2025, Vol. 49
文章信息
- 李嘉鑫, 王宝杰, 刘梅, 蒋克勇, 王雷. 2025.
- LI Jiaxin, WANG Baojie, LIU Mei, JIANG Keyong, WANG Lei. 2025.
- 一株海水来源的弧菌拮抗菌的筛选、应用以及抑菌机制初探
- Screening, application, and preliminary exploration of the antibacterial mechanism of the VpAHPND antagonistic bacterium isolated from seawater
- 海洋科学, 49(3): 93-106
- Marine Sciences, 49(3): 93-106.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20240417002
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文章历史
- 收稿日期：2024-04-17
- 修回日期：2024-06-21
2. 中国科学院 海洋大科学中心, 山东 青岛 266071;
3. 中国科学院大学, 北京 100049;
4. 山东省海洋科学研究院, 山东 青岛 266104
2. China Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. Marine Science Research Institute of Shandong Province, Qingdao 266104, China
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)具有生长快、环境适应能力强等特点, 是最有经济价值的水产养殖品种之一。但是, 对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)的暴发制约着对虾养殖业的发展。AHPND由携带pirABvp毒力基因的副溶血弧菌引起[1], 多发生于放苗后1~9周, 暴发后几天内对虾死亡率可以高达100%, 感染后最具代表性的特征为上皮细胞大量脱落[2], 肝胰腺是AHPND感染过程中最重要的指示器官。由于错误地、大量地使用抗生素, 细菌在不断筛选中获得耐药性, 例如, Karunasagar等[3]报道了一株引起斑节对虾(Penaeus monodon)幼苗大规模死亡的哈维氏弧菌, 其具有多重抗生素耐药性。为了应对药物可持续性和公共食品安全问题, 抗生素正逐渐被噬菌体、植物天然提取物、益生菌、益生元、水产疫苗等更环保的方式取代[4-5]。
与陆地动物不同, 水生动物被条件致病菌环绕, 环境恶化致使病原菌达到高丰度水平后可引起养殖生物感染, 因此, 水环境中的细菌群落组成对养殖生物具有直接影响。研究表明, 无节幼体的表面微生物群组成直接取决于孵化时水中的微生物[6], 成鱼的肠道微生物群会受到鱼苗的食物和周围水环境“先锋”细菌的极大影响[7], 对虾弧菌病的暴发是由于大规模弧菌接触的结果[8]。
益生菌拮抗弧菌属细菌以分泌抗菌物质、竞争、捕食、干扰等机制最为常见。微生物分泌的抗菌物质种类众多, 化学本质不同, 如短小芽孢杆菌H2菌株(Bacillus pumilus H2)分泌的大环内酯类物质能破坏创伤弧菌的细胞膜[9]。竞争机制中最典型的是分泌铁载体和竞争生态位, 如Vibrio sp. 33通过分泌更多的铁载体吸收环境中的生存必需铁, 从而对脾弧菌产生拮抗作用[10], Wang等[11]在假交替单胞菌与溶藻弧菌之间观察到竞争生态位现象。捕食作用发生在个体相近的2种细菌之间, 通过杀灭猎物获得营养, 同时, 捕手细菌也会产生丰富的次生代谢物和降解酶[12]。对弧菌属细菌的捕食作用分为内源性、外源性2种。内源性捕食如蛭弧菌通过侵袭细菌的外周质进行杀菌, 对虾感染AHPND的严重程度与肠道内蛭弧菌的相对丰度呈现负相关[13]。外源性策略依赖于细胞与细胞之间的接触, 捕食者附着在细胞的外表面, 对猎物进行降解。如一株腐败螺旋菌(Saprospira)属细菌在裂解VpAHPND细胞前几分钟附着在猎物细胞表面并与之形成细胞聚集体, 该方式杀灭弧菌速度比蛭弧菌快, 约为4 h[14]。除此之外, 益生菌还通过降解群体感应信号分子的方式进行干扰, 如蜡样芽孢杆菌能够降解哈维氏弧菌和溶藻弧菌产生的酰基高丝氨酸内酯 [15]。
微生物在水产养殖环境中天然存在, 在水产病害防控起着重要作用[16], 但是常用的商业菌株多为陆地来源, 由于缺乏生态位而不易在海水以及对虾肠道中建立种群[17]。根据生态位理论评估, 假交替单胞菌是预防AHPND的潜力菌属, 因为其属于海洋细菌以及能适应对虾肠道环境条件, 能更好地提高益生菌群的建立和预期拮抗效果[17]。
为了拮抗VpAHPND, 本文筛选出一株海洋来源的益生菌, 通过实验探究其拮抗VpAHPND效果、抑菌机制以及在凡纳滨对虾抗AHPND生产上的应用效果, 以期为凡纳滨对虾的急性肝胰腺坏死病防控提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 实验用虾实验用虾来自山东省日照市育苗场, 安全性实验所用对虾的规格为PL12仔虾, 成虾体质量(6.75±0.12) g暂养于青岛瑞滋集团有限公司养殖车间。养殖期间水温(28±2) ℃, 海水盐度为30.8, pH值为7.8~8.1, 连续曝气。
1.2 实验用菌本实验所用副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus E1 (以下简称VPE1)菌株为一株携带pirABvp毒力基因的VpAHPND, 由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供。
1.3 样品采集与菌株分离纯化取山东省东营市河口区各养殖虾池排污海水, 放入无菌采样瓶中运回实验室。在灭菌条件下, 将样品涂布于2216E琼脂培养基上, 挑取不同形态的单菌落进行纯培养。
1.4 拮抗菌的筛选与鉴定 1.4.1 菌株初筛与复筛往已冷却至50 ℃左右的琼脂培养基中注入一定数量的对数生长期VPE1菌液, 混合均匀, 倾注平板, 水平静置, 凝固后备用。使用平板对峙法[18]进行初筛, 取纯培养的候选菌株在含有VPE1的琼脂板上点种, 28 ℃倒置培养24 h, 将平板上出现抑菌圈的候选菌株纯化后进行保种(50%甘油, −80 ℃)。使用打孔法[19]进行复筛, 对比各菌株抑菌圈大小, 选出抑菌圈最大的一株菌, 进行后续实验。
1.4.2 菌株的16SrDNA测序以及构建系统发育树按照TIANGEN®细菌基因组DNA提取试剂盒说明书, 提取得到细菌基因组DNA。以细菌的DNA为模板, 采用通用引物27F和1492R(如表 1所示)进行PCR反应, PCR扩增反应程序为: 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸100 s, 30个循环。上述反应的PCR产物送至擎科生物技术有限公司进行二代测序分析(Tsingke Biotech, Qingdao)。将测序得到的16SrDNA序列输入NCBI数据库中进行Nucleotide BLAST比对。使用iTOL网页版构建系统发育树。使用MAFFT法进行序列差异和同源性分析, 使用最大似然法(maximum likelihood, ML)构建系统发育树。
| Primer | Sequence(5′-3′) |
| 27F | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG |
| 1492R | GGTTACCTTGTTACGACTT |
| gyrB-F | TCCGGCGGTCTGCACGGCGT |
| gyrB-R | TTGTCCGGGTTGTACTCGTC |
| ropD-F | GAAGGCGAAATCGACATCGC |
| ropD-F | GAAGGCGAAATCGACATCGC |
| ropD-R | ATGCTCATGCGRCGGTTGAT |
Ps1125的基因提取、菌株PCR扩增与测序、BLAST比对方法同1.4.2, 使用gyrB、ropD基因的引物如表 1所示, 使用MEGA11.0软件构建系统发育树。使用ClustalW法进行序列差异和同源性分析, Bootstrap法进行1 000次检验, 使用邻接法(Neighbor- Joining, N-J)构建系统发育树。
1.5 菌株抑制副溶血弧菌效果从−80 ℃冰箱取出假交替单胞菌Ps1125和副溶血弧菌VPE1, 分别接种于2216E液体培养基中, 放置于恒温振荡器(28 ℃, 180 r/min)中过夜培养14 h。活化后菌株接种于新的无菌2216E液体培养基中, 放置于恒温振荡器(28 ℃, 180 r/min)中过夜培养。使用细菌浊度计分别测量菌液浓度, 使用PBS(pH 7.4)将处于对数生长期的副溶血弧菌VPE1菌液稀释至终浓度为1×107 CFU/mL, 取100 µL涂布于2216E固体培养基平板上, 制作含有弧菌的平板。培养基自然晾干后, 采用打孔器等距打4个直径为4 mm的孔, 实验组3个孔内加入10 µL Ps1125的菌液(设置浓度梯度分别为1×107 CFU/mL、1×108 CFU/mL、1×109 CFU/mL)。阳性对照组加入等量0.1 mg/mL氟苯尼考(纯度≥98%), 28 ℃, 正置培养24 h后测量抑菌圈大小, 实验重复3次。使用游标卡尺和十字交叉法测量抑菌圈大小(单位: mm)。
1.6 Ps1125对PL12仔虾的生物安全性实验使用浸泡法评估Ps1125对PL12仔虾的安全性。设置对照组和实验组, 每组3个重复, 每个烧杯中加入无菌海水99 mL, 放入50尾PL12阶段仔虾。实验组中将过夜培养的Ps1125发酵液离心(4 ℃, 3 000 r/min, 10 min)后去除上清, 菌体在灭菌海水中重悬, 使用浊度计调整Ps1125浓度为1×109 CFU/mL, 加入1 mL菌悬液使得终浓度为1×107 CFU/mL, 连续充氧, 统计24 h后存活率。
1.7 水体添加Ps1125养殖实验将Ps1125的过夜培养物加入对虾养殖水体。对照组添加等量无菌海水, 2个实验组通过添加Ps1125过夜培养物使得水体中该菌株终浓度分别为1×105 CFU/mL、1×106 CFU/mL。每隔2 d加一次菌, 每4 d换一次水, 换水量为水体体积的50%。养殖周期21 d, 期间每隔7 d取养殖水样和对虾肝胰腺, 用平板菌落计数法[20]对总弧菌数量和绿弧菌数量进行计数(注: 绿弧菌数量指的是在TCBS琼脂培养基上不发酵蔗糖产酸使得单菌落呈现蓝绿色的菌, 一般认为是副溶血弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌[21-22])。养殖21 d结束后, 将养殖用水连带对虾一起, 进行为期96 h的副溶血弧菌攻毒实验, 记录存活率。攻毒前视为0 h, 攻毒期间每隔48 h取对虾肝胰腺进行弧菌计数。
1.8 抑菌机制探究 1.8.1 菌株抑菌物质定位菌株活化与传代培养方法同1.5。将2216E固体培养基灭菌(121 ℃, 15 min)后倾倒平板, 自然晾干。将传代培养的副溶血弧菌VPE1发酵液根据细菌浊度调整浓度为1×107 CFU/mL, 取100 µLVPE1均匀涂布在2216E固体培养基平板上, 用直径4 mm打孔器在弧菌琼脂板上等距打5个孔, 备用。分别在孔内加入10 μL假交替单胞菌Ps1125培养液、活菌体悬液、无细胞上清液、胞内产物悬液, 以及加入等量PBS(pH 7.4)作阴性对照。实验设置3个重复, 28 ℃, 在恒温培养箱中正置培养24 h后观察抑菌圈。
活菌体悬液的制备: 将Ps1125菌液离心(12 000 r/min, 10 min, 4 ℃)后移除上清液, 加等量PBS(pH 7.4)溶液使菌细胞重悬, 获得活菌体悬液。无细胞上清液的制备: 取细菌生长平台期中后期的Ps1125菌液, 稀释至1×107 CFU/mL浓度后, 12 000 r/min, 4 ℃离心10 min, 取上清液, 使用0.22 μm滤膜过滤, 获得无细胞上清液。胞内产物悬液的制备: 取浓度为1×107 CFU/mL的Ps1125菌液, 离心(12 000 r/min, 10 min, 4 ℃)后弃上清液, 加入与菌液同体积的PBS溶液(pH 7.4)使菌细胞重悬, 使用超声破碎仪破碎菌体(50 Hz, 1 000 W, 全程2 s, 间隔时间0.5 s, 持续60 min)获得胞内产物。破碎后的菌悬液在2216E琼脂板上涂布和培养, 确保菌体完全死亡。
1.8.2 Ps1125与弧菌VPE1共培养实验菌株的活化与传代培养方法同1.5。将振荡培养14 h的Ps1125和VPE1的菌液离心(12 000 r/min, 10 min, 4 ℃)后使用PBS(pH 7.4)对菌细胞进行重悬, 根据细菌浊度分别调整两株菌浓度至1×107 CFU/mL。各取100 µL副溶血弧菌VPE1与假交替单胞菌Ps1125菌悬液, 同时加入100 mL 2216E液体培养基中, 使得每一种菌的终浓度约为1×104 CFU/mL。共培养液在28 ℃, 180 r/min条件下振荡培养, 分别在0、3、6、9、12 h采集共培养菌液, 使用平板菌落计数法分别统计VPE1和Ps1125数量, VPE1涂布于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(TCBS)琼脂培养基, Ps1125涂布于2216E琼脂培养基(已知Ps1125无法在TCBS琼脂培养基上生长)。
1.8.3 上清液、死亡菌体与弧菌VPE1共培养实验菌株的活化与传代培养方法同1.5。使用细菌浊度计调整VPE1、Ps1125的菌细胞悬液为1×105 CFU/mL。Ps1125过夜培养物离心(12 000 r/min, 4 ℃, 10 min)后的上清液经过0.22 μm滤膜过滤得到无细胞上清液。离心后的菌细胞重悬于10%福尔马林溶液中, 室温放置5 min后离心弃上清液, 使用PBS(pH 7.4)洗涤2次以去除残留的福尔马林, 将细胞重悬在PBS或经过无菌过滤的菌上清液中, 获得死亡菌体。
在100 mL 2216E液体培养基体系中, 对照组加入10 mL PBS(pH 7.4), 实验组分别加入5 mL Ps1125无细胞上清液和5 mL PBS、5 mL Ps1125死亡菌体和5 mL无细胞上清液、5 mL Ps1125死亡菌体和5 mL PBS, 各组均加入5 mL VPE1菌细胞悬液, 在28 ℃, 180 r/min条件下振荡培养, 分别在0、3、6、9、24 h采集共培养菌液, 使用平板菌落计数法在TCBS平板上涂布, 计算副溶血弧菌的数量[23]。每组设置3个生物学重复。
1.8.4 膜分隔共培养实验通过假交替单胞菌Ps1125和副溶血弧菌VPE1在带分隔膜的六孔细胞培养板里共培养探究抑菌是否需要接触抑制。8.0 μm孔径的膜允许细菌细胞自由进出, 0.4 μm孔径的膜将两株细菌细胞分隔在上下2个空间, 限制了菌细胞的运动。使用PBS调整Ps1125和VPE1的菌细胞悬液的浓度为1×105 CFU/mL, 在膜分隔的2个腔室中分别加入150 µL菌细胞悬液和1 350 µL 2216E液体培养基, 使得初始菌浓度为1×104 CFU/mL。在28 ℃, 70 r/min条件下培养, 并在第0、3、6、9、12、24 h进行平板菌落计数法分别统计两株菌的数量。
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| 图 1 基于16SrDNA构建系统发育树 Fig. 1 Phylogenetic tree constructed based on the 16SrDNA |
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| 图 2 基于gyrB-ropD基因构建系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based on the gyrB-ropD gene |
数据的统计学分析使用SPSS 24.0软件进行。数据以均数±标准差(SD)表示, 采用单因素方差分析(ANOVA)中的最小显著差异法(LSD)、邓肯新复极差检验(DMRT)进行分析。P < 0.05认为差异有统计学意义, *表示P < 0.05, 差异显著; **表示P < 0.01, 差异极显著。
2 结果与分析 2.1 拮抗菌的筛选与鉴定从样品中挑取800~1 000个单菌落, 使用平板对峙法初筛后, 得到拮抗VpAHPND的候选菌株。使用打孔法对候选菌株进行复筛, 根据抑菌圈大小, 选出抗副溶血弧菌能力最强的一株菌, 该菌株16SrRNA基因扩增片段大小为1 399 bp, 将其16SrDNA序列与NCBI GenBank数据库内序列进行BLAST比对, 结果表明, 其与假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)相似度最高, 相似度为100%。基于gyrB-rop D串联基因同源性系统发育树表明, 该菌株与假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌同源性接近。综上, 初步认为该菌属于假交替单胞菌属的成员。将其16SrDNA序列上传至GenBank, 获得序列号OQ 863053.1, 并将其命名为Pseudoalteromonas sp. strain 1125(以下简称Ps1125)。
2.2 菌株抑制副溶血弧菌效果使用打孔法对比不同浓度Ps1125对副溶血弧菌VPE1的抑制能力, 并以氟苯尼考作为参照, 结果如表 2所示, 1×109 CFU/mL Ps1125产生的抑菌圈直径与0.1 mg/mL氟苯尼考的抑菌圈大小基本接近, 认为Ps1125具有较好的抑制弧菌能力。
| Ps1125浓度/(CFU·mL–1) | 109 | 108 | 107 | — |
| 抑菌圈直径/mm | 13.84 ± 0.66 | 9.57 ± 0.5 | 3.78 ± 0.14 | 16.19 ± 0.87 |
| 注: —表示0.1 mg/mL的氟苯尼考 | ||||
Ps1125对凡纳滨对虾PL12仔虾的存活率影响实验结果如图 3所示, 与对照组相比, 实验组存活率均无显著性差异, 说明Ps1125对PL12仔虾不产生危害, 具有生物安全性。
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| 图 3 安全性实验存活率 Fig. 3 Survival rates obtained during the safety tests 注: 相同小写字母表示不同处理之间无显著性差异(P > 0.05) |
通过向水体添加Ps1125, 养殖期间水体内总弧菌数量、绿弧菌数量, 以及对虾肝胰腺总弧菌数量、绿弧菌数量结果如图 4所示, 2个实验组在第7 d时水体和肝胰腺内总弧菌数量、绿弧菌数量均显著低于对照组(P < 0.05), 说明加菌初期能有效减少水体和对虾肝胰腺内弧菌数量。
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| 图 4 添加Ps1125对养殖水体和虾肝胰腺弧菌数量的影响 Fig. 4 Effect of adding Ps1125 on the number of Vibrio spp. in water and the hepatopancreas 注: 不同小写字母表示同一时间点不同处理之间存在显著性差异(P < 0.05) |
养殖21 d结束后, 加入半致死浓度的副溶血弧菌VPE1攻毒后, 对虾肝胰腺总弧菌数量、绿弧菌数量结果如图 5所示。在对虾肝胰腺中, 1×106 CFU/mL实验组在攻毒后早期阶段(第48 h)的总弧菌数量、绿弧菌数量与对照组具有显著性差异(P < 0.05), 后期(96 h)无显著性差异。1×105 CFU/mL实验组在攻毒后早期阶段(第48 h)总弧菌数量与对照组存在显著性差异(P < 0.05), 但绿弧菌数量与对照组不具有显著性差异, 与1×106 CFU/mL实验组不具有显著性差异, 可能是1×105 CFU/mL实验组数据组内误差较大所致。
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| 图 5 攻毒实验期间对肝胰腺弧菌数量的影响 Fig. 5 Impact of the challenge experiment on the number of Vibrio spp. in the hepatopancreas 注: 不同小写字母表示同一时间点不同处理之间存在显著性差异(P < 0.05) |
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| 图 6 攻毒期间对虾存活率 Fig. 6 Survival rates of the shrimp during the challenge period 注: 不同小写字母表示同一时间点不同处理之间存在显著性差异(P < 0.05) |
攻毒后对虾存活率如图 4和图 5所示, 0~72 h, 2个实验组存活率与对照组相比具有显著性差异(P < 0.05); 72 ~96 h, 1×105 CFU/mL实验组存活率与对照组具有显著性差异(P < 0.05), 1×106 CFU/mL实验组存活率与对照组相比无显著性差异。
2.5 菌株抑菌物质定位使用打孔法探究Ps1125培养液不同成分(发酵液、活菌体、无细胞上清液、胞内产物)能否拮抗VPE1并产生抑菌圈, 结果如图 7所示, 发酵液和活菌体周围观察到抑菌圈, 无细胞上清液和胞内产物周围未观察到抑菌圈。
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| 图 7 菌株抑菌物质定位 Fig. 7 Localization of antibacterial compounds |
Ps1125与VPE1按照1∶1初始添加比例进行共培养后, 两株菌的生长结果如图 8所示。12 h内, 弧菌数量均低于Ps1125数量。在第6 h两株菌的浓度具有极显著差异, 9 h具有差异显著。12 h由于组内数据差异大, 不具有显著性。在第3 h涂板计数法无法检测到弧菌, 可能是弧菌在不利条件下的“有活力但不可培养状态”[24]。
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| 图 8 Ps1125与VPE1共培养 Fig. 8 Co-cultures of Ps1125 and VPE1 注: *表示实验组和对照组在同一时间点差异显著(P < 0.05); **表示差异极显著(P < 0.01) |
Ps1125的无细胞上清液、Ps1125死亡菌体与VPE1菌细胞共培养后弧菌数量结果如图 9所示, 结果表明, 在24 h内, 同一时间点各组之间副溶血弧菌VPE1数量无显著性差异, 说明Ps1125的无细胞上清液、Ps1125死亡菌体均对副溶血弧菌VPE1的菌细胞生长没有抑制作用。
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| 图 9 Ps1125的上清液、死亡菌体与VPE1共培养 Fig. 9 Co-cultures of Ps1125 supernatant, dead cells, and VPE1 注: 相同小写字母表示同一时间点不同处理之间无显著性差异(P > 0.05) |
使用带分隔膜的细胞培养小室对Ps1125和VPE1进行共培养, 结果如图 10所示, 无论膜是否能使得菌细胞交换, 3 h时弧菌均出现一个平板检测数几乎为零的低值, 与上述共培养结果相似。0.4 μm孔径膜将菌细胞分隔在两个独立腔室中, 不允许菌体细胞自由进出交换, 共培养结果显示两株菌数量除3 h之外无显著性差异。8.0 μm孔径膜允许菌体细胞自由进出交换, VPE1与Ps1125在6 h菌数量具有显著性差异, 12 h两株菌数量具有极显著差异。9、24 h由于组内数据差异大, 不具有显著性。本实验的结果表明, Ps1125通过细胞直接接触抑制副溶血弧菌VPE1。
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| 图 10 膜分隔共培养实验 Fig. 10 Co-culture experiments under membrane separation 注: *表示实验组和对照组在同一时间点差异显著(P < 0.05); **表示差异极显著(P < 0.01) |
目前, 对虾养殖中的益生菌主要采用盲筛的方法[25]。以病原菌为指示菌, 检测候选菌株是否具有拮抗作用, 实验中常使用平板对峙法、打孔法、滤纸片法、牛津杯法、交叉划线法[25]。平板对峙法适用于针对含有活菌的发酵液、菌丝和上清液的筛选[26]。16SrDNA序列由于在原核生物中广泛存在且具有高度的保守性, 已发展成为微生物鉴定的金标准[27]。郝云婕等[28]对比基于16SrDNA序列和gyrB基因构建的20株假单胞菌的系统发育树后, 认为gyrB基因比16SrDNA序列更适合亲缘关系较近的菌种的鉴定和区分。
Gauthier等[29]通过核糖体小亚基DNA测序, 把原Alteromonas属的细菌重新分类并建立假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属, 该属内包含41个种。假交替单胞菌是真正的海洋细菌, 环境适应能力强, 在全球范围内多种海洋生境中存在, 与真核生物关系密切, 促进宿主动物生存或者从藻类中获取营养。其环境适应性与该属细菌能产生多种活性代谢物的能力密切相关, 能产生多种胞外物质, 如琼脂酶、胞外多糖、毒素、生物活性化合物(生物碱、多肽、聚酮和萜类), 该属内39%的种是抗菌代谢物的生产者, 产生69种抗菌化合物, 起抗菌作用的物质主要为肽类, 生物碱, 聚酮类化合物[30-31]。大约一半的假交替单胞菌属细菌能产生色素, 有研究认为色素与防污活性有关, 色素的沉着是抗菌代谢物化学结构中共轭双键存在的结果, 但呈现颜色并非产抗菌物质的充分条件[32-34]。
假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌无处不在, 其特点是产生有颜色的次生代谢物吩嗪(phenazine), 其拮抗作用通常归因于一个共同的特征: 氧化还原活性[34], 如Pseudomonas aureofaciens产生的代谢物通过产生活性氧来杀灭真菌[35]。除此之外, Pseudomonas sp. Ⅰ-2菌株能产生一种小分子化合物可以杀灭多种弧菌[36]。Pseudomonas fluorescens能去除对虾养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐, 起到净化水质的作用[37]。
3.2 抑制弧菌效果假交替单胞菌对弧菌属内多个种的细菌具有抑制作用, 包括已确定的对虾病原弧菌[22, 38-39]。Pseudoalteromonas sp. DL3菌株具有群体感应淬灭活性, 其50 μL菌液抑菌效果强于10 μg氨苄青霉素、30 μg卡那霉素及30 μg四环素药敏纸片[40]。洪梅等[41]使用牛津杯法测定一株嗜酸乳杆菌(1×107 CFU/mL, 200 μL)对副溶血弧菌的抑菌圈大小为20.94 mm。
使用琼脂扩散法, 不仅可以检测样品的杀菌活性强度, 而且可以呈现活性成分与指示菌的不同作用方式[42]。本研究测定了Ps1125对副溶血弧菌的抑菌圈大小, 并与氟苯尼考抑菌效果进行对比, 认为该菌具有较强的抑制副溶血弧菌能力, 具有替代抗生素的潜力。
3.3 Ps1125在凡纳滨对虾养殖的应用目前, 对益生菌使用的研究主要集中在提高凡纳滨对虾养殖产量上, 使用方式包括口服、注射和通过养殖水体添加[43]。假交替单胞菌作为饲料添加剂在凡纳滨对虾养殖中具有良好的抗弧菌效果, Pseudoalteromonas sp. CDM8和Pseudoalteromonas sp. CDA22作饲料添加剂使用能显著降低凡纳滨对虾后肠内弧菌数量、虾体内pirAvp基因的拷贝数和VpAHPND攻毒后对虾的累积死亡率[44]。杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida 1UB)和益生元联合使用能提高凡纳滨对虾的生长性能、免疫应答以及对WSSV和Vibrio harveyi联合感染起保护作用[45]。Pseudoalteromonas. piscicida 2515能够降低无生物养殖水体的弧菌数量, 减少凡纳滨对虾肠道内的弧菌数量以及提高对虾的存活率[46]。
弧菌感染过程中, 有必要关注水体内和养殖生物体内病原菌数。斑节对虾幼苗持续暴露于含有大量哈维氏弧菌的水环境中很容易引起原发性疾病[47]。在斑节对虾死亡之前, 受感染池塘的养殖水体内发光弧菌数量增加并逐渐占主导地位, 同时, 对虾暴露于这些变化后菌群的持续时间在感染的发展中也起着重要作用[47]。多株芽孢杆菌通过水体添加的方式作用后24 h观察到对于弧菌属细菌的清除率提升[48]。在本实验中, 养殖7 d时观察到菌株对水体和对虾肝胰腺内弧菌数的清除作用, 攻毒后48 h观察到实验组(105 CFU/mL、106 CFU/mL)对虾肝胰腺内总弧菌数量与对照组相比显著降低。说明Ps1125通过水体添加有助于养殖初期降低弧菌数量, 攻毒后48 h具有降低肝胰腺内总弧菌数量的效果。攻毒后106 CFU/mL实验组存活率降低, 可能是由于养殖后期副溶血弧菌数量升高, 对虾体产生了负面影响所致。
在养殖水体中添加益生菌有利于提高养殖生物抵抗病原菌的能力, 例如, 将芽孢杆菌添加入水中或通过卤虫间接递送途径均显著提高了虾苗的存活率[49]。Silva等人[50]在水体中添加芽孢杆菌, 观察到蚤状幼体和糠虾幼体的存活率显著提高, 与对照组相比, 实验组的弧菌数量减少, 该结果与水质条件改善无关。每天在水体中添加短小芽孢杆菌, 处理12 d后, 显著提高了牡蛎幼虫受到溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)感染后的存活率, 降低了可培养弧菌的菌落数量[51], 该结果与本实验结果相似, 添加益生菌处理后, 显著降低了可培养弧菌数量, 提高了105 CFU/mL实验组对虾存活率。Verschuere等[52]发现, 在溶蛋白弧菌(V. proteolyticus)攻毒前, 预暴露于益生菌的卤虫存活率更高, 这种效果并非由细胞外产物引起的, 而是需要活的细菌细胞, 推测是由于“先入者为主”的生态位优势[53], 益生菌数量的增加抑制了致病菌的生长和存活, 从而降低了疾病的易感性[43]。
3.4 抑菌机制假交替单胞菌主动猎杀细菌可分为群体感应、分泌杀菌物质、外源接触性捕食、基因组重塑4种[54]。假交替单胞菌能通过群体感应调控菌群间竞争, 对群体感应信号分子进行淬灭[55]。Pseudoalteromonas sp.菌株DL3对多种群体感应信号分子具有较强的淬灭活性, 其拮抗作用强于氨苄青霉素[40]。Pseudoalteromonas sp.菌株KS8通过群体感应降低铜绿假单胞菌生物膜形成量[55]。假交替单胞菌属分泌多种多样的抗菌活性物质, 如Pseudoalteromonas sp. CF6-2菌株通过Ⅱ型分泌系统调控, 产生金属蛋白酶降解革兰氏阳性菌细胞壁的肽聚糖[54]。Pseudoalteromonas flavipulchra JG1产生抑菌蛋白PfaP和5种抗革兰氏阴性菌和阳性菌的小分子化合物[56]。通过外源性方式捕食, 猎物细菌死亡后释放的营养物质被捕食者用于自身生长。三株Pseudoalteromonas piscicida细菌均通过将表面产生的囊泡转移给副溶血弧菌, 在弧菌细胞壁上产生孔洞裂解猎物, 还能产生具有抗菌作用的丝氨酸蛋白酶[57]。一株假交替单胞菌与溶藻弧菌共培养后促进溶藻弧菌适应性基因岛VPII的切除, 降低溶藻弧菌生物膜形成和抗噬菌体能力, 增强运动能力, 使溶藻弧菌基因组重塑而扩展到其他生态位[11]。
与之亲缘关系相近的假单胞菌属(Pseudomonas)细菌通过接触依赖性杀伤机制抑菌, 如恶臭假单胞菌Pseudomonas putida IsoF菌株能够在IVB型分泌系统(T4BSS)的帮助下杀死多种土壤和植物相关革兰氏阴性菌, 该系统以接触依赖的方式将毒性效应物传递给细菌竞争对手, 不仅能杀伤细菌, 而且能入侵现有生物膜[58]。
本研究通过抑菌物质定位、死亡菌体与弧菌共培养实验证明, Ps1125对副溶血弧菌抑制作用需要活菌体细胞起作用, 无细胞上清液、菌体蛋白、胞内产物均无抑菌效果。荧光假单胞菌(Pseudomonas. fluorescens PF1)的4种不同细胞成分(即菌体细胞、无细胞上清液、胞内产物、热灭活的菌体细胞产物)对鱼类病原嗜水气单胞菌(Aeromonas. hydrophila)均具有抑制作用[59]。本研究中, Ps1125与VpAHPND按照1∶1的比例共培养时, 24 h内观察到两株菌数量具有显著性差异。与之相似的是一株Pseudoalteromonas aliena菌株, 其培养上清液中不含任何抑制哈维氏弧菌的分子, 在菌体共培养条件下能抑制哈维氏弧菌数量, 且所有比例(1∶1、1∶3、1∶5和1∶7)下均对哈维氏弧菌产生了抑制作用[60]。当Pseudomonas fluorescens AH2的初始数量是鳗弧菌的100~1 000倍时, 能显著抑制鳗弧菌的生长[61]。一株奇异变形杆菌与大肠杆菌通过膜分隔的共培养实验证明杀死大肠杆菌需要菌体之间的直接接触, 实验表明杀菌机制不依赖于T6SS[23]。本研究通过0.4 μm、8.0 μm两种不同孔径膜分隔共培养的实验证明, Ps1125与弧菌直接接触, 可对弧菌生长产生更加显著的抑制作用, 而0.4 μm孔径的膜限制了假交替单胞菌与弧菌的接触, 但是不影响营养物质交流, 则抑菌效果不显著。细胞接触后作用机制有待进一步探究。
4 结论本研究筛选出一株海洋来源的假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp. strain 1125, 该菌株具有良好的拮抗VpAHPND能力。通过活细胞的接触对弧菌起抑制作用, 加入养殖水体后具有降低水体和对虾肝胰腺内的弧菌数量的效果。有望为凡纳滨对虾的急性肝胰腺坏死病防控提供新的思路。
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