2025, Vol. 49
文章信息
- 阙嘉华, 郭肖扬, 徐世宏, 贾超峰, 孟乾, 林子豪, 李纪元, 许钦航, 王彦丰, 李军. 2025.
- QUE Jiahua, GUO Xiaoyang, XU Shihong, JIA Chaofeng, MENG Qian, LIN Zihao, LI Jiyuan, XU Qinhang, WANG Yanfeng, LI Jun. 2025.
- NaHCO3碱度驯化下黑鲷应激响应与耐受机制
- Stress responses and tolerance mechanisms of Acanthopagrus schlegelii during acclimation to NaHCO3-induced alkalinity
- 海洋科学, 49(4): 39-55
- Marine Sciences, 49(4): 39-55.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20241225003
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文章历史
- 收稿日期：2024-12-25
- 修回日期：2025-03-28
2. 青岛海洋科技中心 海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 中国科学院大学, 北京 100049;
4. 江苏省海洋水产研究所, 江苏 南通 226007;
5. 中国科学院 海洋大科学研究中心, 山东 青岛 266071;
6. 青岛农业大学 生命科学学院, 山东 青岛 266109
2. Laboratory of Marine Biology and Biotechnology, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. Jiangsu Marine Fisheries Research Institute, Nantong 226007, China;
5. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China;
6. College of Life Science, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China
盐碱水在世界水资源中占有相当大的比例, 但由于其碳酸盐碱度高、pH值高、缓冲能力差、离子组成复杂等特殊水质条件, 大部分仍未开发利用。盐碱水常见于内陆咸水湖、沿海澙湖、海湾、倒置或封闭的河口以及潮滩和水池中[1], 水中过高的碱度将严重影响湖泊和溪流中生物的发育、生存和繁殖, 导致生物量下降和物种组成发生重大变化[2]。随着全球气候变暖, 海平面上升会导致沿海地区盐碱化加剧。除了这种渐进的气候引起的盐度变化外, 极端气候事件(海啸、飓风等)也会导致严重和急性盐度胁迫压力, 预计这些极端天气事件的频率和严重程度会增加[3]。随着水体环境盐碱化和碱化进程的继续加深, 淡水养殖的可用空间正在逐渐缩小[4]。因此, 研究其耐碱性机理对培育耐碱性鱼类品系和合理利用广泛的盐碱水资源具有重要意义。
鱼能耐受高浓度的盐碱环境, 解决鱼体氨氮废物排泄的问题是关键。在耐碱性鱼类中主要以3种策略来解决在盐碱环境中的氮废物排泄难题[5]。其一是重建NH3分压梯度, 如土耳其卡拉白鱼(Chalcalburnus chalcoides aralensis)就是典型的通过血液中的高氨水平来进行排氨[6]。其二是通过转变氮代谢产物, 比如转换为尿素[7]或者谷氨酰胺[8]。其三是鱼体对高浓度氨的耐受能力, 如卡拉白鱼肌肉和血浆的氨浓度远高于一般的硬骨鱼[9]。通过高通量测序技术, 研究人员已经对一些鱼类物种进行了关于耐碱胁迫的分子机制研究[10]。碱度胁迫后通过转录组测序, 对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的鳃、肾和肝组织的RNA-seq进行表征, 发现与脂质代谢、解毒和免疫相关的基因可能在尼罗罗非鱼对碱度胁迫的反应和适应性中发挥重要作用[11]。
在硬骨鱼中鳃是最重要的渗透调节器官[8], 通过对其鳃的形态、细胞和生理修饰来维持离子组成和渗透压稳定性。黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)是中国、日本、韩国和东南亚其他一些国家养殖的重要海鱼, 生长速度快[12]、抗病性强[13]。在低盐胁迫中表现出良好的耐受性[14], 而目前的研究多数探究的是盐度胁迫和低温胁迫[15], 而碱度处理对黑鲷的影响尚未有见相关报道。本研究对黑鲷长期碱度驯化后鳃形态和转录组学特征以及血清生理生化变化情况进行了研究。旨在揭示碳酸盐碱度长期驯化后黑鲷的鳃组织形态学变化和分子生理响应机制。这将有助于了解黑鲷对盐碱环境的适应性调节机制, 为耐盐碱鱼类优良品种选育和培养提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料黑鲷采集自江苏省海洋水产研究所南通吕四基地。每天喂食两次(6: 00和18: 00), 至饱食状态, 换水率为50%, 水环境基本参数稳定(溶解氧8.15±0.78 mg/L, pH8.21±0.21, 温度22.51±1.25 ℃, 盐度26.76±0.32)。饲料为从福州通威威廉饲料有限责任公司采买的浮性配合饲料。实验开始后, 随机选取150日龄, 体质量18.96±3.12 g的实验鱼270尾。随机分为3组, 分别为对照组FW组(0 mmol/L), 实验组AW16组(16 mmol/L)和AW32组(32 mmol/L), 每组设置3个平行对照, 实验系统由9个有效水体体积为250 L的养殖桶组成, 每个养殖桶随机放置30尾鱼。使用自然过滤海水和碳酸氢钠粉末(分析纯)配置对应碱度的水体, 以每天4 mmol/L的速度上升至设定碱度。实验过程中每天换水2/5, 维持碱度设定值。驯化方法如表 1所示。
| 组别 | 养殖桶 | 时间/d | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | ||
| FW0 | 1 | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 2 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| 3 | - | - | - | - | - | - | - | - | |
| AW16 | 4 | - | - | - | - | + | + | + | + |
| 5 | - | - | - | - | + | + | + | + | |
| 6 | - | - | - | - | + | + | + | + | |
| AW32 | 7 | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 8 | + | + | + | + | + | + | + | + | |
| 9 | + | + | + | + | + | + | + | + | |
| 注: “-”. 不添加NaHCO3粉末, “+”.对应养殖桶添加NaHCO3粉末使得养殖桶碳酸氢钠浓度提升4 mmol/L | |||||||||
每天在换水和维持碱度后用手持式多参数水质分析仪(YSI, 美国)测量养殖池中的温度、pH、溶解氧和盐度, 同时用萘二胺盐酸盐分光光度法测定亚硝酸氮(NO2–-N), 碱度使用工业冷却循环水碳酸盐碱度国家标准方法测定[16]。驯化实验结束后的第二天开启正式实验, 在正式实验的开始和结束各取样1次, 正式实验周期共50 d。每次取样每个桶随机取3尾鱼, 使用100 mg/LMS-222(Sigma, MO, USA)水溶液中麻醉及取适量鳃组织用液氮长期保存活性, 用于提取RNA另一部分置于含有4%多聚甲醛中24 h, 之后在70%乙醇中长期保存, 后期用于组织学观察。尾静脉抽取5 mL血液, 经4 ℃处理, 5 000 g离心15 min后取血清于液氮保存, 用于测定血清生理指标测定。血氨和尿素氮(BUN)水平的测定根据南京建成科技有限公司试剂盒说明进行。乳酸水平的测定根据谱析(上海)生物科技有限公司试剂盒说明进行。血清HCO3–离子浓度以及pH使用深圳市希莱恒医用电子有限公司生产的电解质分析仪(IMS-972 Popular)检测。
1.2 方法 1.2.1 组织学分析组织学分析参考王雨福[17]的实验步骤进行脱水、包埋和HE染色。使用切片机(RM 2235, Leica, Wetzlar, Germany)切至5 µm, 使用显微镜(尼康Eclipse E600)进行拍摄成像。测定了FW组、AW16组、AW32组鱼鳃的5个形态学参数, 包括细丝厚度、片层厚度、突出片层基底长度、突出片层高度和片层间距, 在每组中分别对这些参数进行了30次测量(3张切片×10次随机测量)。
采用SPSS 25.0软件进行独立样本t检验, 检验两组间的均值是否有显著差异(P < 0.05)。
1.2.2 RNA提取和转录组测序使用TRIzol试剂提取动物总RNA, NanoDrop 2000测量浓度和纯度, Agilent Bioanalyzer 2100评估RNA完整性。每个样品1 μg RNA用于文库制备, 使用Hieff NGS Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit构建测序文库, 合并3条鱼的RNA为1个样品, 每个时间点3个重复。在Illumina NovaSeq平台进行测序。
1.2.3 差异基因鉴定使用BMKCloud平台处理原始数据, 去除低质量reads和接头序列, 计算Q20、Q30、GC含量。使用Hisat2将高质量reads映射到黑鲷全基因组, StringTie进行转录本组装和鉴定。基因功能注释基于KO和GO数据库。使用DESeq2分析差异表达, 校正P < 0.05且|log2FoldChange|≥1.5为差异基因。进行PCA、KEGG通路分析和GSEA分析。
1.2.4 实时荧光定量PCR (qPCR)使用MonScript™ RTIII Super Mix with dsnase合成cDNA。引物由Primer-BLAST设计, 序列由北京擎科生物合成。以18s rRNA为内参, 校准qPCR准确性。10 μL qPCR反应体系包含1 μL cDNA、0.25 μL正反向引物、5 μL SYBR Green qPCR Mix和3.6 μL无核酸酶水。扩增程序: 95 ℃ 30 s, 随后95 ℃ 10 s、Tm 30 s、72 ℃ 30 s, 共40个循环。使用StepOne Plus Real-Time PCR系统检测。通过2-ΔΔCT法计算8个DEGs(TBC1D24、CDH27、rhcgb、serpine1、slc4a4、slc9a3r2、slc26a1、GS)及鳃相关基因的相对表达量, 引物序列如表 2所示。
| 引物名称 | 正向引物序列(5’-3’) | 反向引物序列(5’-3’) |
| TBC1D24 | AGCTACCTGACGATCCCCTT | GCCCCCATCACCACCAATAA |
| CDH27 | AGTACGGGGTAGGAAGCGAT | ATGGATGTTTAGGGTGGCCG |
| Rhcgb | GGTTTCAACTTCCTCATCGC | TTTCCATCCGTGTAGTCCAG |
| serpine1 | TTCACACGCATCACCACTGA | GTCCCTCGCTCATTCACCTC |
| slc4a4 | GACGAGGCGGTGCTGGACCGGGGG | GCCGCCGCCGCCGATAGCTCTT |
| slc9a3r2 | CACAAGCACGACCACACAAG | CACAAACTGTCCACGCTTCG |
| slc26a1 | ACATGCCCCAATAGCGAACA | GAGGAAGAGGGAGGGGATGT |
| GS | GACCCCAAGCCACTGAAGAA | CCTGTGAGACGCCTGATGTT |
| β-actin | ACCCAGATCATGTTCGAGACC | ATGAGGTAGTCTGTGAGGTCG |
| Rhcga | AGAGCAGCCATCAACACTTA | AGTGCAGAAACCCACGATAA |
| Rhcgb | GGTTTCAACTTCCTCATCGC | TTTCCATCCGTGTAGTCCAG |
| Rhbg | AGCCTATTTCGGCCTCATGG | TTGAAGCTGGGCCAGAACAT |
| CA-Ⅱ | GTGTGAGCGTTTCAGGAGGA | AGAGCAGCGAGTCCAGTAGA |
| cldn | ATCCTCGCTGGTGTGATGTG | GGGAGCCCATTGTAAGAGGG |
| cytc | TACTCTGGAACAGGGTGGAA | GTCGTCATCCCAAGTAATGC |
| PCNA | ACCAGCAACGTAGACAAAGA | TAGTTGAGGGCGAAGATCAG |
| bax | AAGGCGCTGACCACCAACC | GGCTACTGTCCTCCACCGAGA |
| bcl-2 | ACCATCGTCACCTCCGACTCC | ACTTTGGGCGAGTTCTTTGTCGT |
| caspase-l | GAGACAGCCCGATCCACTCCCAC | AGCAGAGACCCTTTGACCGAGTGT |
| caspase-3 | ATGGACTACCCCAGCCTCGGAAC | GCAGCATCAACATCCGTCCCGTT |
| Apaf1 | AGACTACGAAGCTGCACACGTCCT | ATCCCGTCCTGCCATCACGTACC |
数据分析采用SPSS 25.0, 独立样本t检验, P < 0.05为差异显著。图形绘制使用GraphPad Prism 8.0。
2 结果 2.1 养殖期间水质环境参数水质检测结果如表 3所示, 养殖期间, 盐度、温度、pH、溶解氧、NO2–-N浓度均保持稳定, 无差异。说明养殖环境各组间均保持稳定。对照组碳酸盐碱度为3.85± 0.17 mmol/L说明海水环境种存在天然碳酸盐碱度, 碳酸盐碱度各组之间均有差异, 且基本符合实验设计浓度。
| 指标 | 组别 | ||
| FW | AW16 | AW32 | |
| 盐度 | 26.81±0.34a | 27.03±1.35a | 27.31±0.33a |
| 温度/℃ | 21.06±1.27a | 20.38±0.14a | 20.36±0.50a |
| 溶解/(mg·L–1) | 6.87±0.32a | 6.59±0.46a | 6.46±0.16a |
| pH | 8.28±0.35a | 8.31±0.15a | 8.33±0.05a |
| 亚硝酸盐氮/(mg·L–1) | 0.22±0.11b | 0.23±0.19ab | 0.23±0.01a |
| 碳酸盐碱度/(mmol·L–1) | 3.85±0.17c | 18.29±0.73b | 34.46±0.19a |
| 注: FW为对照组, AW16为16 mmol/L碱度处理组, AW32为32 mmol/L碱度处理组。同行数据上标小写字母, 不同表示同一试验组在不同环境参数差异显著(P < 0.05) | |||
记录了黑鲷鳃组织在驯化50 d的时间里FW、AW16、AW32碱度驯化初始点和末期的鳃丝出现结构变化。AW16、AW32组与FW组相比出现鳃上皮细胞水肿, 形状由扁平片状转变为水肿不规则状, 厚度增加; 泌氯细胞水肿体积增大, 鳃丝出现鳃小片末端膨大, 鳃丝间质水肿的情况(图 1b、1d、1f)。AW16和AW32的0和50 d的鳃组织均出现了鳃小片变短变粗, 鳃小片间距变短的情况, 其中AW16 50 d的鳃小片最粗。AW16-0 d和AW32-0 d都出现板层间细胞空泡化, 而经过50 d驯化后空泡化消失(图 1a~1c)。
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| 图 1 碱度驯化实验中黑鲷的鳃组织学切片 Fig. 1 Histological sections of the blackhead seabream gills during alkalinity acclimation 注: (a) FW 0 d; (b)FW 50 d; (c) AW16 0 d; (d) AW16 50 d; (e) AW32 0 d; (f) AW32 50 d; GL. 鳃小片; MRC. 线粒体丰富细胞; PVC. 扁平上皮细胞; Pic. 柱细胞; CC. 泌氯细胞; RBC. 红细胞; GLE. 鳃小片间质水肿; GLH. 鳃小片末端增生; FT. 鳃丝厚度; LT. 鳃小片厚度; LBL. 基底鳃小片间距; LH. 鳃小片高度; DBL. 鳃小片间距 |
图 2展示了黑鲷鳃丝组织学参数的变化。在正常发育下(FW-50 d和FW-0 d对比), 鳃丝变细变长, 鳃小片厚度降低, 高度增加(图 2a)。在AW16组, 鳃小片变长且直径变粗, 鳃丝厚度降低(图 2b)。在AW32组, 鳃丝变短变粗, 鳃小片高度降低, 鳃间隔变小(图 2c)。50 d后比较各组, AW16-50 d的鳃丝和鳃小片厚度最大显著高于其余两组, FW-50 d次之, AW32-50 d最小; FW-50 d的鳃小片间距最大显著高于其余两组, AW16-50 d次之, AW32-50 d最小(图 2d)。总体上, 碱度驯化使鳃小片变短变粗, 高浓度碱度可能抑制鳃丝发育。
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| 图 2 碱度驯化实验中黑鲷的鳃组织学计量分析 Fig. 2 Histological morphometric analysis of blackhead seabream gills during alkalinity acclimation 注: (a)FW 0 d和FW 50 d; (b)AW16 0 d和AW16 50 d; (c)AW32 0 d和AW32 50 d; (d)FW 50 d和AW16 50 d和AW32 50 d; FT. 鳃丝厚度; LT. 鳃小片厚度; LBL. 基底鳃小片间距; LH. 鳃小片高度; DBL. 鳃小片间距; *. 两组间存在显著差异(P < 0.05); ns. 两组之间无显著差异 |
根据参考基因组上的基因定位信息, 利用subreads软件中的featurecots工具对每个基因(包括新基因)的reads进行计数。然后计算6个样本之间的pearson相关系数, 以确保后续的差异基因分析结果更加可靠, 任意样本的R2值均 > 0.67(图 3a)。PCA也显示FW 0 d和AW16 50 d样品之间有明显差异(图 3b)。鳃中共获得1 638个差异基因, 包括823个上调基因和815个下调基因(图 3c、3d)。
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| 图 3 对照组FW 0d与实验组AW32 50d转录组差异基因分析 Fig. 3 Transcriptomic analysis identifying the differentially expressed genes between the control (FW 0 d) and the experimental (AW32 50 d) groups 注: (a)FW 0 d和AW32 50 d表达量相关性热图; (b)PCA图; (c)FW 0 d和AW32 50 d差异基因上调下调图; (d)差异基因表达火山图 |
对差异基因进行京都基因与基因组百科全书分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)系统注释分析, 并将注释结果按照KEGG通路类型进行分类, 并标注对应的差异基因占总的差异基因的比率(图 4)。注释分类结果共分为细胞进程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢、有机体系统6大类。其中细胞进程、环境信息处理两个分类差异基因最多。
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| 图 4 碱度驯化下黑鲷鳃差异基因KEGG分类注释统计直方图 Fig. 4 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analysis) classification annotation of the differentially expressed genes in the gills of Acanthopagrus schlegelii under alkalinity acclimation |
筛选q值前20的20条通路(图 5), 其中细胞周期(ko04110)、DNA复制(ko03030)、p53信号通路(ko04115)、谷胱甘肽代谢(ko00480)、嘧啶代谢(ko00240)、细胞衰老(ko04218)、内质网中蛋白质加工(ko04141)通路富集基因较多。
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| 图 5 碱度驯化下黑鲷差异基因富集通路气泡图 Fig. 5 DEGS enriched pathway bubble plot of A. schlegelii under alkalinity acclimation 注: 按照q值排列, q值最小的前20条KEGG通路 |
碱度驯化对鳃的形态结构影响显著, 其中MAPK信号通路、TGF-β信号通路、细胞黏附分子这3条通路整体上调, 错配修复、细胞周期、DNA复制、内质网中的蛋白质加工、碳代谢、嘧啶代谢、氧化磷酸化这七条通路整体下调(图 6)。
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| 图 6 GESA分析KEGG通路中与鳃重塑和鳃功能相关的通路 Fig. 6 GESA analysis of the KEGG pathways related to gill remodeling and function 注: (a)显著整体上调的3条kegg通路(MAPK信号通路、TGF-β信号通路、细胞黏附分子信号通路); (b)显著整体下调的7条通路(氧化磷酸化信号通路、嘧啶代谢信号通路、DNA复制信号通路、碳代谢信号通路、内质网中的蛋白质加工信号通路、细胞周期信号通路、错配修复信号通路)。 |
在碱度驯化过程中, 长期的碱度影响会导致鳃组织结构重塑, 碱度环境和鳃的组织形态会影响鳃的主要功能。所以基于以上生物信息学分析结果, 与文献检索结合对差异基因的手工检索, 分类了鳃组织与鳃重塑和鳃功能相关基因的响应合集。鳃重塑又与细胞连接[18], 细胞增殖[19], 细胞凋亡[20]等过程相关, 同时鳃是重要的耗能器官, 又是离子调节的重要器官。细胞连接主要有cldn、ESAM、OCLN等相关基因显著变化(图 7a)。参与细胞增殖, 细胞凋亡过程和信息转导的主要通路也被激活(图 7b)还有一些在碱性胁迫条件下出现的典型的信号通路也被激活, 如MAPK信号通路、TGF-β信号通路和p53信号通路。鳃是重要的耗能器官, 在主要的能量代谢相关的通路(图 7c), 糖酵解通路、TCA循环、氧化磷酸化通路均激活以及低氧诱导通路也被激活。由于维持离子和细胞稳态对于应对碱度胁迫至关重要, 因此我们鉴定了编码离子转运蛋白、离子调节和渗透压调节相关的差异基因(图 7d)。
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| 图 7 碱度驯化下鳃重塑基因响应与鳃功能相关基因响应合集 Fig. 7 Genetic responses to gill remodeling under alkalinity acclimation and the response of gill function-related genes 注: (a)细胞连接相关差异基因合集; (b)细胞增殖, 细胞凋亡过程和信息转导的主要通路差异基因合集; (c)与能量代谢和调节相关的差异基因合集; (d)离子调节、渗透压调节响应相关差异基因合集 |
在转录组结果中随机选取的8个基因(TBC1D24、CDH27、rhcgb、serpine1、slc4a4、slc9a3r2、slc26a1、GS)其mRNA水平和测序结果基本一致(图 8), 说明RNA测序结果可靠。
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| 图 8 RT-qPCR验证转录组数据 Fig. 8 RT-qPCR validation of the transcriptome data |
细胞凋亡相关基因bax: 16 mmol/L组50 d时表达显著高于其他组。bcl2: 对照组0 d显著高于其他组。Cytc和apaf1: 16 mmol/L组0 d与对照组0 d表达量无差异, 且显著高于其他组。caspase3: 16 mmol/L组0 d显著高于其他组。caspase1: 对照组0 d显著高于其他组。细胞增殖相关基因: PCNA: 对照组0 d和16 mmol/L组0 d表达量无差异, 但显著高于其他组。32 mmol/L组增殖不显著, 长期处理后各组恢复同等增殖水平。细胞黏连蛋白基因: cldn: 碱度处理组显著高于对照组, 表明碱度环境下鳃中细胞黏连蛋白表达增加(图 9)。总体表明, 16 mmol/L碱度刺激在早期可诱导鳃细胞增殖, 但32 mmol/L处理下增殖不显著, 长期处理后各组增殖水平趋于一致。
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| 图 9 长期碱度驯化下黑鲷鳃中bax, bcl2, cytc, apaf1, caspase3, caspase1, cldn和PCNA基因的mRNA相对表达量 Fig. 9 Relative expression levels of bax, bcl2, cytc, apaf1, caspase3, caspase1, cldn, and PCNA in the gills of A. schlegelii under different periods of long-term alkalinity acclimation 注: (a)bax基因相对表达量; (b)bcl2基因相对表达量; (c)cytc基因相对表达量; (d)apaf1基因相对表达量; (e)caspase3基因相对表达量; (f)caspase1基因相对表达量; (g)cldn基因相对表达量; (h)PCNA基因相对表达量 |
在碱度处理下, 与氨转运相关的基因Rhcgb、Rhcga和Rhbg在0 d时表达量显著高于对照组(图 10a~10c), 表明早期氨转运基因上调以维持体内氨平衡。长期碱度驯化后, 16 mmol/L处理组的Rhcgb仍保持较高水平, 显著高于其他两组, 而32 mmol/L碱度处理组与对照组无显著差异。Slc4a4(NBCe1)基因在0 d时16和32 mmol/L碱度处理组显著升高, 16 mmol/L碱度组长期维持较高水平, 但50 d后各组间无显著差异(图 10d)。CA-Ⅱ基因在0 d时16和32 mmol/L碱度处理组显著升高, 16 mmol/L碱度组高于32 mmol/L碱度组, 但长期驯化后各组间无显著差异, 且16和32 mmol/L处理组显著低于0 d(图 10e)。
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| 图 10 长期碱度驯化下黑鲷鳃中Rhcgb, Rhcga, slc4a4, Rhbg和CA-Ⅱ基因的mRNA相对表达量 Fig. 10 Relative mRNA expression levels of Rhcgb, Rhcga, slc4a4, Rhbg, and CA-Ⅱ in the gills of A. schlegelii under long-term alkalinity acclimation 注: (a)Rhcgb基因相对表达量; (b)Rhcga基因相对表达量; (c)slc4a4基因相对表达量; (d)Rhbg基因相对表达量; (e)CA-Ⅱ基因相对表达量 |
长期碱度50 d后中NH3在16 mmol/L处理组中显著低于对照和32 mmol/L处理组。pH、乳酸、尿素氮、HCO3-浓度在对照组和16 mmol/L处理组和32 mmol/L处理组之间无显著差异(表 5)。
| 指标 | 生理参数 | ||
| 组别 | |||
| FW-50 d | AW16-50 d | AW32-50 d | |
| BUN/(mmol·L–1) | 1.21±0.30a | 1.17±0.27a | 1.06±0.34a |
| HCO3–/(mmol·L–1) | 18.51±1.42a | 18.81±1.71a | 18.29±1.31a |
| NH3/(μmol·L–1) | 9.24±0.26a | 8.43±0.36b | 9.47±0.10a |
| 乳酸/(mmol·L–1) | 4.15±0.36a | 4.16±0.27a | 4.50±0.12a |
| pH | 7.52±0.08a | 7.61±0.17a | 7.64±0.09a |
在本研究中, 长期的碱度驯化下, 黑鲷鳃表现出显著的鳃重塑现象, 鳃丝厚度增加, 鳃小片变短(突出片层高度变小)直径变粗, 鳃小片间距变小, 上皮细胞肿胀, 鳃小片间质水肿和末端增生的情况。在面对环境变化时, 鳃作为鱼类直接和环境接触的器官, 会在几个小时到几天的时间里重塑鳃组织的形态结构, 以适应环境的变化[21]。金鱼(Carassius auratus)在响应氨氮胁迫时, 鳃小片出现了鳃丝、鳃小片变厚和鳃间层细胞团变少的情况[22]。在面对缺氧的环境压力时, 团头鲂(Megalobrama amblycephala)其突出的片层高度和平均片状面积均大于常氧对照组[23]。鱼体为实现最佳的气体交换, 鳃的表面积增大, 上皮厚度变薄, 同时渗透调节压力也会变大[24]。反之鳃的表面积减少, 上皮细胞厚度增加, 与水体接触的表面积会降低气体交换效率, 同时也减少了渗透调节的压力[25]。这说明在长期碱度环境下, 本实验中黑鲷在组织学层面上通过降低与外界接触的表面积的方式来适应外界碱度环境的变化。
转录组ESGA分析结果中显示, 碱度胁迫显著诱导了许多紧密连接通路的基因上调, 如使细胞黏附分子通路整体上调, 其中cldn蛋白基因、选择性黏附分子(ESAM)和紧密连接蛋白(OCLN)基因显著上调。在黑鳍刺河豚(Takifugu obscurus)[26]中cldn蛋白分布的鳃上皮细胞周围。cldn蛋白与闭合蛋白、三连环蛋白以及各种胞质支架蛋白组成紧密连接复合物调控细胞旁途径通透性[27]。在鱼类中, 鳃cldn蛋白和cldn基因mRNA丰度已被证明在动物暴露于改变的环境离子水平后会响应盐和水平衡的变化而变化, 这些变化被认为反映了鳃上皮渗透性特性的调整[28]。cldn基因上调, 这说明鳃组织在高碱度驯化期间, 细胞旁通透性减弱[29], 可以降低碱度环境的影响。(ESAM)和紧密连接蛋白[30](OCLN)上调, 它们与紧密连接高度相关[31]。OCLN是紧密连接蛋白家族的关键成员, 主要分布于上皮细胞和内皮细胞间的紧密连接处。它与相邻细胞的occludin蛋白相互作用, 形成拉链样的结构, 封闭细胞间隙, 对维持细胞极性和调节细胞间物质的选择性通透起关键作用[32]。通过上调紧密连接途径降低细胞旁通路的通透性, 这可能是黑鲷鳃适应碱度环境的机制之一。
鳃重塑的过程伴随着细胞凋亡[33]和细胞增殖[34]。切片结果显示在16 mmol/L碱度处理组在碱度驯化初期在鳃小片基部出现空泡化并在长期碱度驯化后空泡化消失, 32 mmol/L碱度处理组和对照组并无空泡化情况。说明16 mmol/L碱度处理组早期出现细胞凋亡, 而对照和32 mmol/L碱度处理组凋亡情况并不显著。p53信号转导通路可以调节细胞周期、细胞衰老、细胞凋亡、DNA修复和细胞自噬等相关通路[35]。p53信号通路可诱导多个凋亡靶基因(如bcl-2、bax和cytc)来触发caspase信号通路[36]。bax和bcl-2分别是促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白[37], bax蛋白可与bcl2形成异二聚体, bax/bcl-2两种蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素[38]。bax蛋白可在线粒体外膜中形成孔洞, 释放cytc[39]。cytc是细胞凋亡起始不可或缺的调节因子, 可与apaf1结合形成凋亡复合物, 通过激活caspase9裂解caspase3最终导致细胞凋亡[40]。本研究中, 荧光定量结果表明, 在0 d时16和32 mmol/L碱度组的bcl2显著低于对照组, 而cytc和apaf1基因的对照组和16 mmol/L碱度组显著高于32 mmol/L碱度组。在0 d时16 mmol/L碱度组caspase3显著上调, 这与切片结果相对应。而32 mmol/L碱度组因为cytc含量和apaf1含量显著降低, 即使在bcl2显著降低的情况下, 其凋亡情况并不显著, 这也解释了切片的结果中依旧有少量凋亡现象。
cytc是线粒体电子传递链的重要组成部分, 在电子传递链的末端, cytc将电子传递给复合体Ⅳ, 该复合体利用这些电子将氧气还原成水产生大量能量[41], 这一过程也被称为氧化磷酸化。在高浓度CO2胁迫实验中, 海水碳酸盐成分的变化引起的酸碱失衡会引起日本青鳉(Oryzias latipes)cytc基因的下调[42]。本实验中也发现cytc基因下调, 同时氧化磷酸化途径整体下调。说明黑鲷在32 mmol/L碱度处理时有氧代谢受到抑制, 而转录组结果中又发现缺氧诱导因子Hif-1α基因上调[43], 而Hif-1α基因的上调又导致表皮生长因子VEGF、和葡萄糖转运蛋白基因(slc2a2)上调[44]。糖酵解通路加强, LDH上调[45]。说明黑鲷在32 mmol/L时为了维持能量供应, 提高了无氧代谢途径以弥补能量供应缺口。Hif-1α的α亚基可以介导缺氧导致的细胞周期停滞[46]。GSEA分析显示TGF-β信号通路上调, 而TGF-β信号通路的上调又会导致细胞周期通路下调导致细胞周期停滞[47], 这表现在细胞增殖相关的通路均下调(错配修复、细胞周期、DNA复制、内质网中的蛋白质加工、嘧啶代谢), 细胞增殖活动减弱。PCNA是细胞增殖生物学标志物[48], 其下调代表鳃组织在碱度长期驯化过程中, 鳃细胞增殖活动减弱。PCNA的荧光定量结果表明, 对照组与16 mmol/L碱度组在0和50 d表现趋势一致, 而32 mmol/L碱度组在0 d时其PCNA显著低于对照组和32 mmol/L碱度处理组。这说明在初始状态下, 32 mmol/L碱度对黑鲷的鳃组织恢复具有抑制作用, 而16 mmol/L碱度对黑鲷鳃组织无影响。说明32 mmol/L处理组响应低氧代谢通路以高耗能为代价维持鳃细胞的功能。
3.2 长期碱度驯化下黑鲷鳃离子调节和氨代谢的功能适应鳃是鱼体中渗透压调节和离子调节中非常重要的器官[49], 鳃组织结构的变化会对鳃的功能产生影响, 离子平衡和酸碱平衡的调节是鱼类应对碱性胁迫的必要条件, 因为细胞膜内外对亲水性分子的不同的渗透性, 所以离子的跨膜转运由一系列的通道蛋白和离子载体介导的[50]。AQP3a是水甘油通道蛋白, 允许水或者甘油以及其他小的非电解质通过[51], 其已经在哺乳动物中被证实可以在外侧膜中充当导管, 将水释放到外环境中以防止细胞肿胀[52]。在碱度驯化两组中AQP3a显著下调, 水分无法有效排出细胞外, 这可能是鳃间质水肿, 上皮细胞水肿的原因(图 1c~1f)。NBCe1/SLC4A4是由SLC4基因家族编码的五种钠离子偶联碳酸氢根转运蛋白之一, 在鳃上皮细胞中NBCe1执行1个Na+内转运, 2个HCO3−外转运的协同运输[53]模式。CA-Ⅱ在鳃中富集, 鳃中CA-Ⅱ可以促进CO2和H2O催化生成H+和HCO3−[54]。CA-Ⅱ还可与NBCe1结合[55], 增强转运。在罗非鱼(Oreochromis spp.)的碱度胁迫实验中CA-Ⅱ和NBCe1均显著上调[56]。
以往的研究表明, 鱼体能适应和耐受高碱度环境, 解决鱼体内氨氮废物的排泄问题是关键[57]。在河豚(Tetraodontidae)中NH3通过Rhbg扩散穿过基底细胞外侧细胞膜进入鳃细胞, 然后通过Rhcg2\Rhcg1扩散穿过外侧的鳃细胞膜进入外环境[58], 黑鲷Rhcga和河豚Rhcg2序列和亲缘关系较近[59]。河豚中Rhcg2主要是在PVC细胞中靠被动扩散的方式排出, PVC的基底外侧Rhbg[60]和顶端Rhcg2协作, 以促进氨从鳃中排出[61]。在斑马鱼中Rhcgb与H+-ATP酶在“酸捕获氨转运”中起偶联作用, H+-ATP酶将H+泵送到皮肤/鳃的表面酸化层来促进NH3通过Rhcg1扩散[62]。Rhbg、Rhcga、Rhcgb 3种氨转运蛋白相互协作, 促进鱼体中NH3排出体外[63], 维持黑鲷鱼体内血氨平衡。荧光定量结果表明, 碱度驯化初期, Rhcga、Rhcgb、Rhbg、CA-Ⅱ和slc4a4(NBCe1)显著上调, 经过驯化后仅16 mmol/L碱度组Rhcgb依旧显著高于对照组和32 mmol/L碱度组, 说明在长期碱度驯化下, 16 mmol/L碱度组的氨氮排泄效率高于对照组和32 mmol/L碱度组。50 d后16 mmol/L碱度组中血清中NH3显著低于其他各组也印证了这一点。16 mmol/L组其能量利用效率也高于32 mmol/L组, 鳃中并没有出现显著的低氧效应现象。更高的NH3排泄效率需要更强的离子调节能力, 对能量的需求也更高。长期碱度处理后, 血清中pH、乳酸、尿素氮、HCO3-浓度在对照组和16 mmol/L处理组和32 mmol/L处理组之间无显著差异, 均保持相对稳定。
综上所述, 短期NaHCO3碱度处理会造成黑鲷鳃损伤并凋亡, 而长期碱度驯化对黑鲷的鳃结构和功能产生了显著的适应性变化。在形态学上, 黑鲷鳃均表现出鳃丝厚度增加、鳃小片变短且直径变粗等重塑现象, 这些变化可能有助于减少与外界的接触面积, 降低渗透压调节的压力。紧密连接通路相关基因的上调降低了细胞旁通路的渗透性。16 mmol/L处理组通过诱导细胞凋亡和增殖的协同效应, 以及离子调节蛋白和氨转运蛋白的方式实现了更高的NH3排泄效率。32 mmol/L处理组则激活了低氧代谢途径, 以高耗能为代价维持细胞的正常功能运转, 同时抑制细胞增殖和细胞凋亡通路, 最终长期碱度驯化下通过离子调节基因和氨转运蛋白表达, 维持了体内血氨平衡。本研究有助于深入了解黑鲷在碱度环境下的适应性调节机制, 为耐盐碱鱼类优良品种选育和培养提供理论依据。
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