2025, Vol. 49
文章信息
- 韩梦雪, 刘长水, 马庆军. 2025.
- HAN Mengxue, LIU Changshui, MA Qingjun. 2025.
- 创伤弧菌膦酸乙醛水解酶PhnX的重组表达、活性分析及晶体生长
- Recombinant expression, enzyme activity, and crystallization of the Vibrio vulnificus phosphonoacetaldehyde hydrolase (PhnX)
- 海洋科学, 49(4): 66-75
- Marine Sciences, 49(4): 66-75.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20241210002
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文章历史
- 收稿日期：2024-12-10
- 修回日期：2025-02-20
2. 青岛海洋科技中心 海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
磷是生命体中不可或缺的元素之一, 它作为核酸和ATP等重要生物分子的组成元素, 参与到生命体的DNA复制、细胞分裂、能量代谢等生命活动中[1]。对于海洋生物而言, 磷往往是一种限制性营养元素[2-3]。海洋中的磷元素以无机磷与有机磷的形式存在, 在生物量丰富的海洋表层, 生物利用度高的无机磷酸盐含量极低(几nmol/L), 而有机磷含量相对较高(几十到几百nmol/L)[4]。其中, 膦酸盐是海洋有机磷库的重要组成部分, 可占到溶解有机磷的10%~25% [5-6]。海洋生物自身可以合成膦酸类代谢物, 是海洋膦酸盐的自然来源; 而化学合成的膦酸化合物也在农业及工业中有广泛应用, 其排放入海构成了海洋膦酸盐的人为来源[7-8]。膦酸盐是一类含有C-P键的化合物, 与常见的C-O-P键相比, 具有更高的化学稳定性, 难以被降解和利用[5]。由于这些化合物的广泛使用性、化学稳定性和潜在毒性, 膦酸盐在环境中不断积累, 成为潜在的环境污染物[9]。尽管如此, 一些海洋微生物发展出了有机磷分解代谢途径, 利用“特殊”的酶类将有机膦酸盐转化为无机磷酸盐, 这不仅能为微生物自身使用, 同时也构成了海洋磷元素循环的重要环节[10-13]。因此, 研究海洋微生物有机膦酸盐分解代谢途径相关酶催化反应具有重要意义。
根据C-P键断裂方式的不同, 海洋微生物对膦酸盐的降解途径可区分为水解、氧化和自由基3种途径; 自由基途径具有底物谱宽泛性的特点, 而水解途径和氧化途径具有底物特异性的特点[14]。其中, 水解途径中的膦酸乙醛水解酶(phosphonoacetaldehyde hydrolase, PhnX)基因在膦酸盐的降解过程中扮演了关键角色, 标志着微生物具有了对膦酸盐的代谢能力[15]。该酶能够作用于磷酸乙醛(phosphonoacetaldehyde, PAA), 将其分解为磷酸和小型有机分子, 从而生物体合成磷酸类化合物提供磷源保障。在中太古代, 随着PhnX的出现, 微生物开始具有了降解膦酸盐的能力, 为微生物提供了一种新的磷源利用途径[15]。随着时间的推移, 能作为磷源的膦酸盐分子种类在不断增加, 特别是phnW基因的出现后, 后者编码的2-氨基乙基磷酸-丙酮酸转氨酶(2-aminoethylphosphonate transaminase, PhnW)能够与PhnX协同作用, 从2-氨基乙基膦酸(2-aminoethylphosphonate, AEP)中释放磷酸[16]。AEP作为海洋中最丰富且广泛存在的膦酸盐[17], 这种协同作用扩展了微生物的代谢能力。因此, PhnX是有机磷向无机磷转化的关键一环, 为微生物在竞争激烈的环境中提供了生存优势, 展示了其在生态系统中的重要性。
目前, 对于PhnX的结构与功能研究主要集中在土壤微生物和病原微生物中[9, 18-22]。然而, 海洋细菌中的PhnX的酶学性质和蛋白结构鲜有研究。通过分析表层和深海磷循环途径中代谢相关潜力基因的丰度, 确定了磷循环过程中的主要消费类群, 在含有PhnW-PhnX代谢通路的海洋细菌中, 约80%是分布在γ-变形菌(Gammaproteobacteria)中, 尤其是弧菌(Vibrio)[23]。弧菌属于革兰氏阴性菌, 是一类兼具遗传多样性与生态多样性的异养细菌, 广泛分布于海洋环境中。弧菌因具有致病性而受到广泛关注[24], 同时, 弧菌繁殖快, 代谢能力强, 在海洋特别是近海环境有机物的营养循环中具有重要作用[25]。研究其磷分解代谢途径相关酶的结构与催化机制具有重要的代表性和参考价值。
本研究首次对创伤弧菌(Vibrio vulnificus)PhnX (VvPhnX)开展了基因克隆、蛋白重组表达、活性分析及晶体生长, 为了解该酶的结构和工作机制奠定了基础, 同时为海洋中磷代谢的分子途径提供新认知。
1 材料与方法 1.1 实验材料菌株为V. vulnificus ATCC 27562标准株, 购买自广州环凯微生物科技有限公司; 质粒为pETM11、大肠杆菌克隆菌株DH5α和表达菌株BL21(DE3)为本室保存; 限制性内切酶NcoI和EcoRI、Protein MW Marker购于Thermo公司; PrimeSTAR Max Premix (2×)高保真DNA聚合酶、DL2000/5000 DNA Marker均购于TaKaRa公司; Bradford蛋白质定量试剂盒购于TIANGEN; ClonExpress Kit购于Vazyme; 丙酮酸钠、还原型辅酶Ⅰ二钠(β-NADH二钠)、磷酸吡哆醛(PLP)、乙醇脱氢酶(ADH)、MgCl2、三乙醇胺(TEA)、牛血清蛋白(BSA)、AEP购于阿拉丁生化科技股份有限公司; 2-氨基乙基磷酸-丙酮酸转氨酶(PhnW)本实验纯化所得; HRP-conjugated Mouse anti His-Tag mAb (AE028) 购于爱博泰克公司; Sparkjade ECL plus超敏化学发光试剂盒购于思科捷生物公司。
1.2 生物信息学分析利用NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析核酸与氨基酸序列; 使用Xtalpred Server(https://xtalpred.godziklab.org/XtalPred-cgi/xtal.pl)预测蛋白二级结构; 利用NCBI COBALT(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi)进行多序列比对; 通过ESPript3.0(https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)对蛋白进行保守性分析; 使用AlphaFold(https://alphafold.com/)对蛋白进行结构预测。
1.3 重组表达质粒的构建根据蛋白VvPhnX(WP_026050741.1)的基因序列设计PCR引物, 引物分别为F: 5′-TTTATTTTCAGG GCGCCATGAGCAACTCACCAATTCAA-3′, R: 5′-TT GTCGACGGAGCTCCTATGGACGCTCACCTGCT-3′。以V. vulnificus ATCC 27562基因组为模板进行基因克隆, PCR反应体系为50 μL, 包括: 25 μL的PrimeSTAR Max Premix(2×), 1 μL的模板, 引物F、引物R各2 μL, 20 μL的ddH2O。扩增条件为: 95 ℃预变性5 min, (95 ℃变性30 s; 55 ℃退火30 s; 72 ℃延伸1 min)×25个循环; 72 ℃延伸2 min。使用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果, 回收目的基因片段。利用无缝克隆法, 使用ClonExpress Kit将基因序列与经NcoI/EcoRI酶切后的pETM11载体进行重组相连, 然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。次日挑取阳性克隆, 接种至含50 mg/L硫酸卡那霉素的LB液体培养基中, 37 ℃, 150 r/min培养过夜后抽提质粒, 送测序。
1.4 重组蛋白的表达及纯化将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中, 涂布于含50 mg/L硫酸卡那霉素的LB固体培养基中, 37 ℃倒置培养18 h。挑取单克隆菌落转入10 mL含50 mg/L硫酸卡那霉素的LB液体培养基中37 ℃, 150 r/min培养, 形成菌体放大的种子液。将种子液转入1 L含50 mg/L硫酸卡那霉素的LB液体培养基中, 37 ℃, 150 rpm培养至OD600~0.8, 降温至16 ℃, 加入终浓度100 μmol/L IPTG, 诱导16 h。
将诱导结束的菌液在16 ℃, 8 000 r/min的条件下, 离心10 min, 弃上清, 收集菌体。使用平衡缓冲液(50 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, pH 8.0)重悬沉淀, 对重悬液进行超声, 破碎细胞, 释放目的蛋白。将菌体破碎液在4 ℃, 15 000 r/min条件下, 离心1 h, 收集上清液。将上清液使用0.22 μm滤膜加至平衡缓冲液平衡好的Ni-NTA镍柱(上海生工)中, 使用洗涤缓冲液(50 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L咪唑, pH 8.0)洗涤后, 加入适量洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris, 150 mmol/L Tris, 250 mmol/L咪唑, pH 8.0)洗脱并收集蛋白。
对收集的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分析, 以监测表达纯化过程中的目的蛋白。后续进行蛋白印迹来检测是否为含有6×His标签的目的蛋白。对样品进行SDS-PAGE凝胶电泳后, 采用半干转印法进行Western Blot, 即在25 V、2.5 A的条件下转膜10 min, 转膜完成后, 将硝酸纤维素膜(NC膜)浸泡在5% (w/v)脱脂奶粉中, 封闭低速振荡封闭1 h; 孵育HRP-conjugated Mouse anti His-Tag mAb (AE028)抗体2 h; 使用PBST(按照0.1%的体积比向1×PBS缓冲液中加入Tween-20)洗膜8 min, 洗3次; 利用超敏化学发光试剂盒, 按照说明书, 将A液和B液在避光处等体积混合。将显色液均匀滴加到膜上, 在BIORAD成像系统中进行显影, 并拍照记录。
目的蛋白通过交换缓冲液(50 mmol/L Tris, 150 mmol/L Tris, pH 8.0)平衡好的PD-10层析柱(Cytiva)进行脱咪唑处理。随后以40∶1(w/w)向蛋白溶液中加入TEV酶, 混匀后于4 ℃摇晃处理12 h以上, 以切除N端标签。TEV酶切完成后, 使用0.22 μm滤膜把蛋白溶液过滤到交换缓冲液平衡后的Ni-NTA镍柱中, 收集流出液, 获得不含N端标签的目的蛋白。
将浓缩后的目的蛋白采用凝胶排阻层析法进一步纯化。选用HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 200 pg层析柱(Cytiva)进行目的蛋白纯化。将蛋白洗脱峰峰尖样品稀释到1 mg/mL后, 选用SuperdexTM 200 increase 10/300 GL层析柱(Cytiva)进行目的蛋白表观分子量的测定。层析柱平衡缓冲液为: 10 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, pH 7.5, 1 mmol/L DTT。将分子筛纯化后的目的蛋白使用SDS-PAGE凝胶电泳验证纯度后, 分装并保存于−80 ℃。
1.5 酶活性检测偶联酶法检验VvPhnX酶活性[26], 酶活体系由50 mmol/L TEA buffer pH 8.5、5 mmol/L AEP、5 mmol/L丙酮酸钠、0.5 mmol/L β-NADH、100 μmol/L PLP、5 mmol/L MgCl2、0.07%(w/v)BSA、10 U ADH、0.1 μmol/L PhnW和5 μmol/L VvPhnX组成。在20 ℃下, 加入VvPhnX启动反应发生, 使用Cary 60紫外分光光度计(Agilent Technologies)监测340 nm下的吸光值变化。酶活原理为, AEP首先通过偶联转氨酶PhnW转化为膦酸乙醛(PAA), 随后PAA被VvPhnX水解转化成乙醛, 乙醛进一步被ADH还原为乙醇, 同时消耗NADH。由于NADH在340 nm下有特征吸收峰(Ɛ340 = 6 220 L·mol–1·cm–1), 因此, 通过检测NADH的吸光值变化即可计算出NADH消耗的量, 经化学计量比1∶1可换算出VvPhnX消耗底物PAA的量, 由此计算酶活力。据此, VvPhnX酶活定义为, 每毫克VvPhnX蛋白在单位时间内通过偶联酶法所消耗底物PAA的量。酶活检测实验的空白对照组则不加入VvPhnX, 其余酶活体系成分相同。
1.6 热稳定性分析利用热漂移(Thermal Shift Assay, TSA)检测蛋白热稳定性。蛋白样品浓度为0.4 mg/mL, 荧光染料为SYPRO Orange, 缓冲液为10 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, pH 7.5, 1 mmol/L DTT。使用荧光定量PCR仪(analytikjena)检测Tm值, 设置变温范围为25~95 ℃, 变温速率为1 ℃/min, 激发波长490 nm, 发射光波长580 nm。
将纯化后的酶液分别于20、30、40、50、60、70 ℃条件下恒温放置1 h后, 按上述酶活方法测定残余活性, 以未处理的酶为对照, 计算不同温度下VvPhnX的残余酶活百分比, 分析酶的热稳定性。
1.7 蛋白晶体制备结晶实验采用坐滴汽相扩散法, 温度为20 ℃。使用商业试剂盒(Hampton Research的Crystal Screen 1-2和Index; Rigaku的Wizard Classic 1-4)筛选初始结晶条件。将0.7 μL 10 mg/mL蛋白溶液和0.7 μL结晶试剂组成的滴液与50 μL池液溶液在96孔晶体板上生长。后期对结晶条件的缓冲液pH、沉淀剂浓度和盐浓度等优化则在48孔晶体板上进行。
2 结果与分析 2.1 生物信息学分析NCBI检索VvPhnX的编码基因全长为816 bp, 编码271个氨基酸。在线网站Expasy分析其理化性质为: 分子量29.499 kDa、等电点4.62。Xtalpred Server预测该蛋白二级结构含有15个α-螺旋和6个β-折叠, N端和C端各有一小段无序结构, 无信号肽和跨膜区。根据软件分析的蛋白理化性质和预测的二级结构的启示, 本实验选用的纯化策略有望得到可溶性表达蛋白。同时预测结果显示专家库和随机森林分类算法分别得分为3和4, 均提示结晶难易程度为中等。利用ESPript3.0对文献已报道的同源蛋白序列进行序列保守性分析(图 1), 显示同源度在40%以上, 参与序列比对的物种为V. vulnificus、Bacillus cereus、Pseudomonas aeruginosa、Salmonella typhimurium、Oleispira antarctica、Karlodinium veneficum和Vibrio splendidus。通过与已报道有活性同源蛋白Bacillus cereus PhnX(BcPhnX)的活性位点进行残基比对[22], VvPhnX活性位点分别对应为Aps12、Ala14、Thr16、Met50、Lys54、His57、Ser127、Tyr129、Arg 162、Lys185、Asp187和Asp188, 结果显示活性位点残基保守(图 1)。利用AlphaFold在线预测VvPhnX蛋白结构(图 2), 结果显示, 预测的整体结构是由2个结构域组成, 活性位点位于2个结构域之间, 形成1个口袋, 活性位点残基在空间排布上是合理的。综上推测, VvPhnX可能具有酶催化活性。
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| 图 1 VvPhnX与同源蛋白的序列比对 Fig. 1 Sequence alignment of VvPhnX and its homologs 注: 活性位点基于已报道活性位点的同源蛋白Bacillus cereus PhnX(BcPhnX)进行▲标记。参与序列比对的蛋白名称及NCBI序号分别为: Vibrio vulnificus(WP_026050741.1)、Bacillus cereus(AAB86434.2)、Pseudomonas aeruginosa (MBH9327731.1)、Salmonella typhimurium (AAB39641.1)、Oleispira antarctica (CCK77537.1)和Vibrio splendidus(WP_004730152.1) |
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| 图 2 VvPhnX蛋白结构预测 Fig. 2 Structure prediction of the VvPhnX protein 注: 整体结构由两个结构域组成, 活性位点残基使用棍棒形状显示 |
经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物, 可见约800 bp的目的基因条带(图 3a)。随机挑取4个单克隆菌落进行菌落PCR, 结果均为阳性克隆(图 3b), 重组质粒测序结果正确, 表明表达载体构建成功。
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| 图 3 VvphnX的DNA扩增和阳性克隆鉴定 Fig. 3 Amplification of the VvphnX and identification of positive clones 注: (a) DNA扩增。M: DL2000 DNA Marker, 泳道1: VvphnX的DNA扩增条带。(b) 阳性克隆鉴定。M: DL5000 DNA Marker, 泳道1-4: 阳性克隆鉴定条带 |
由于pEMT11-VvphnX诱导表达的蛋白带有组氨酸标签, 将表达后的上清液利用镍柱亲和层析进行纯化。SDS-PAGE结果(图 4a)显示, 不同的咪唑浓度洗脱蛋白的能力不同, 其中250 mmol/L浓度的咪唑洗脱获得32.8 kDa大小的带有6×His标签的蛋白较多且杂带较少。通过Western Blot检测, 确认洗脱下来的蛋白条带与预期大小一致, 与理论分子量大小相吻合(图 4b)。
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| 图 4 VvPhnX重组蛋白表达、纯化与Western Blot检测 Fig. 4 Expression, purification, and Western blotting of the recombinant protein VvPhnX 注: (a)SDS-PAGE; (b)Western Blot, 使用anti-His抗体进行蛋白印迹分析; M: 蛋白质marker; 泳道1: 诱导前; 2: 诱导后上清液; 3: 诱导后沉淀; 4: 镍柱流穿液; 5: 镍柱杂蛋白冲洗液; 6: 镍柱目的蛋白洗脱液 |
去掉His标签后进一步上样HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 200 pg层析柱后, 获得了峰形单一、对称且尖锐的蛋白洗脱峰。为了进一步确认目的蛋白在低浓度下的聚集形式, 将目的蛋白稀释后上样SuperdexTM 200 increase 10/300 GL层析柱, 根据表观分子量与洗脱体积的标准曲线换算出VvPhnX表观分子量大小为61.2 kDa(图 5), 是理论单体分子量的两倍大小, 因此可以推测VvPhnX在溶液中以二聚体形式存在, 这与之前的研究结果相吻合。据文献报道, 其他同源蛋白也以二聚体形式存在, 由于其二聚体界面主要由疏水残基组成, 推测二聚化主要是使蛋白在溶液中保持稳定[9]。这些因素支持了VvPhnX以二聚体形式存在主要与酶的稳定性有关。
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| 图 5 VvPhnX重组蛋白的分子筛纯化和SDS-PAGE鉴定纯度 Fig. 5 Gel filtration chromatography of the VvPhnX recombinant protein and purity ascertaining using SDS-PAGE 注: 使用SuperdexTM 200 increase 10/300 GL层析柱对VvPhnX进行表观分子量分析。出峰体积为14.69 mL, 根据表观分子量与洗脱体积的标准曲线(用于生成标准曲线的分子量标准品: 铁蛋白440 kDa; 过氧化氢酶250 kDa; 醛缩酶158 kDa; 牛血清白蛋白67 kDa; 肌红蛋白16.7 kDa。x轴为洗脱体积, y轴为lg(表观分子量), 得到的标准曲线方程为y = −0.209 8x + 7.868 6, 得出VvPhnX的表观分子量约为61.2 kDa |
为了验证VvPhnX酶是否具有膦酸乙醛水解酶的活性, 我们利用偶联酶法通过消耗NADH来间接监测酶的活性。结果发现, 酶活体系中加入VvPhnX后, 在340 nm波长下监测到了NADH的消耗, 随着反应的持续, NADH不断被消耗, 直到反应达到平衡(图 6a); 而空白对照组中不加入VvPhnX, 发现反应曲线没有起伏变化, 说明没有NADH的消耗, 无反应发生(图 6a)。结果显示, 实验组VvPhnX的比活力为6.6 μmol·min−1·mg pron−1(图 6b)。综上所述, VvPhnX具有膦酸乙醛水解酶的活性。
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| 图 6 偶联酶法检验VvPhnX酶活性 Fig. 6 Coupled assay employed to monitor the enzyme activity of VvPhnX 注: 实验组: 反应体系为50 mmol/L TEA buffer pH 8.5、5 mol/L AEP、5 mol/L丙酮酸钠、0.5 mol/L β-NADH、100 μmol/L PLP、5 mmol/L MgCl2、0.07%(w/v)BSA、10 U ADH、0.1 μmol/L PhnW和5 μmol/L VvPhnX组成, 在20 ℃下, 使用Cary 60紫外分光光度计监测在340 nm下NADH的减少量, 反应时间为300 s; 空白对照组: 反应体系中除了不加VvPhnX, 其余都同实验组一样; (a)图中NADH消耗量, 红线代表实验组, 黑线代表空白对照组; (b)图中酶的比活力, 每毫克VvPhnX所具有的酶活力单位数 |
利用TSA方法研究重组酶的Tm值, 以分析其热稳定性。实验结果显示(图 7), VvPhnX的Tm约为37 ℃, 且该酶从20 ℃时开始即发生热变性。在将酶置于不同温度下保温1 h后, 观察到其活性出现不同程度的下降(图 8)。VvPhnX的稳定性随着温度的升高而降低, 20 ℃为100%, 在30 ℃孵育1 h后, 酶的残余活性约为72%, 活性损失不大; 而在40 ℃孵育1 h后, 残余活性降至约为22%, 显示出大部分活性已丧失; 在50 ℃孵育1 h后, 残余活性接近于0。综上结果表明, VvPhnX具有中等热稳定性。
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| 图 7 热稳定性分析VvPhnX的Tm值 Fig. 7 Tm values of VvPhnX estimated employing the thermal shift assay 注: 三组平行的Tm值分别为37.3 ℃、37.6 ℃、37.4 ℃, 即VvPhnX的Tm=37.43±0.15 ℃(mean±SD) |
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| 图 8 VvPhnX重组蛋白的温度稳定性分析 Fig. 8 Temperature stability of VvPhnX 注: 每组温度下分别测量3组平行, 以未处理的酶为对照, 计算不同温度下的残余酶活百分比(mean±SD): 20 ℃为100%±1.5%、30 ℃为72.4%±2.8%、40 ℃为21.9%±2.7%、50 ℃为3.3%±0.5%、60 ℃为2.1%±0.5%、70 ℃为1.5%±0.5% |
对VvPhnX蛋白用结晶试剂盒对晶体生长条件进行初步筛选, 蛋白浓度为4.7 mg/mL, 3 d后发现, 在100 mmol/L HEPES pH 7.5、2% (w/v) PEG400、2 mol/L (NH4)2SO4的条件下生长出蛋白晶体(图 9a), 该晶体呈现出多面体的形状。在此基础上, 对蛋白浓度和该结晶条件中的PEG400沉淀剂浓度、HEPES缓冲液的pH和(NH4)2SO4的浓度进行优化, 优化后的蛋白浓度为6 mg/mL, 结晶条件为100 mmol/L HEPES pH 6.83、2% (w/v) PEG400、2.1 mol/L (NH4)2SO4, 最终得到了规则的立方体形状的蛋白晶体(图 9b), 这种规则的几何形状是蛋白质晶体常见的特征, 有助于进行下一步的X射线衍射, 以确定蛋白质的三维结构。
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| 图 9 VvPhnX蛋白晶体 Fig. 9 Crystal structure of VvPhnX 注: (a)结晶试剂盒的初筛条件: 100 mmol/L HEPES pH 7.5, 2% (w/v) PEG400, 2 mol/L (NH4)2SO4, 蛋白质量浓度为4.7 mg/mL。(b)优化后的结晶条件: 100 mmol/L HEPES, pH 6.83, 2% (w/v) PEG400, 2.1 mol/L (NH4)2SO4, 蛋白质量浓度为6 mg/mL |
目前通过对膦酸盐循环相关蛋白所在的基因组数据库分析, 已发现phnX在海洋中具有广泛的物种多样性, 主要分布于Gammaproteobacteria、Planctomycetia、Deltaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Bacilli等多个大类的细菌中[23]。可见众多海洋微生物具有phnX基因, 这是海洋微生物进行AEP等膦酸盐代谢的重要特征。然而多数研究仅通过基因来推测海洋微生物是否具有AEP等膦酸盐的代谢功能[11, 14, 23, 27], 尚缺少蛋白活性验证这一关键依据, 不利于我们进一步了解海洋生物AEP等膦酸盐代谢的真实情况。
在对海洋真核浮游植物Karlodinium veneficum的研究中, 虽然通过转录组分析检测到了PhnW-PhnX 2个酶的相关基因, 但未观察到该藻类具有AEP水解的能力[28]。这表明, 仅通过基因并不足以保证其在特定生物体内的功能表现。这种情况强调了在功能基因研究中蛋白活性验证的重要性。此外, 在海洋细菌O. antarctica和V. splendidus中尽管分离纯化了PhnX同源蛋白, 但未对蛋白活性及酶学性质进行系统表征[ 10, 29-30 ]。
本研究表达纯化并表征了创伤弧菌PhnX的活性和酶学性质, 并获得了该蛋白的晶体。这不仅为该基因在创伤弧菌中的膦酸盐代谢功能提供了数据支持, 也为研究其他海洋微生物膦酸盐代谢基因的功能提供了可借鉴的参考与依据。尽管如此, VvPhnX与其他海洋生物同源蛋白之间仍可能存在较大的序列差异, 意味着蛋白性质或许会发生变化, 因此表达纯化蛋白并对其活性进行表征, 对推测基因的真实功能仍然非常重要。另外, 获取蛋白结构, 并基于蛋白结构与功能的关系来推测同源序列差异对蛋白功能的影响, 也是预测基因功能的另一种有效的方法。
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