎及根的完整性, 减少对鳗草植株的损害。采集植株后, 使用原位海水清洗植株, 去除泥沙及大型附着物, 迅速装入盛有天然海水的封装箱中运回实验室进行下一步处理。

在实验室内使用刷子仔细清洗植株的叶片、匍匐茎和根系, 去除附着生物等杂质。清洗完毕后从鳗草的克隆片段上摘取PI = 8~9 (根状茎3节+ 5~6片叶、枝长约为15 cm、至少2簇根, 根长约3~5 cm) 的克隆幼苗[20-21]。将处理后的鳗草幼苗放置于培养设施中, 使用循环的自然海水暂养(缓苗) 3 d。暂养条件为: 温度20 ℃、光照强度为100 μmol/(m2·s)、光照时间12 D⁚12 L、pH8.2 ± 0.05、盐度32, 培养条件均与唐山自然海域海水指标相同。

1.2 实验方法 1.2.1 石油烃水溶液(WAF)的制备

WAF的制备方法参照《海洋溢油生物影响评估指南》: 将过滤海水和0号柴油按照9∶1的比例混合, 密封, 避光, 使用磁力振荡机振荡24 h, 转移到分液漏斗里, 静置6 h, 收集下层水相, 即得0号柴油石油烃母液[22]。

将石油烃母液用微孔过滤膜进行抽滤除菌, 置于冰箱4 ℃避光密封保存待用。根据GB 17378.4—2007《海洋监测规范第4部分: 海水分析》中油类分析部分的紫外分光光度法及相关计算方法测量。此方法处理后的0号柴油石油烃母液质量浓度为100 mg/L。

1.2.2 实验设计

课题组前期研究表明了1、2.5和5 mg/L石油烃胁迫会对鳗草成体产生氧化损伤, 且损伤程度与石油烃浓度呈正相关[19]。此外, 石油烃污染对桑沟湾楮岛鳗草的影响研究也表明5、10、20 mg/L石油烃会显著降低鳗草成体叶绿素荧光参数, 抑制光合作用[18]。因此实验在前期研究的基础上, 设置5组WAF处理, 质量浓度分别为0、2.5、5、10、20、40 mg/L, 其中0 mg/L为空白对照, 每组设3个平行, 将形态大小大致相同的鳗草幼苗均分到不同实验组中, 期间保持水温15 ℃、盐度30、光照强度45 μmol/(m2·s)、光照周期12L⁚12D、pH=8.3±0.2, 使用充氧泵持续充氧保持溶解氧(DO)质量浓度≥6.0 mg/L, 每2 d用虹吸法换水1次以保持水体清澈, 每组位置每天随机调换避免光照条件差异的影响。测量各组内鳗草幼苗光合色素浓度和荧光参数, 得出WAF胁迫下鳗草幼苗光合速率变化。

1.2.3 测定指标及方法

(1) 光合色素含量(叶绿素a、b)测量使用丙酮提取法[24]测定; 取0.05 g新鲜的鳗草幼苗叶片, 剪碎成小于0.5 cm2的大小, 装至容量2 mL的研磨管中, 在研磨管中加研磨珠, 使用JXFSTPRP-48L型全自动样品快速研磨仪进行研磨。研磨仪设定为60 Hz、15 s运转、10 s间隔、研磨2次, 将研磨管取出, 加入1 mL的80%丙酮, 置于4 ℃条件下提取24 h。取出样品, 使用CT14DII型冷冻离心机进行离心, 离心机设定为4 ℃、698.75×g、10 min。定量取出上清液0.8 mL, 定容至4 mL, 利用UV-8000紫外可见分光光度计测定叶绿素a、b的含量;

(2) 荧光参数使用双通道调制叶绿素荧光仪(DUAL-PAM)测量, 分别于实验开始后第0、2、4、6、8 d取不同处理组鳗草幼苗, 每处理组取3个平行, 每次测量时间为20: 00, 半小时内测量完成, 测量前暗适应15 min。得出鳗草幼苗在石油烃胁迫下Fv/Fm、qL、NPQ、rETR(光系统II相对电子传递速率)的变化, 其中qL记为qL, NPQ记为QNP, rETR记为rETR。其中Fv/Fm代表光系统II最大光合活性, 该参数在逆境胁迫下会显著降低, 是光合作用研究最重要的参数; qL为光化学淬灭系数, 可以反映光合活性的高低; QNP为非光化学淬灭系数, 可以反映植物光保护能力; rETR是光系统II相对电子传递速率, 表示植物光合作用电子传递的量子产额, 是植物叶片光合电子传递速率快慢的相对指标[24-25]。

1.2.4 转录组测序及分析

挑选0、5、10、20、40 mg/L处理组第8 d样品进行转录组测量分析。转录组的建库及测序委托上海欧意生物医学科技有限公司完成, 每个石油烃胁迫组建立3个平行的转录组测序文库并进行Illumina 2000双端建库测序。获得原始测序序列(sequenced reads)后, 进行测序质量评估、基因组比对、蛋白编码基因表达水平汇总、相关性分析、主成分分析、表达丰度分析、并基于基因在不同样品中的表达量, DEseq识别鉴定差异表达基因; 对差异表达基因进行模式聚类、GO功能注释以及KEGG富集分析。

1.2.5 数据处理

使用Microsoft Excel 2019对获得的数据进行统计, 各处理数据以平均值±标准差(SD)表示; 使用Origin2021绘制柱状图; 使用IBM SPSS Statistics 27.0进行单因素方差分析, Duncan法进行多重比较检验。

2 结果与分析 2.1 光合色素含量变化

WAF胁迫对鳗草幼苗光合色素含量的影响见图 1。叶绿素a含量变化显示: 与对照组相比, 2.5 mg/L和5 mg/L组叶绿素a含量差异不显著(P > 0.05); 10 mg/L组叶绿素a在胁迫期间显著下降(P < 0.05); 20 mg/L组叶绿素a在2 d显著上升(P < 0.05), 在2~8 d显著下降(P < 0.05); 40 mg/L组叶绿素a在2~8 d显著下降(P < 0.05)[图 1(A)]。叶绿素b含量变化显示: 与对照组相比2.5 mg/L和5 mg/L组叶绿素b含量差异不显著(P > 0.05); 10、20和40 mg/L组叶绿素b在2~8 d显著下降(P < 0.05), 但20 mg/L组在2 d出现显著上升(P < 0.05) [图 1(B)]。

图 1 WAF胁迫下鳗草幼苗叶绿素含量的变化 Fig. 1 Changes in chlorophyll content of Zostera marina seedlings under water-accommodated fraction stress 注: a、b、c和d不同字母代表平均值之间具有显著性差异, 相同字母表示平均值无显著性差异; 图中虚线代表鳗草幼苗第0 d时(初始时刻)的叶绿素a和b的含量
图选项

总之, 在8 d实验周期内浓度小于5 mg/L的WAF对鳗草幼苗叶绿素a和叶绿素b含量无显著影响, 浓度大于10 mg/L的WAF对鳗草的叶绿素a和叶绿素b含量影响显著, 胁迫第8 d, 10、20和40 mg/L处理组中鳗草幼苗叶绿素a和叶绿素b分别较对照组下降6.40%、7.62%、12.47%和8.89%、12.70%、16.65%。

2.2 叶绿素荧光参数变化

WAF胁迫对鳗草幼苗叶绿素荧光参数的影响见图 2。与对照组相比, 中低浓度组(2.5、5和10 mg/L组) Fv/Fm和qL无显著差异(P > 0.05), 其中2.5 mg/L组qL参数在第2 d出现显著上升(P < 0.05)[图 2(B)]; QNP参数呈现先上升后下降的趋势, 均在胁迫第4 d达到最大值(P < 0.05)[图 2 (C)]; rETR参数呈现先下降后升高的趋势, 在胁迫第2~6 d显著下降(P < 0.05), 在第8 d达到最大值(P > 0.05), 其中2.5 mg/L在第2 d变化不显著(P > 0.05)[图 2(D)]。高浓度组(20、40 mg/L组) Fv/Fm和qL呈现显著下降趋势(P < 0.05), 其中20 mg/L组Fv/Fm参数在6~8 d时显著下降(P < 0.05), 40 mg/L组在2~8 d显著下降(P < 0.05)[图 2(A)], 而二者qL参数在胁迫第4 d略有回升[图 2 (B)]; QNP参数呈现先上升后下降再上升趋势, 2~4 d显著上升(P < 0.05), 6 d显著下降(P < 0.05), 8 d显著上升(P < 0.05)[图 2(C)]; rETR参数显著下降(P < 0.05), 但在胁迫第4 d二者rETR参数略微回升, 且20 mg/L处理组在胁迫第8 d略有回升[图 2(D)]。

图 2 WAF胁迫下鳗草幼苗叶绿素荧光参数的变化 Fig. 2 Changes in the chlorophyll content of Zostera marina seedlings under water-accommodated fraction stress 注: a、b、c和d不同字母代表平均值之间具有显著性差异, 相同字母表示平均值无显著性差异; 图中虚线代表鳗草幼苗第0 d时(初始时刻)的Fv/Fm、qL、QNP和rETR的值
图选项

总之, 在8 d的实验周期内, 浓度内小于5 mg/L的WAF对鳗草幼苗Fv/Fm、qL和rETR无显著影响, 仅在2~4 d有略微上升, 其中2.5 mg/L组上升趋势明显, 相较于对照组在2 d的增加率分别为2.05%、15.11%和5.46%; 浓度大于10 mg/L时参数显著降低, 其中10 mg/L组在2~4 d Fv/Fm参数上升, 与对照组相比在2 d最大上升3.60%, 在8 d相较对照组Fv/Fm、qL参数下降率分别为1.93%、19.66%, 但rETR上升14.85%; 20 mg/L和40 mg/L组Fv/Fm、qL和rETR参数显著降低, 在4 d或6 d有略微恢复, 其中在20 mg/L组在8 d相较对照组Fv/Fm、qL和rETR参数下降率分别为3.48%、46.43%和37.34%; 40 mg/L组在8 d相较对照组Fv/Fm、qL和rETR参数下降率分别为6.01%、59.83%和58.13%。

在8 d的实验周期内低浓度组QNP趋势为先上升后下降, 高浓度组呈现先上升后下降再上升, 其中2.5、5和10 mg/L仅有1个升高峰出现在第4 d, 其相较于对照组升高率为12.28%、11.11%和15.88%, 在第8 d相较于对照组升高率为6.60%、9.03%和13.11%; 20和40 mg/L组均有两个升高峰, 分别在第2 d和第8 d, 在第2 d相较于对照组升高12.41%和10.55%, 在第8d相较于对照组升高11.92%和10.72%。

2.3 转录组分析

对15个样品进行Illumina 2000双端建库测序, 共得到705 253 922条原始测序序列, 对原始测序序列进行质量筛选, 即截除原始序列中的测序接头、引物序列和低质量值数据等, 共获得104.47 Gb有效数据, 各样本的有效数据量分布在6.88~7.05 G, Q30碱基分布在95.68%~97.42%, 平均GC含量为45.68%。通过将原始序列比对到参考基因组上, 得到各个样本的基因组比对情况, 比对率为88.54%~93.9% (正常情况下, 如果不存在污染并且参考基因组选择合适的情况下, 参考基因组比对率大于70%), 表明测序数据完整性好、质量高。

差异基因筛选显示, A组、B组、C组、D组和CG组的差异表达基因数目分别为2 295、4 272、3 254、2 289个, 随着石油烃浓度增加, 上调基因呈现先上升后下降趋势, 下调基因呈现增加趋势(表 1)。此外, 对鳗草幼苗光合作用相关基因进行筛选显示, 共有6种相关基因在样本中发现分别为: GIL1 (protein gravitropic in the light 1)、LIR1 (light-regulated protein, chloroplastic)、ELIP1 (early light-induced protein 1, chloroplastic)、FLU (protein fluorescent in blue light, chloroplastic)、SRR1 (protein sensitivity to red light reduced 1)和WEL2 (protein weak chloroplast movement under blue light-like 2)。其中LIR1在胁迫期间上调; GIL1和ELIP1在A组下调, 在其余组上调。此外FLU、SRR1和WEL2在A组未发现, FLU在胁迫期间上调, SRR1和WEL2则在胁迫期间下调。

表 1 差异基因表达数目 Tab. 1 Number of differentially expressed genes
差异表达基因组 总差异表达基因个数 显著上调基因个数 显著下调基因个数
A组(5 mg/L)和GC组(0 mg/L) 2 295 1 227 1 068
B组(10 mg/L)和GC组(0 mg/L) 4 272 3 219 1 053
C组(20 mg/L)和GC组(0 mg/L) 3 254 2 455 799
D组(40 mg/L)和GC组(0 mg/L) 2 289 1 154 1 135
表选项

分别将实验组(A、B、C和D组)和对照组(GC组)的差异表达基因结合GO注释进行功能富集分析, 按照GO三大类型再次进行分类, 如图 3所示, 差异表达基因所注释到的GO类群主要表现在以下方面: 在生物学过程分类下, 主要富集在细胞学过程、代谢过程、翻译和响应等功能; 在细胞组分分类下, 主要富集在细胞、细胞壁部分、细胞膜部分和胞外等功能; 在分子功能中, 主要富集在催化活性、附着和运输活性等功能。

图 3 差异表达基因本体(GO)富集分析 Fig. 3 Gene ontology enrichment analysis of the differentially expressed genes
图选项

利用KEGG数据库分别将实验组(A、B、C和D组)和对照组(GC组)的差异表达基因进行Pathway分析(结合KEGG注释结果), 以此获知不同石油烃胁迫组之间差异基因可能参与的生理生化代谢通路。结果如图 4所示, A组和GC组的差异表达基因主要显著富集于淀粉和蔗糖代谢、苯丙素的生物合成、类黄酮生物合成、细胞壁相关代谢等通路; B组和GC组差异表达基因主要显著富集于核糖体、细胞壁相关代谢、脂肪酸代谢、油菜素甾体生物合成、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢等通路; C组和GC组差异表达基因主要显著富集于植物激素信号转导、核糖体、脂肪酸代谢、油菜素甾体生物合成、淀粉和蔗糖代谢、苯丙素的生物合成等通路; D组和GC组差异表达基因主要显著富集于植物激素信号转导、细胞壁相关代谢、脂肪酸代谢、苯丙素的生物合成等通路。

图 4 差异表达基因与基因组数据库(KEGG)通路富集散点图 Fig. 4 Scatter plots of differentially expressed genes and genomic database (KEGG) pathways
图选项
3 讨论 3.1 光合色素含量和叶绿素荧光参数影响分析

叶绿素含量是植物光合系统的重要参数, 对植物光合速率和生长状况有着重要的影响[23]。在实验过程中, 低浓度处理组的叶绿素含量与对照组差异小, 可以说明, 低浓度WAF未对鳗草幼苗造成胁迫或胁迫程度低, 当石油烃水溶液质量浓度高于10 mg/L时, 鳗草幼苗叶片叶绿素含量在短期内出现上升, 但在短期上升后持续下降, 表明鳗草幼苗光合系统对石油烃胁迫产生了响应。叶绿素含量上升可以被看作鳗草幼苗光合系统对石油烃水溶液的应激反应, 浓度越高, 应激反应越强烈, 在20 mg/L组内2 d叶绿素含量出现了显著上升且水平远超其余实验组, 然而当浓度达到40 mg/L时, 其叶绿素a、b含量大幅降低达12.47%和16.55%, 这表明鳗草幼苗受到严重胁迫, 光合系统受到破坏, 对逆境的应激和保护能力受损, 超出了自我调节范围。

叶绿素荧光分析技术作为光合作用机理研究的重要技术, 可以快速、灵敏且无伤探究植物在逆境条件下光合作用的变化情况, 其中Fv/Fm、qL、QNP和rETR是常用的叶绿素荧光参数, 分别表征植物的潜在最大光合活性、PSII吸收光能的能力、光保护能力和光合速率, 通过在不同环境条件下对叶绿素荧光数据的分析, 可以深入了解环境因素对植物光合系统的影响[24-25]。

实验过程中低浓度处理组(2.5和5 mg/L组) Fv/Fm参数变化基本不显著, 在2~4 d表现出上升趋势, 表明在低浓度WAF下, 鳗草幼苗未受到光抑制, 且光合作用略有上升; 在中高浓度组处理组(20、40 mg/L组)趋势不尽相同, 其中10 mg/L组前期略微上升而后期下降, 20 mg/L组呈现出先上升再下降的趋势, 在4 d之后显著下降; 40 mg/L组呈现出下降趋势, 在6 d稍有回升, 在第8 d相较于处理组下降率为1.93%、3.48%和6.01%, 表明高浓度WAF下鳗草幼苗最大光合活性受到抑制, 且浓度越高, 抑制效果越明显, 这与陆秀军等对灌木在石油烃胁迫下叶绿素荧光参数变化相符[26]。rETR参数的变化也印证了这一点, rETR参数在中低浓度处理组(2.5、5、10 mg/L组)呈现先下降后上升的趋势, 其中2.5 mg/L组下降时间晚、幅度低, 表明WAF在低浓度下对鳗草幼苗电子传递速率影响较小, 甚至有促进作用; 高浓度处理组(20、40 mg/L组)呈现先下降后上升再下降的趋势, 且在8 d胁迫后参数显著降低, 表明高浓度WAF胁迫同样会抑制电子传递速率。此外对qL和QNP参数的分析表明了在低浓度WAF胁迫下的不同之处, 在低浓度处理组(2.5、5 mg/L组)下qL和QNP参数变化不显著, 其中2.5 mg/L的qL在2 d表现出显著上升, QNP则在2 d下降, 表明低浓度WAF胁迫对鳗草幼苗光能利用产生了促进效果; 中浓度10 mg/L组其qL参数略微下降, QNP参数上升, 表明随着WAF浓度升高, 其对鳗草幼苗光系统产生了抑制; 高浓度处理组(20、40 mg/L组)其qL表现出先升高后降低的趋势, QN则先升高后降低再升高, 说明当WAF浓度过高, 光保护功能激活, 但不能完全阻止WAF对光系统的影响, 表明高浓度WAF胁迫对鳗草幼苗光系统产生强烈抑制。

对叶绿素含量及Fv/Fm、qL、QNP和rETR进行综合分析, 可见中低浓度处理组(2.5、5、10 mg/L组)鳗草幼苗叶绿素含量、Fv/Fm、qL稳定, 且在2.5 m/L低浓度下出现上升, QNP呈现先上升后下降, 表明WAF在低浓度下对鳗草幼苗光系统胁迫程度低, 甚至有促进作用, 其对光系统造成的伤害可以通过光保护机制恢复; 随着WAF浓度升高, 叶绿素含量和叶绿素荧光参数逐渐下降, 高浓度组处理组(20、40 mg/L组)其叶绿素含量、Fv/Fm、qL在2 d和6 d有短暂恢复, 在8 d胁迫后大幅降低。石油污染对甜高粱(Sorghum bicolour)影响的研究表明, 在30 mg/L和100 mg/L石油烃胁迫下甜高粱Fv/Fm、qL和rETR参数呈现随石油烃浓度上升而下降的趋势, 与本研究一致[27]。此外, QNP在高浓度处理组(20、40 mg/L组)中胁迫2~6 d下降幅度远大于中低浓度组, 表明高浓度WAF胁迫同样对鳗草幼苗光保护能力造成了损害。

3.2 转录组分析

近年来, 组学技术在海草研究中的应用得到了飞速发展, 转录组可以提供特定环境胁迫下的基因表达信息、推断未知基因的功能及揭示特定调节基因的作用机制[28]。本研究中, 通过对对照组GC与WAF胁迫组A、B、C和D组的差异表达基因进行GO和KEGG富集分析, 发现差异基因主要富集到植物激素、代谢、催化相关的基因通路上, 如植物激素信号转导、细胞壁相关代谢、核糖体、脂肪酸代谢、油菜素甾体和苯丙素生物合成等, 说明WAF胁迫涉及鳗草幼苗体内激素生成、细胞壁代谢、核糖体等多项关键生理进程, 而随着WAF浓度升高, 下调基因不断增多也表明高浓度WAF胁迫会对鳗草带来不利影响。

对鳗草幼苗光合作用相关基因的筛选显示了鳗草幼苗光合作用的部分响应特征。GIL基因可以调节植物在光敏色素A(PhyA)和光敏色素B (PhyB)介导下对重力的感应[29]。本研究中鳗草幼苗GIL基因在高浓度WAF组下调, 表明了鳗草幼苗对光和重力的响应减弱, 不利于生长。ELIP一般被认为与光保护能力相关, 研究发现多种植株在胁迫条件下ELIP表达上调, 如低温胁迫下拟南芥(Arabidopsis thaliana) ELIP基因显著上调, 盐胁迫会导致胡杨(Populus euphratica)叶片中ELIP基因上调, 而单独的红光、红远光和蓝光均会导致豌豆叶片中ELIP1基因上调, 表明了ELIP1在光保护中发挥了重要作用[30-33]。本研究胁迫期间ELIP1基因在A组下调, 其他组上调, 表明了鳗草幼苗在高浓度WAF胁迫下光合能力受损, 导致ELIP基因被激活以增强光保护能力。FLU是暗抑制中5-氨基乙酰丙酸(ALA)合成的负调节因子, 如拟南芥FLU在弱光和强光下FLU上调, 叶绿素含量降低[34]。本研究中FLU在除A组外的其他胁迫处理组中上调, 表明鳗草幼苗在高浓度WAF胁迫下抑制了ALA的合成, 导致叶绿素含量降低, 这与叶绿素含量测量结果相符。此外, SSR1在PhyB介导的光信号中起到重要作用, 是PhyB信号转导所必须的基因[35], 而WEL2则与叶绿体光响应运动相关, 可以使叶绿体趋向低光强避免光损伤[36], 在高浓度WAF胁迫下二者在鳗草幼苗中的表达均下调, 表明了高浓度WAF对光合系统的损伤作用。

通过GO富集分析发现, 光响应(response to light stimulus)相关通路在GO富集分析中虽然在top30条目中, 但不位于前列, 其中低浓度组A和B组(5和10 mg/L)光响应相关通路仅位于第6—7位, 但在高胁迫组如D组(40 mg/L)光响应相关通路排在第4位, 且差异基因富集更显著, 这说明石油烃对鳗草幼苗光合作用的胁迫在转录阶段虽然并非最严重的, 但光合系统在更高浓度的WAF胁迫下明显受到损害, 表明鳗草幼苗光合作用通路受到了WAF胁迫的显著影响。已有研究表明, 在强光下大洋波喜荡草(Posidonia oceanica)光适应(RuBisCO、铁氧还蛋白、叶绿素结合蛋白)和光保护(抗氧化酶、叶黄素循环相关基因、生育酚生物合成)基因上调[25], 因此与光合系统相关的光适应和光保护蛋白可能更为重要。

综上, 在GO和KEGG富集分析中, WAF胁迫对鳗草幼苗体内植物激素产生、核糖体生物合成、翻译、细胞壁生物合成等相关过程影响更为显著, 包括脂肪酸合成、氨基酸合成等多种过程均受影响, 说明WAF胁迫对于鳗草幼苗生长产生了严重影响, 其生长过程中激素分泌、细胞分裂等多种重要过程受到抑制。在之后的研究中应进一步聚焦于石油烃对植物激素、细胞分裂、生物合成等关键过程的影响。

4 结论

本文研究了不同浓度石油烃胁迫对鳗草幼苗光合作用的影响。叶绿素含量和光合作用参数分析表明了中低浓度WAF(2.5、5、10 mg/L)对鳗草幼苗光合作用影响较小且在短期内有一定促进作用; 中高浓度WAF(20、40 mg/L)会显著抑制鳗草幼苗光合作用; 转录组分析表明, WAF胁迫下鳗草幼苗光响应相关通路呈现显著的差异性表达, 并随着WAF浓度升高, 差异更为显著, 高浓度WAF胁迫对鳗草幼苗植物激素产生、核糖体生物合成、翻译、细胞壁生物合成等相关过程影响显著。

参考文献
[1]
2021年中国海洋生态环境状况公报[J]. 环境保护, 2022, 50(11): 59-67.
[2]
李丽和. 石油烃污染场地风险评价及案例研究[D]. 北京: 北京化工大学, 2007.
LI Lihe. Petroleum-contaminated sites risk assessment and case study[D]. Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2007.
[3]
田立杰, 张瑞安. 海洋油污染对海洋生态环境的影响[J]. 海洋湖沼通报, 1999(2): 65-69.
TIAN Lijie, ZHANG Ruian. The effect of offshore oil pollution on marine ecological environment[J]. Transaction of Oceanology and Limnology, 1999(2): 65-69.
[4]
刘伟峰. 海洋溢油污染生态损害评估研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2011.
LIU Weifeng. Research on ecological damage assessment of marine oil spill pollution[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2011.
[5]
赵淑伟, 熊红霞, 王晓丽, 等. 石油烃对海洋双壳贝类毒性机制研究进展[J]. 海洋环境科学, 2021, 40(1): 144-151.
ZHAO Shuwei, XIONG Hongxia, WANG Xiaoli, et al. Advance in the study on toxicity mechanism of petroleum hydrocarbons on marine bivalves to marine bivalves[J]. Marine Environmental Science, 2021, 40(1): 144-151.
[6]
肖雅元. 石油烃污染对翡翠贻贝毒性效应及机理研究[D]. 上海: 上海海洋大学, 2012.
XIAO Yayuan. Toxic effects and mechanisms of WAF pollution on Perna viridis[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University, 2012.
[7]
HE L J, PENG S T, XIONG H X, et al. Study on the toxic effects of marine WAF pollution on Polychaetes[J]. Marine Science Bulletin, 2021, 23(1): 53-70.
[8]
何丽君. 沉积物中石油烃对双齿围沙蚕的毒性效应研究[D]. 天津: 天津科技大学, 2023.
HE Lijun. Study on the toxic effect of wafs in sediments on the Perinereis aibuhitensis[D]. Tianjin: Tianjin University of Science and Technology, 2021.
[9]
王悠, 唐学玺, 李永祺, 等. 低浓度蒽对两种海洋微藻生长的兴奋效应[J]. 应用生态学报, 2002, 13(3): 343-346.
WANG You, TANG Xuexi, LI Yongqi, et al. Stimulation effect of anthracene on marine microalgae growth[J]. Journal of Applied Ecology, 2002, 13(3): 343-346.
[10]
张聿柏. 石油烃对海洋微藻的毒性效应及其机理研究[D]. 青岛: 中国海洋大学, 2014.
ZHANG Yubai. Toxic effects and mechanisms of WAFs on marine microalgae[D]. Qingdao: Ocean University of China, 2013.
[11]
郑凤英, 邱广龙, 范航清, 等. 中国海草的多样性、分布及保护[J]. 生物多样性, 2013, 21(5): 517-526.
ZHENG Fengying, QIU Guanglong, FAN Hangqing, et al. Diversity, distribution, and protection of seagrass in China[J]. Biodiversity, 2013, 21(5): 517-526.
[12]
李文涛, 张秀梅. 海草场的生态功能[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2009, 39(5): 933-939.
LI Wentao, ZHANG Xiumei. The ecological functions of seagrass meadows[J]. Perioddical of Ocean University of China, 2009, 39(5): 933-939.
[13]
ALOTAIBI N M, KENYON E J, COOK K J, et al. Low genotypic diversity and long-term ecological decline in a spatially structured seagrass population[J]. Scientific Reports, 2019, 9(1): 18387.
[14]
李雪英, 孙省利, 赵利容, 等. 流沙湾海水中石油烃的时空分布特征研究[J]. 生态环境学报, 2011, 20(5): 908-912.
LI Xueying, SUN Shengli, ZHAO Lirong, et al. Temporal and spatial distribution of oil hydrocarbon in seawater in Liusha Bay Bay[J]. Ecology and Environment, 2011, 20(5): 908-912.
[15]
李磊, 蒋玫, 沈新强, 等. 长江口及邻近海域水体中石油烃分布特征及其污染评价[J]. 环境化学, 2014, 33(8): 1366-1372.
LI Lei, JIANG Mei, SHEN Xinqiang, et al. Spatial distribution and pollution analysis of the petroleum hydrocarbons in water from the Changjiang Estuary and its adjacent areas and adjacent waters[J]. Environmental Chemistry, 2014, 33(8): 1366-1372.
[16]
孙涛, 肖雅元, 王腾, 等 . 大亚湾海域水体和沉积物中石油类含量与分布特征[J]. 南方水产科学, 2018, 14(4): 1-9.
SUN Tao, XIAO Yayuan, WANG Teng, et al. Content and distribution characteristics of petroleum hydrocarbons in Daya Bay waters and sediments[J]. Fisheries Science, 2018, 14(4): 1-9.
[17]
杨庆霄, 徐俊英, 李文森. 海上溢油溶解过程的研究[J]. 海洋学报(中文版), 1994, 5(3): 50-56.
[18]
吴亚林. 桑沟湾楮岛鳗草(Zostera marina L. )资源变动的潜在影响因素及种子优选技术[D]. 上海: 上海海洋大学, 2018.
WU Yalin. Potential influencing factors and seed selection techniques of Zostera marina L. resource changes in Chadao, Sanggou Bay[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University, 2018.
[19]
李春燕, 沙婧婧, 周斌. 石油烃水溶液对鳗草(Zostera marina)几种主要抗氧化物的影响[J]. 海洋湖沼通报, 2021, 43(4): 133-139.
Effect of water accommodated fraction of petroleum hydrocarbons on the antioxidant system of Zostera marina marina[J]. Transaction of Oceanology and Limnology, 2021, 43(4): 133-139.
[20]
张飞, 郑凤英. MS培养基中氮、磷无机盐对鳗草克隆幼苗生存的影响[J]. 农学学报, 2020, 10(8): 57-62.
ZHANG Fei, ZHENG Fengying. Nitrogen and phosphorus inorganic salts in ms medium: effects on growth and survival of developing ramets[J]. Journal of Agriculture, 2020, 10(8): 57-62.
[21]
JACOBS R P W M. Distribution and aspects of the production and biomass of eelgrass, Zostera marina L., at Roscoff, France[J]. Aquatic Botany, 1979, 7: 151-172.
[22]
SIRON R, PELLETIER E, DELILLE D, et al. Fate and effects of dispersed crude oil under icy conditions simulated in mesocosms[J]. Marine Environmental Research, 1993, 35(3): 273-302.
[23]
苏正淑, 张宪政. 几种测定植物叶绿素含量的方法比较[J]. 植物生理学通讯, 1989(5): 77-78.
[24]
冯建灿, 胡秀丽, 毛训甲. 叶绿素荧光动力学在研究植物逆境生理中的应用[J]. 经济林研究, 2002(4): 14-18, 30.
FENG Jiancan, HU Xiuli, MAO Xunjia. Application of chlorophyll fluorescence dynamics to plant physiology in adverse circumstance[J]. Nonwood Forest Research, 2002(4): 14-18, 30.
[25]
张守仁. 叶绿素荧光动力学参数的意义及讨论[J]. 植物学通报, 1999(4): 444-448.
ZHANG Shouren. A discussion on chlorophyll fluorescence kinetic parameters and their significance[J]. Chinese Bulletin of Botany, 1999(4): 444-448.
[26]
陆秀君, 许有博, 李常猛, 等. 石油烃污染对三种灌木植物生理及叶绿素荧光参数的影响[J]. 北方园艺, 2009(8): 27-30.
LU Xiujun, XU Youbo, LI Changmeng, et al. Effect of petroleum hydrocarbon contamination on physiological and chlorophyll fluorescence response of three bush plants[J]. Northern Horticulture, 2009(8): 27-30.
[27]
马笛. 耐石油烃污染甜高粱种质的筛选及其对菲的响应[D]. 泰安: 山东农业大学, 2024.
MA Di. Screening of sweet sorghum germplasm resistant to petroleum hydrocarbon pollution and its response to phenanthrene[D]. Tai'an: Shandong Agricultural University, 2024.
[28]
李玲兰, 江志坚, 方扬, 等. 海草组学研究进展[J]. 科学通报, 2020, 65(35): 4063-4072.
LI Linglan, JIANG Zhijian, FANG Yang, et al. Advances in seagrass' omics research[J]. Scientific Bulletin, 2020, 65(35): 4063-4072.
[29]
ALLEN T, INGLES P J, PRAEKELT U, et al. Phytochrome‐ mediated agravitropism in Arabidopsis hypocotyls requires GIL1 and confers a fitness advantage[J]. The Plant Journal, 2006, 46(4): 641-648.
[30]
李先文, 谢素霞, 张苏锋, 等. 植物早期光诱导蛋白基因研究进展[J]. 植物生理学报, 2011, 47(6): 540-544.
LI Xianwen, XIE Suxia, ZHANG Sufeng, et al. Research advances in the genes of early light-induced proteins of plants[J]. Plant Physiology Journal, 2011, 47(6): 540-544.
[31]
何飞, 康菊清, 周鑫, 等. 中国野生拟南芥居群冷胁迫下的表达谱变异[J]. 科学通报, 2008, 53(18): 2206-2215.
[32]
马群, 丁明全, 沈昕, 等. 胡杨叶与根中特异性表达基因的表达谱分析[J]. 山东农业科学, 2007, 4(4): 39-42.
MA Qun, DING Mingquan, SHEN Xin, et al. Analysis of specific gene expression in leaf and root of Populus euphratica Oliver[J]. Shandong Agricultural Sciences, 2007, 4(4): 39-42.
[33]
ADAMSKA I, KLOPPSTECH K. Low temperature increases the abundance of early light-inducible transcript under light stress conditions[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 269(48): 30221-30226.
[34]
HOU Z, YANG Y, HEDTKE B, et al. Fluorescence in blue light (FLU) is involved in inactivation and localization of glutamyl‐tRNA reductase during light exposure[J]. The Plant Journal, 2019, 97(3): 517-529.
[35]
STAIGER D, ALLENBACH L, SALATHIA N, et al. The Arabidopsis SRR1 gene mediates phyB signaling and is required for normal circadian clock function[J]. Genes and Development, 2003, 17(2): 256-268.
[36]
KODAMA Y, SUETSUGU N, WADA M. Novel protein-protein interaction family proteins involved in chloroplast movement response[J]. Plant Signaling and Behavior, 2011, 6(4): 483-490.