2025, Vol. 49
文章信息
- 于金玉, 梁健, 梁爽, 王晓宇, 陈丽梅, 李永仁, 刘惠茹, 郭永军. 2025.
- YU Jinyu, LIANG Jian, LIANG Shuang, WANG Xiaoyu, CHEN Limei, LI Yongren, LIU Huiru, GUO Yongjun. 2025.
- 硬壳蛤MmDR2基因克隆及对溶藻弧菌的响应模式研究
- Cloning of the MmDR2 gene in Mercenaria mercenaria and its response pattern to Vibrio alginolyticus
- 海洋科学, 49(3): 51-63
- Marine Sciences, 49(3): 51-63.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20241117001
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文章历史
- 收稿日期：2024-11-17
- 修回日期：2025-01-21
2. 天津农学院 农业农村部智慧养殖重点实验室(省部共建), 天津 300384
2. Key Laboratory of Smart Farming, Ministry of Agriculture and Rural Affairs (Provincial and Ministerial Co-construction), Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
硬壳蛤(Mercenaria mercenaria)原产于美国, 1997年由张福绥等首次引入我国[1], 是广温、广盐性贝类, 其生长速度快, 且抗逆性强[2]。我国是双壳贝类养殖大国, 然而, 在贝类养殖过程中常暴露出一些问题, 如因环境胁迫和病原侵染引发的贝类死亡时有发生, 造成的经济损失巨大, 严重阻碍了海水养殖产业的绿色高质量发展[3]。弧菌病作为影响最严重的细菌性疾病, 制约着贝类养殖业的发展[4]。溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科, 弧菌属, 是一种兼性厌氧的革兰氏阴性短杆菌, 是近年来贝类病害中最常见的细菌性病原之一, 对贝类养殖产业的健康发展构成严重威胁[5-6], 可危害鱼类、节肢类、贝类等多种水产动物[7-9]。
神经内分泌免疫调节系统(neuroendocrine-immune regulatory system, NEI)是指由神经系统、内分泌系统和免疫系统组成的统一整体[10]。在脊椎动物中, 下丘脑-垂体-内分泌腺(如肾上腺、甲状腺、性腺等)调节轴是NEI的结构基础[11], 在机体生命活动中发挥重要作用。NEI通过释放各类信号分子(神经递质、神经调质、激素、细胞因子等)相互调节, 参与信号识别、信号转导、应答反应等生物学过程的调控[12]。近年的研究证明, 无脊椎动物中存在与高等动物类似的NEI系统[10]。无脊椎动物NEI结构相对简单, 但仍能在胁迫状态时迅速启动, 调节机体的各种生理活动, 以维持内环境稳态。例如, 贾云珂[13]在研究NEI对海洋无脊椎动物的影响时发现, NEI参与了中华绒螯蟹大眼幼体渗透压调节过程, NEI在长牡蛎中参与了细胞免疫和体液免疫调控。
多巴胺(Dopamine, DA)是NEI中重要的儿茶酚胺类神经递质[14], 作为神经递质, 多巴胺-多巴胺受体系统在动物环境适应过程中发挥着重要作用, 当胁迫状态下该系统启动一系列应激反应, 以维持内环境稳态[13]。DA通过激活多巴胺受体(dopamine receptor, DR)发挥其生物学功能, DR是典型的G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors, GPCRs)[13]。
多巴胺通过与多巴胺受体相互作用, 参与调节机体包括免疫生理在内的各项生命活动, 极有可能在调控硬壳蛤免疫生理过程中发挥重要作用。本研究拟围绕多巴胺NEI在硬壳蛤应对溶藻弧菌胁迫时所发挥的生物学功能展开研究, 研究结果一方面可辅助解析硬壳蛤在免疫调控中的遗传机理, 另一方面可加深我们对贝类神经内分泌系统的认知, 丰富并发展贝类神经内分泌学。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物健康状况良好的硬壳蛤(13.5±1.2) g采自天津恒迁水产养殖公司, 实验前将硬壳蛤外表面污物及附着生物等清洗干净, 随后置于养殖箱中进行为期1周的暂养。期间使用充氧泵连续曝气, 人工海水盐度为28±2, 水温保持在(24±1) ℃, 每天投喂新鲜的等鞭金藻藻液并定时更换海水, 及时清除死贝和水体中的残饵和粪便。
随机取健康硬壳蛤15只, 每5只为1个生物学重复, 取鳃、外套膜、闭壳肌、肝胰腺、性腺和血细胞, 并于液氮速冻24 h后, 转移至−80 ℃, 用于基因克隆和组织分布实验。用于攻毒的溶藻弧菌自天津养殖池塘采集的硬壳蛤体内分离, 对溶藻弧菌进行2次活化后扩大培养, 收菌后用无菌PBS洗涤3次后, 将菌液浓度稀释为1.53×108 cfu/mL(硬壳蛤亚致死浓度), 胁迫实验分3组, 对照组将200 μL 1×PBS自硬壳蛤铰合线处注射至闭壳肌内; 弧菌胁迫组注射200 μL溶藻弧菌菌液, 弧菌与DA联合胁迫组的弧菌注射量与弧菌组相同, DA的注射量为2.5×10−6 mol, 注射完毕后将其分别转移至已灭菌的洁净海水中暂养。分别在胁迫后的第6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 3 d, 5 d, 7 d, 14 d, 每组随机取9只贝, 每3只为一个生物学重复, 取消化腺和血细胞并置于液氮速冻24 h后, 再转移至−80℃冰箱中, 用于之后免疫和抗氧化相关酶活力及MmDR2基因对溶藻弧菌胁迫的响应模式测定。
1.1.2 主要试剂RNAprep pure Tissue Kit RNAprep pure购自TIANGEN公司, PrimeSTAR Max Premix高保真酶和SMARTer® RACE 5’/3’Kit购自TAKARA公司, First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace -α和SYBR® Green Realtime PCR Master Mix购自TOYOBO公司, 实验中所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2 MmDR2基因克隆 1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成总RNA的提取: 按照动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)操作说明, 提取硬壳蛤总RNA, 1 %琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性, 微量核酸定量仪检测RNA的浓度与纯度[15]。
cDNA合成: 逆转录根据反转录试剂盒操作说明进行, 反应体系为Oligo(dT)20(10 μmol/L)1 μL, RNA 1 μg, 加RNase Free H2O使总体积为12 μL。将配置好的反应体系放置在PCR仪中65 ℃孵育5 min, 完成后立即放置冰上。向上一步反应体系加5×RT Buffer 4 μL; dNTP Mixture 2 μL; RNase Inhibitor 1 μL; ReverTra Ace 1 μL在30 ℃ 10 min, 42 ℃ 20 min, 99 ℃ 5 min, 4 ℃ 5 min的程序中反应, 合成好的cDNA模板放于−80℃保存。
1.2.2 MmDR2基因扩增为获得MmDR2基因3’和5’非编码区序列信息并验证已有MmDR2基因序列(XP_045188647.2)的正确性, 以硬壳蛤cDNA为模板, 通过Primer Primer 5.0软件设计引物(表 1), 根据PrimeSTAR Max Premix高保真酶和SMARTer® RACE 5’/3’Kit的操作说明进行PCR和非编码区扩增。
| 引物 | 序列(5’~3’) | 用途 |
| DR2-F | AGT CGG TCG AGT TGA AAC TGG TGT | 验证序列 |
| DR2-R | TCA GGA AGA GAC TCG TGG TGC ATT | 验证序列 |
| 3-UP(dT)18-F | CGGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT | 3’RACE |
| 3GSP1-R | GTGATAGTGACGAGGAAGATACGGA | 3’RACE |
| UP-F | CGGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC | 3’RACE |
| 3GSP2-R | AAATCAGCACCACAATCAAAGACCA | 3’RACE |
| 5'link-F | AATGGTATGTCTCTCGGAACTGTCA | 5’RACE |
| 5GSP1-R | AACGGCATAACAATCCCTCCAACCA | 5’RACE |
| 5GSP2-R | ATTTCATCAGTCGCTTCTGTCGTGT | 5’RACE |
| DR2-F | ATGTGGTGAATGTGTGCG | RT-qPCR |
| DR2-R | TTGCCGTCTTCTTGTCTG | RT-qPCR |
| EF1a-F | AGT CGG TCG AGT TGA AACTGG TGT | 内参基因 |
| EF1a-R | TCA GGA AGA GAC TCG TGG TGC ATT | 内参基因 |
运用DNAMAN8.0对克隆的中间片段、3’端片段和5’端片段进行比对和拼接; 全长cDNA序列分析通过NCBI在线比对数据库进行; 氨基酸序列的主要理化性质预测通过Expasy的ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)进行; SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)预测其结构域[16]; 利用在线工具SWISS-MODEL对DR2蛋白进行三级结构建模, 使用NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和ESPrint3.0进行DR2蛋白序列比对; 使用Mega11软件构建系统进化树。
1.4 实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR按照说明体系加样, SYBR® Green Realtime PCR Master Mix 10 μL; cDNA模板1 μL; RNase-Free ddH2O 7 μL; DR2-F DR2-R引物各1 μL, 共计20 μL。实时荧光定量PCR反应条件: 94 ℃ 3 min、98 ℃ 10 s、55 ℃ 10 s、72 ℃ 10 s, 35个循环, 72 ℃ 10 min、12 ℃保存。采用相对定量法, 通过2−ΔΔCt方法计算MmDR2相对表达量。使用SPSS统计学软件进行显著性检验, 数据统计的显著性水平定为P < 0.05。
1.5 酶活测定方法使用南京建成生物工程研究所生产的酶活试剂盒测定酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM), 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)。ACP和AKP使用微量酶标法测定, LZM使用比浊法测定, SOD使用羟胺法测定, CAT使用微板法测定, GPx使用比色法测定。蛋白测定用Biosharp公司采购的BCA试剂盒测定, 以上测定均按试剂盒说明书进行。
1.6 数据处理与分析实验结果使用GraphPad Prism 8.0.2软件作图, 数据以平均值±标准误(Mean±SEM)表示, MmDR2基因mRNA各组织的相对表达量的数据使用单因素方差分析(One-way ANOVE), 事后检验采用Duncan法进行多重比较, 血细胞中的mRNA相对表达量、硬壳蛤消化腺ACP、AKP、LZM、SOD、CAT和GPx活力的数据采用双因素方差分析(Two-way ANOVE)[17], 事后检验使用Bonferroni post tests, 数据统计的显著性水平为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 MmDR2基因克隆与序列分析采用RACE技术扩增获得MmDR2基因cDNA全长为1 464 bp, 其中5’ UTR为663 bp, 3’ UTR为87 bp, 包含23 bp的poly A尾, 共编码487个氨基酸(图 1)。该蛋白具有7个跨膜结构域, 通过250次模拟对接后, 得到DA与DR2能量最低的对接结果, DA进入到DR2分子的空腔内不同的氨基酸残基(Tyr 689, Thr 629, Lys626)在空间上与DA的结构相匹配(图 2)。
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| 图 1 MmDR2基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide sequence of the MmDR2 gene and its encoded amino acid sequence 注: 绿色方框: 起始密码子和终止密码子; 黄色填充: 7tmA_Dop1R2-like结构域; 大写字母: 5’UTR和3’UTR |
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| 图 2 DR2蛋白三级结构预测 Fig. 2 Three-dimensional structure of DR2 |
对MmDR2基因推导的氨基酸序列进行比对分析, 从NCBI数据库中下载其他物种的DR2氨基酸序列, 共计22种, 使用NCBI Blast比对DR2基因蛋白序列的同源性, 并进行序列比对(图 3)和系统发育进化树分析(图 4)。序列比对的结果显示, 硬壳蛤DR2与斑马贻贝(Dreissena polymorpha)和砂海螂(Mya arenaria)相似度较高, 分别为79.69%和75.10%, 系统发育进化树结果也显示硬壳蛤DR2首先与斑马贻贝和砂海螂的DR2聚为一支, 然后与虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)和加州贻贝(Mytilus californianus)的DR2聚为一支。
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| 图 3 MmDR2氨基酸序列与其他物种DR2氨基酸序列的比对分析结果 Fig. 3 Alignment analysis results of the MmDR2 amino acid sequence with those of DR2 from other species 注: 红底白字部分: 氨基酸序列相似性达100%。MmDR2: 硬壳蛤; MaDR2: 砂海螂; DpDR2: 斑马贻贝; GaDR2: 神盾螺; MyDR2: 虾夷扇贝; HrDR2: 红鲍; McDR2: 加州贻贝; PoDR2: 海蛞蝓; AcDR2: 加州海兔: HsDR2: 智人; RnDR2: 褐家鼠; DmDR2: 黑腹果蝇; SsDR2: 野猪; GgDR2: 原鸡; DrDR2: 斑马鱼; CiDR2: 玻璃海鞘; TrDR2: 红鳍东方鲀; AgDR2: 冈比亚按蚊; EsDR2: 中华绒螯蟹; PiDR2: 断沟龙虾; SmDR2: 大菱鲆; PjDR2: 日本对虾 |
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| 图 4 DR2系统进化树 Fig. 4 DR2 phylogenetic tree 注: MEGA11邻接法构建系统进化树, 重复次数为1 000, 节点上数字表示置信度, 括号里面的百分号表示与硬壳蛤的相似度, 后面为该物种在NCBI的登录号 |
组织分布的结果如图 5所示, 硬壳蛤MmDR2基因在各组织中均有分布, 其表达量从高到低依次为鳃、外套膜、血细胞、闭壳肌、肝胰腺、性腺; MmDR2基因在鳃中表达量最高, 相对表达量约为性腺的5.6倍; 外套膜的表达量约为性腺的4.5倍; 血细胞约为性腺的4.1倍; 闭壳肌、肝胰腺分别为性腺的3.7倍、2.2倍。
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| 图 5 MmDR2基因mRNA各组织的相对表达量 Fig. 5 Relative expression levels of MmDR2 mRNA in each tissue 注: 含任一相同字母表示组间差异不显著(P > 0.05) |
MmDR2基因对溶藻弧菌胁迫的响应模式结果如图 6所示, MmDR2基因呈现先升高, 直至到达峰值, 后随胁迫时间增长再恢复至对照水平的表达模式。溶藻弧菌刺激硬壳蛤6 h, MmDR2基因的相对表达量显著上升至峰值, 与对照组相比, 其相对表达量是对照组的3.56倍, 12 h时, 其相对表达量有所下降, 但仍显著高于对照组(P < 0.000 1), 是对照组的3.05倍。自24 h开始, MmDR2基因的表达量恢复至正常水平, 即0 h、24 h、48 h、72 h时, MmDR2基因在实验组和对照组中的相对表达量无显著性差异(P > 0.05)。
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| 图 6 硬壳蛤MmDR2基因溶藻弧菌胁迫下血细胞中mRNA相对表达量 Fig. 6 Relative expression of MmDR2 mRNA in blood cells of hard-shelled clam under V. alginolyticus stress 注: 每个柱状图代表样本的平均值±标准差。显著差异用星号表示(****P < 0.000 1) |
溶藻弧菌、溶藻弧菌与DA联合刺激对硬壳蛤消化腺免疫相关酶(ACP、AKP和LZM)活性影响如图 7所示, 溶藻弧菌感染硬壳蛤不同时间, 其消化腺中免疫酶活力整体呈先上升后下降的趋势, 与弧菌胁迫组不同, 弧菌与DA联合刺激组硬壳蛤消化腺中的ACP、AKP和LZM活力则整体呈抑制状态。
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| 图 7 溶藻弧菌、溶藻弧菌与DA联合刺激对硬壳蛤消化腺ACP、AKP和LZM活力的影响 Fig. 7 Effects of V. alginolyticus and the combined stimulation of V. alginolyticus and DA on the activities of ACP, AKP, and LZM in the digestive gland of M. mercenaria 注: 每个柱状图代表 3个样本的平均值±标准差。显著差异用星号表示(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1) |
与对照组相比, 溶藻弧菌组的ACP酶活力虽在1 d时有轻微升高, 但并未出现显著差异(P > 0.05), 在5 d极显著升高(P < 0.000 1), 在7 d时表现为极显著降低(P < 0.001), 直至14 d时恢复至正常水平(P > 0.05); 溶藻弧菌与DA联合刺激组ACP酶活力在1 d时虽呈降低趋势, 但并未出现显著差异(P > 0.05), 但自5 d开始, ACP酶活力呈现极显著下降(P < 0.001)。与溶藻弧菌组相比, 溶藻弧菌与DA联合刺激组的ACP酶活力在1 d时显著下降(P < 0.05), 在5 d时表现为极显著差异(P < 0.000 1)。LZM酶活力的变化趋势与ACP相似, 与对照组相比, 弧菌组的LZM整体呈先升高后降低的变化趋势, 其中在5 d时极显著高于对照组(P < 0.000 1), 其他时间点未出现显著差异(P > 0.05), 然后溶藻弧菌与DA联合刺激组LZM自1 d其均呈现显著降低的现象(P < 0.01)。弧菌组AKP酶活力的变化趋势略有不同, 与对照组相比, 其虽在1 d、5 d略有升高, 但未出现显著差异(P > 0.05), 但在7 d、14 d时则表现为极显著降低(P < 0.000 1)。
2.5.2 溶藻弧菌、溶藻弧菌与DA联合刺激对硬壳蛤消化腺抗氧化相关酶的影响溶藻弧菌、溶藻弧菌与DA联合刺激对硬壳蛤消化腺抗氧化相关酶(SOD、CAT和GPx)活性的影响如图 8所示, 与对照组相比, 溶藻弧菌胁迫组的抗氧化酶活力总体呈现先上升后下降的趋势, 在第5 d时达到峰值, 随后呈现下降趋势。
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| 图 8 溶藻弧菌、溶藻弧菌与DA联合刺激对硬壳蛤消化腺SOD、CAT和GPx活力的影响 Fig. 8 Effects of V. alginolyticus and the combined stimulation of V. alginolyticus and DA on the activities of SOD, CAT, and GPx in the digestive gland of M. mercenaria 注: 每个柱状图代表 3个样本的平均值±标准差。显著差异用星号表示(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1) |
与对照组相比, 1 d时, 溶藻弧菌组SOD活力极显著下降(P < 0.000 1), 但5 d和7 d时, 极显著高于对照组(P < 0.01), 直至14 d时恢复至正常水平(P > 0.05), 溶藻弧菌与DA联合刺激组的SOD酶活力在第1 d时虽略低于对照组, 但并未出现显著差异(P > 0.05), 5 d和14 d时, 其活力明显低于对照组(P < 0.05)。5 d和7 d时, 极显著低于弧菌胁迫组的SOD活力; 与对照组相比, 溶藻弧菌组1 d时CAT酶活力虽极显著降低(P < 0.001), 但自5 d起, 其活力均显著高于对照组, 溶藻弧菌与DA联合刺激组的CAT酶活力与对照组相比, 并未出现显著差异。溶藻弧菌组的GPx酶活力仅5 d时极显著高于对照组(P < 0.000 1), 其他时间均极显著降低(P < 0.001), 溶藻弧菌与DA联合刺激组的GPx酶活力除1 d略高于对照组, 其他时间均处于抑制状态。
3 讨论与结论双壳贝类神经内分泌免疫系统(NEI)在调控机体各类生命活动中发挥着重要作用, 涉及个体发育、内稳态调节及免疫应答多个方面[10, 13]。多巴胺(DA)是一种无处不在的神经递质, 存在于各种动物的中枢和外周神经系统中, 参与多种行为和生理功能[18-19], DA与受体参与调节海洋双壳贝类的渗透压平衡、免疫应答及幼虫的变态发育等关键生物学过程[13-14]。在脊椎动物中, 根据对腺苷酸环化酶(adenylcyclase, AC)活性的影响, 将多巴胺受体分为D1和D2两类[20]。D1受体包括多巴胺受体1(DR1)和多巴胺受体5(DR5)两种亚型, 这类受体的第三胞内环较短, 但C-末端较长, 它们与GPCRs偶联, 当DA与其结合后激活, 通过增强AC活性, 大大提升机体内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的浓度。D2亚型受体包括多巴胺受体2(DR2)、多巴胺受体3(DR3)、多巴胺受体4(DR4), 在第五、六跨膜结构域间具有较长的第三胞内环和较短的C-末端, 它们与GPCRs偶联, 对AC活性起抑制效应, 导致机体内cAMP浓度显著降低[21-22]。在无脊椎动物中, 除发现与脊椎动物结构相似的D1(DOP1 group)和D2(D2-like)两类受体, 还发现了无脊椎动物特有的INDR型受体(invertebrate dopamine receptor, INDR), INDR型受体启动通路的方式与脊椎动物的D1和无脊椎动物的DOP1 group受体类似, 可有效提升机体cAMP的水平, 但结构上, 它具有较长的第三胞内环, C-末端却比D2类受体短[23-24]。
DR2作为多巴胺受体的其中的一个亚型, 连接神经系统和免疫系统, 在免疫系统调节中起着重要作用[25]。有关DR2在双壳贝类中的作用已有报道, 如DR2可以控制美洲牡蛎的侧纤毛活动, 调节神经系统并参与缢蛏的抗氧化反应[18-19], 本研究克隆得到了MmDR2基因的全长, 预测了该基因的疏水结构域, 表明其具有7个跨膜结构域, 是典型的G蛋白偶联受体结构, 且具有典型的DA结合位点, 推测DA与MmDR2相互作用来调节硬壳蛤的应激反应, 帮助其适应外界不良环境如温度变化、盐度波动、污染物暴露等变化。
为进一步探讨MmDR2基因的功能, 采用实时荧光定量PCR检测了MmDR2基因在硬壳蛤不同组织中表达量情况。结果表明, MmDR2基因虽然在研究中的6种组织中均有表达, 但鳃组织中的表达水平显著高于其他组织, 说明其表达水平具有较强的组织特异性, 由于硬壳蛤是滤食性动物, 鳃组织经常接触到污染物, 可过滤水中的细菌和有害物质及抵御细菌和毒性物质, 属于贝类免疫系统中不可或缺的一环[26-29], 在大多数双壳类动物中, 鳃丝侧纤毛的异时性摆动时产生水流, 有利于呼吸和进食, 鳃的呼吸和摄食功能的整合涉及神经系统[30]。因此本研究推断DR2基因可能在硬壳蛤的先天免疫防御系统中发挥作用, MmDR2基因在硬壳蛤外套膜和血细胞中有较高表达, 外套膜直接接触外界环境, 是贝类的重要器官, 主要功能是包裹和保护内部器官, 同时还具有辅助呼吸、摄食等功能[31-32], 血细胞则是贝类体内抵御外来病原生物侵袭的主要“屏障”[33]。缢蛏多巴胺受体基因在成体各组织的表达检测发现, ScDopR2-1基因在鳃和外套膜中的表达量也较高[14]。贝类的细胞免疫和体液免疫协同作用, 共同保护机体免受病原体的损害[26]。MmDR2基因在以上组织中高表达, 暗示其可能参与硬壳蛤的免疫防御。
溶藻弧菌是革兰氏阴性菌, 广泛存在于海洋环境和海洋生物中, 是鱼类、虾类和贝类等海水养殖动物的主要病原菌[34]。而贝类缺乏免疫球蛋白和淋巴细胞, 当有外来异物入侵时, 会引发贝类机体产生一系列的免疫反应, 只能依赖非特异性免疫, 贝类通过模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)可精准辨别不同的病原体, 最终借助细胞免疫和体液免疫来实现对病原菌的清除, 贝类的免疫防御机制主要由血细胞来执行[35-36], 因此本研究采用实时荧光定量PCR检测MmDR2基因在溶藻弧菌胁迫下血细胞中mRNA相对表达量情况, 结果发现, MmDR2基因相对表达量呈先上升后下降的变化趋势, 其中在6 h达到峰值。在缢蛏的鳗弧菌胁迫实验结果显示, ScDopR2-2基因的表达量呈现先升高后下降的趋势, 实验结果在注射的2 h、4 h表达量升高, 在8 h、12 h、24 h表达量下降[14], 在鳗弧菌对缢蛏的弧菌感染实验中, ScDopR2-1在SWB和InB组中, 其表达显示出相同的模式, 表达量先是增加, 然后减少, 后期波动很小。此外, 在SWB和InB组中, ScDopR2-1的表达在2 h时显著上调的趋势[25]。这与本研究的变化趋势基本一致, 其基因表达量都呈现先上升后下降的趋势, 表明内分泌系统对免疫应答具有一定的调控作用, 进一步证明了MmDR2基因在硬壳蛤的免疫调节中发挥重要作用。
弧菌胁迫浓度对研究溶藻弧菌感染硬壳蛤的消化腺酶活性变化起着关键作用。浓度过大会造成硬壳蛤短时间内急性死亡, 而浓度过低则容易造成感染强度不大, 硬壳蛤各种免疫反应过缓[37]。本研究通过预实验摸索出较适宜的感染浓度(亚致死浓度)可保证在该浓度胁迫下, 能引起硬壳蛤产生较强的免疫反应。
ACP和AKP是巨噬细胞溶酶体的标志酶, 研究发现, 在养殖动物受到胁迫或处于应激状态时, 这两个酶的活性往往出现异常升高的现象, 养殖环境的变化均会导致受试动物体内磷酸酶活性发生改变, 往往表现出先诱导后抑制的效果[38-39]。本研究中, 在弧菌胁迫组中, ACP和AKP呈现先上升后下降的趋势, 说明在弧菌胁迫初期, 硬壳蛤处于应激状态, 随着胁迫时间的延长, 硬壳蛤逐渐适应环境, 免疫活力也逐渐趋于稳定。LZM是参与免疫防御的重要酶类[40], 通常双壳类动物在受到外界刺激及病原菌入侵时, 会释放溶菌酶行使免疫功能[41]。溶菌酶活性在第5 d时达到最高峰, 后趋于稳定, 说明硬壳蛤在受到溶藻弧菌胁迫时, 体内的弧菌量增加, 溶菌酶的含量迅速降低, 随着弧菌胁迫时间的延长, 硬壳蛤的机体非特异性免疫增强, 溶菌酶活性趋于稳定状态。实验结果表明, 硬壳蛤在弧菌侵染后体内溶菌酶的含量上升, 宿主的非特异性免疫功能增强, 加强了硬壳蛤对弧菌的耐受能力[42]。
SOD、CAT、GPx是生物抗氧化防御系统几种最重要的酶[43], 其活力变化可以指示溶藻弧菌对贝类抗氧化防御系统的影响, 从而表明硬壳蛤的氧化损伤程度。溶藻弧菌胁迫组的抗氧化相关酶活性呈现波动趋势, 总体在感染初期被显著抑制, 呈现先上升后下降的趋势, 说明硬壳蛤在经过溶藻弧菌胁迫后抗氧化相关酶的活性会受到先诱导后抑制, 随着接触溶藻弧菌的时间越长, 酶活性受到的抑制会更强烈。抗氧化酶活性的下降可能是溶藻弧菌感染引起的氧化应激的直接结果。它们的活性降低表明硬壳蛤的抗氧化能力受到了损害, 这可能是因为溶藻弧菌产生的外毒素或内毒素直接损伤了细胞内的抗氧化防御系统, 增加了自由基的产生, 超出了抗氧化系统的清除能力。
弧菌与DA联合刺激下, 免疫酶和抗氧化酶活力与对照组相比较为稳定, 硬壳蛤体内免疫和抗氧化相关酶活性总体表现为抑制状态。胡发文等[44]在注射生物胺对凡纳滨对虾免疫指标的影响中发现注射DA后对虾的溶菌和抗菌活力显著下降, 溶菌和抗菌活力在24 h后保持稳定, 稳定后各处理组免疫指标与对照组均无显著差异, 这与本实验的研究结果基本一致。由此推测多巴胺在硬壳蛤免疫应答过程中发挥着重要的调节作用, 可作为一种神经内分泌信号, 引发免疫应激适应, 导致免疫防御能力下降。免疫和抗氧化酶活力结果反映了不同处理对硬壳蛤免疫反应的影响。时间和组别之间存在显著的交互作用, 表明不同处理在不同时间点上对酶活力的影响不同。
本研究以MmDR2基因为研究对象, 通过对其序列、理化性质、结构及表达进行研究, 由此推测多巴胺在硬壳蛤免疫应答过程中发挥着重要的调节作用, 可作为一种神经内分泌信号, 引发免疫应激适应, 结果表明MmDR2在硬壳蛤的抗感染免疫中发挥重要生物学作用。
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