2025, Vol. 49
文章信息
- 姜珊, 赵张琪, 蒋之琛, 李学刚, 张均龙, 张德超, 沙忠利. 2025.
- JIANG Shan, ZHAO Zhangqi, JIANG Zhichen, LI Xuegang, ZHANG Junlong, ZHANG Dechao, SHA Zhongli. 2025.
- 黄河口潮间带沉积物夏秋季微生物群落特征及其对环境因素的响应
- Microbial community structure of intertidal sediments in the Yellow River estuary and its environmental response from summer to autumn
- 海洋科学, 49(5): 13-23
- Marine Sciences, 49(5): 13-23.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250110001
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文章历史
- 收稿日期：2025-01-10
- 修回日期：2025-04-17
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
潮间带系统是海洋、大气和陆地环境之间的关键界面, 其特征是温度、离子浓度、干燥、紫外线辐射和波浪作用等因素的频繁波动[1-2]。潮间带不仅为各种海洋植物和动物提供栖息地, 还作为陆地与海洋环境之间的缓冲区发挥着重要作用。潮间带沉积环境在淡水、潮汐和人为因素的共同影响下不断变化, 形成很高的生物多样性。潮间带沉积物微生物在养分循环中发挥着复杂的功能, 对于海洋中有机碳、氮和其他营养物质的转化和再矿化至关重要, 通过将有机物分解为无机形态, 从而增加海洋环境中养分的可用性。此外, 微生物也参与流入潮滩污染物的分解[3]。
黄河口潮间带北临渤海, 东靠莱州湾, 是我国典型的滨海湿地, 是一个具有丰富生态多样性和复杂环境条件的区域[4]。潮间带沉积物微生物对环境变化敏感, 潮间带环境条件的快速波动导致其呈现出种类和代谢多样性, 对潮间带生态健康有很好的指示作用。理解沉积物微生物群落的分布和功能变化, 以及人为因素(例如工业和生活废水可能含有重金属和有机污染物等)和自然因素(例如季节、地理距离、离子浓度、基质等)对其影响的程度, 对于评估黄河口潮间带的生态影响至关重要[2, 5]。已有的少数研究主要分析了黄河口潮间带沉积物微生物的多样性, 但样品数量一般较少, 没有对不同季节沉积物微生物群落结构以及对环境因子的响应分析[6-9]。我们对黄河口潮间带沉积物中微生物群落的了解仍然有限, 这对于理解该环境中微生物的生态功能至关重要。本研究选取黄河口潮间带8个不同站位, 分别于2023年夏季和秋季进行了定点采样。基于高通量测序技术, 分析该区域微生物夏秋季节的群落结构变化, 功能潜力以及对环境因子的响应。这一研究不仅将丰富黄河口潮间带微生物生态学的基础数据, 还为湿地保护和管理提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 研究区域与样品采集本研究的样品采集自山东东营黄河口潮间带, 研究区域横跨8个站位(X1—X8, 图 1), 基本涵盖了潮汐影响下不同的沉积环境。采样工作在2023年7月(夏季)和9月(秋季)分别进行。每个站点采集6个表层沉积物样品, 共计96个表层沉积物样本。所有沉积物样品均在低温条件下运送到实验室。在后续的分析中, 沉积物DNA样品用于16S rRNA基因扩增子高通量测序分析。
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| 图 1 黄河口潮间带采样站位图[根据审图号鲁SG(2022)002号的地图制作] Fig. 1 Sampling stations in the intertidal zone of the Yellow River Estuary |
主要参照《海洋监测规范第5部分: 沉积物分析》(GB17378.5—2007)[10]和《海洋调查规范第4部分: 海水化学要素调查》(GB12763.4—2007)[11]等国家标准执行。使用Thermo Fisher Scientific-iCAP Q ICP-MS分析仪测定重金属含量。使用Winner3008A全自动大量程干法激光粒度仪测定沉积物样品粒度。使用德国元素Elementar vario TOC总有机碳分析仪测定沉积物样品总有机碳(TOC)[12]。
1.3 DNA提取及高通量测序称取0.25 g沉积物样品, 采用土壤基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取样品总基因组DNA。使用Nanodrop对提取DNA进行质量检测, 检测合格后, 对微生物的16S rRNA基因的V3—V4区进行PCR扩增, 采用Agilent 5400检测PCR产物。利用NovaSeq进行高通量测序。
1.4 数据分析使用QIIME2[13](v2024.9)对样本的16S rRNA扩增子序列进行生物信息学分析。通过DADA2算法去噪后生成ASVs(Amplicon Sequence Variants)表和代表序列文件。将代表序列与SILVA数据库比对, 完成物种注释, 并且根据ASVs特征表计算每个样本中各菌群在不同分类水平上的相对丰度, 使用ggplot2、tidyr、tibble等R包对门水平和属水平平均丰度前15的微生物进行丰度图的可视化分析。使用QIIME2的diversity插件计算Shannon、Chao等α多样性指数, 使用cowplot、ggplot2、dplyr包绘制箱线图。采用PCA结合PERMANOVA分析[14]研究β多样性, 评估夏秋季的微生物群落结构差异。基于Bray-Curtis距离计算样本间的差异, 并结合PERMANOVA, 使用tidyverse, ggrepel, vegan等R包绘制主成分分析图。此外, 使用LEfSe分析方法, 基于LDA(Linear Discriminant Analysis) > 3进行筛选, 鉴定在夏秋两个季节之间显著差异的属水平的微生物, 使用Python(3.12)进行差异分析可视化。基于FAPROTAX[15]数据库对16S rRNA基因数据进行功能注释, 关键参数为“python collapse_table.py --input_table --out_collapsed --input_groups_file --out_report --row_ names_are_in_ column 'taxonomy'”, 将结果使用pheatmap包进行可视化分析。
2 结果 2.1 黄河口潮间带沉积物的微生物群落结构夏季和秋季8个站位主要环境信息结果见表 1。对夏季和秋季共96个黄河口潮间带表层沉积物样品进行ASVs聚类并进行物种分类注释, 在门和属水平上进行相对丰度研究。2个季节共注释到86个微生物门级单元。对平均相对丰度前15名的门水平微生物进行可视化分析, 发现相关门水平微生物丰度在不同样本之间分布相对稳定(图 2)。细菌类群中, 变形菌门(Proteobacteria)占据主导地位, 平均相对丰度为35.55%, 明显高于其他门水平细菌类群。其次是拟杆菌门(Bacteroidota)和脱硫杆菌门(Desulfobacterota)平均相对丰度分别为12.07%和12.35%。其他细菌门水平类群, 包括放线菌门(Actinobacteriota)(5.11%)、蓝细菌门(Cyanobacteria)(4%)、酸杆菌门(Acidobacteriota)(3.2%)和绿弯菌(Chloroflexi)(2.5%)。古菌类群中, 主要包括泉古菌门(Crenarchaeota)(3.7%)和纳古菌门(Nanoarchaeota)(3.3%)。通过对平均相对丰度排名前15名的属水平微生物群落分析(图 3), 细菌类群中, 伍斯氏菌(Woeseia)的平均相对丰度最高。古菌类群中氨氧化古菌Candidatus Nitrosopumilus在多个样本中均表现出较高的丰度, 平均相对丰度为3.05%。
| 站点 | 含水率/% | pH | TP的质量分数/(×106) | TN的质量分数/(×106) | TOC的质量分数/(×106) | 硫化物的质量分数/(×106) | 沉积物的容重/(g·cm−³) |
| X1-A | 20.80 | 9.05 | 379.2 | 283.6 | 500 | 0.95 | 1.30 |
| X2-A | 21.43 | 8.80 | 356.1 | 348 | 1 300 | 1.13 | 1.37 |
| X3-A | 20.58 | 8.95 | 389.6 | 332.8 | 1 000 | 0.63 | 1.41 |
| X4-A | 22.93 | 8.74 | 436.6 | 376.9 | 2 000 | 8.37 | 1.24 |
| X5-A | 18.70 | 9.00 | 234.6 | 320.3 | 1 000 | 0.77 | 1.47 |
| X6-A | 28.38 | 8.39 | 243.9 | 919 | 5 300 | 0.73 | 1.08 |
| X7-A | 24.10 | 8.81 | 236.2 | 390.8 | 1 300 | 1.3 | 1.34 |
| X8-A | 21.86 | 8.92 | 377.7 | 323.7 | 2 000 | 0.64 | 1.49 |
| X1-S | 23.51 | 8.38 | 580.7 | 198.4 | 1 600 | 0.20 | 1.41 |
| X2-S | 23.23 | 8.39 | 291.0 | 128.2 | 1 000 | 8.96 | 1.43 |
| X3-S | 24.05 | 8.49 | 326.4 | 253.7 | 810 | 0.27 | 1.45 |
| X4-S | 22.73 | 8.46 | 431.6 | 234.0 | 2 100 | 1.72 | 1.32 |
| X5-S | 19.71 | 8.33 | 264.4 | 184.3 | 1 400 | 13.11 | 1.43 |
| X6-S | 22.72 | 8.52 | 132.9 | 106.1 | 780 | 6.31 | 1.03 |
| X7-S | 31.72 | 8.20 | 152.4 | 457.5 | 3 400 | 9.95 | 1.00 |
| X8-S | 24.57 | 8.38 | 118.7 | 121.0 | 720 | 36.13 | 1.39 |
| 注: S表示夏季, A表示秋季 | |||||||
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| 图 2 夏秋季微生物类群在门水平的相对丰度 Fig. 2 Relative abundances of microbial taxa at the phylum level in summer and autumn 注: S1—S6分别对应夏季同一个站位的6个不同样品, A1—A6分别对应秋季同一个站位的6个不同样品 |
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| 图 3 夏秋季微生物类群在属水平的相对丰度 Fig. 3 Relative abundances of microbial taxa at the genus level in summer and autumn 注: S1—S6分别对应夏季同一个站位的6个不同样品, A1—A6分别对应秋季同一个站位的6个不同样品 |
分别从Chao指数、Shannon指数和Pielou均匀度指数, 比较夏秋季节之间的α多样性差异(图 4)。夏季Chao指数为1 847±802, 秋季Chao指数为2 936±330, 两组间Wilcoxon检验P值为2.494 611×10–15, P<0.000 01。秋季和夏季Shannon指数分别为9.96±0.287和8.43±2.23, 经Wilcoxon检验P值为1.818×10–13, 差异极其显著, 表明秋季物种丰富度显著高于夏季且均匀分布。两个季节的样本中物种分布都非常均匀, 秋季Pielou指数为0.888±0.024 5, 夏季Pielou指数为0.775±0.210。综上, 秋季和夏季的α多样性存在显著差异, 且秋季物种丰富度和均匀度均高于夏季。
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| 图 4 夏秋季微生物类群多样性指数 Fig. 4 Diversity indices of the microbial community in summer and autumn |
PCA分析的前两个主成分(PC1和PC2)分别解释了13.53%和7.51%的微生物群落差异(图 5)。在PCA二维图中, 夏季样本和秋季样本各自聚集成群, 且两组样本的分布存在显著差异(PERMANOVA分析, P=0.001)。PERMANOVA分析进一步表明, 季节对微生物群落结构的解释率为7.15%(R2=0.071 5), 表明季节变化是影响微生物群落结构的重要因素。此外, 夏季样本的分布范围更广, 置信区间椭圆面积大于秋季, 反映了夏季样本的微生物群落组成在空间上的多样性和异质性较高, 而秋季样本则呈现更为集中和一致的分布。结合Bray-Curtis距离的离散度(群落变异性)的箱线图显示, 秋季的微生物群落间距离显著高于夏季(P<0.05)。
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| 图 5 主成分分析结合多元方差置换分析评估夏秋季的微生物群落结构差异 Fig. 5 Differences in microbial community structures between summer and autumn based on principal component analysis combined with permutational multivariate analysis of variance |
通过LEfSe分析夏秋季节间属水平上显著差异的微生物类群(图 6)。夏秋两季存在显著性的属水平菌群共计37个, 其中夏季9个, 秋季28个。夏季显著富集的属包括SCGC_AAA011_D5、梭形杆菌属(Fusibacter)、Yoonia_ Loktanella、甲基嗜盐菌属(Methylophaga)、Izimaplasma和龙杆菌属(Draconibacterium)等。秋季显著富集的属则包括芽孢杆菌属(Bacillus)、甲基海洋杆菌属(Methyloceanibacter)、线状微菌属(Filomicrobium)、淤泥棒菌属(Limibaculum)、硅藻单胞菌属(Silicimonas)、海滨小杆菌属(Actibacterium)、MBNT15、Subgroup_26、OM27_clade和P3OB_42等。
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| 图 6 夏秋季节间属水平上显著差异的微生物类群 Fig. 6 Microbial genera showing significant differences in abundance between summer and autumn |
通过Pearson相关性分析与Mantel检验的结合, 对秋季和夏季的环境因子与微生物群落结构的相关性进行分析(图 7)。结果表明微生物群落结构受到多种环境因子的显著影响, 且这一响应具有季节性差异。在夏季, 绿弯菌门(Chloroflexi)表现出对总磷(Total Phosphorus, TP)的强相关性(P<0.01), 蓝细菌门(Cyanobacteria)和硫化物、总氮(Total Nitrogen, TN)显著相关(P<0.05); 秋季各种微生物与环境因子的相关性显著增强, 硫酸盐还原菌门(Desulfobacterota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、粘球菌门(Myxococcota)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)等微生物门类的丰度与Cd、Zn、As、Cd、Pb、Hg等重金属离子的浓度相关性较强(P<0.01), 环境pH和TP等因子也与多种微生物丰度相关。结果显示, 夏季和秋季的微生物丰度均与环境因子存在较强的相关性, 且不同季节的微生物受不同的环境因子影响, 表现出不同的丰度变化。其中绿弯菌门(Chloroflexi)在2个季节都表现出较强的与环境因子的相关性, 且在2个季节中分别与不同的环境因子相关。
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| 图 7 夏秋季微生物群落结构对环境因子的响应 Fig. 7 Responses of microbial community structures to environmental factors in summer and autumn |
经过FAPROTAX功能注释后, 选取夏秋季样本中平均相对丰度排名前22的共有功能, 结合在每个样品中的丰度信息进行可视化分析(图 8), 并从功能差异层面进行聚类。2个季节丰度均较高的是和氮、硫代谢相关的功能, 经过Wilcoxon检验后, 硝化作用(nitrification)、好氧氨氧化作用(aerobic ammonia oxidation)、好氧化能异养作用(aerobic chemoheterotrophy), 硝酸还原(nitrate reduction)、硫化合物的呼吸作用(respiration of sulfur compounds)、硫酸盐呼吸(sulfate respiration)和甲基营养作用(methylotrophy)7个功能在2个季节无显著差异(P > 0.05), 说明氮、硫循环在2个季节微生物的代谢过程中均占据重要地位且较为稳定, 不受季节变化的强烈影响。此外, 通过对夏季和秋季样本的代谢差异进行分析发现, 秋季样本中显著上调的代谢功能有产氧光自养(oxygenic_photoautotrophy)、光自养(photoautotrophy)和氢营养甲烷生成(hydrogenotrophic_methanogenesis)等, 主要为自养型代谢功能; 而夏季样本中显著上调的为化能异养(chemoheterotrophy)、氮呼吸(nitrogen respiration)、硝酸盐呼吸(nitrate respiration)、发酵(fermentation)、硫代硫酸盐呼吸(thiosulfate respiration)和烃类降解(hydrocarbon degradation)等, 主要与分解代谢功能相关。这表明, 秋季微生物更倾向于进行自养代谢, 而夏季微生物中分解代谢占主导地位。
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| 图 8 夏秋季微生物群落功能预测 Fig. 8 Functional predictions of microbial communities in summer and autumn 注: S1-S6分别对应夏季同一个站位的6个不同样品, A1-A6分别对应秋季同一个站位的6个不同样品 |
黄河口潮间带作为重要的湿地生态系统, 其沉积物中的微生物群落结构和功能对于维持生态平衡和生物地球化学循环具有重要意义。王凯等[6]通过变性梯度凝胶电泳方法, 发现黄河口潮滩的优势细菌是变形菌、酸杆菌门和一些未分类的类群。尹霞等[7]通过荧光定量PCR和高通量测序方法, 发现黄河口潮间带沉积物的优势类群有变形菌门、绿弯菌门、放线菌门和酸杆菌门。本研究则发现变形菌门、拟杆菌门、脱硫杆菌门和放线菌门为黄河口潮间带沉积物微生物的优势门类; 同时我们发现宁夏典农河[16]沉积物以及辽河口沉积物的优势门水平研究结果与本研究更接近: 第一、第二位优势门均为变形菌门和拟杆菌门, 绿弯菌门排名相对靠后。造成研究结果差异的原因除了采样点不同外, 分析方法和软件也是影响16s分析结果的关键因素之一, 已有研究表明QIIME2中基于DADA2算法的ASV分析各项性能要优于USEARCH算法[17], 因此综合来看本研究结果更为稳健准确。
变形菌门是滩涂、湿地和河流沉积物中分布最广泛的细菌, 在氮循环和有机物分解生态过程中起到重要的作用。拟杆菌门在沉积物环境中普遍存在, 参与营养物质的循环。脱硫杆菌门在沉积物中一般与硫氧化有关, 能将低价态的还原性硫化物或者单质硫氧化成硫酸盐等。黄河口潮间带沉积物属水平的优势类群中, 伍斯氏菌分离自威海小石岛的海洋沉积物, 是化能异养和兼性厌氧菌, 能够降解烃类化合物[18], 是海洋沉积物细菌区系的核心成员。在渤海、黄海和东海北部的表层沉积物中是主要的优势菌属[19]。氨氧化古菌(AOA)广泛存在于各种海洋环境中, 并在全球氮循环和碳循环中发挥重要作用。海洋泉古菌门Nitrosopumilus属首次在古菌中被发现能以化能自养的方式通过有氧氧化氨产生亚硝酸盐生长, 可能对全球碳和氮循环具有重要意义[20]。
3.2 夏秋季黄河口潮间带沉积物显著富集的微生物类群, 很多与甲烷等碳循环密切相关通过PCA分析, 我们发现夏秋季的不同样本在群落组成上存在明显分离, 这表明季节变化在一定程度上驱动了微生物群落结构的差异。夏季显著富集的属中, 甲基嗜盐菌属(Methylophaga)是严格的好氧甲基营养细菌, 通常从海洋环境中分离得到, 能够参与海洋环境中的一碳代谢, 例如, 利用甲烷和其他一碳化合物(如甲醇)进行生长, 在缓解全球变暖和碳循环中具有重要作用[21]。最近报道从深海冷泉区首次分离到“Candidatus Izimaplasma”属的纯培养物, 发现有机物、亚硫酸氢盐或细菌DNA能够显著促进其生长, 被认为是深海生物地球化学循环的重要贡献者[22]。秋季显著富集的属中, 甲基海洋杆菌(Methyloceanibacter)是一种在湿地和海洋沉积物中发现的甲烷氧化细菌, 它对湿地系统中的甲烷产生具有重要影响[23]。线状微菌(Filomicrobium)的成员是分离自污染的盐田和海洋环境, 有的线状微菌具有降解甲烷磺酸盐(MSA)的功能[24]。
3.3 夏秋季黄河口潮间带沉积物微生物对环境因子的响应存在差异黄河口潮间带沉积物主要以砂质粉砂为主, 总体上沉积物呈弱碱性。沉积物的容重、含水率和有机碳在夏秋季变化不大。秋季沉积物中的TN明显高于夏季, 而夏季石油类和硫化物含量高于秋季。沉积物中的环境因子会对微生物群落结构产生很大影响。王凯等[6]发现, 总氮、总磷、有机碳和叶绿素是影响黄河口潮滩春季微生物群落结构的主要因素, 而细菌群落多样性与颗粒粒径、总磷和有机碳表现出较好相关性。尹霞等[7]发现黄河口潮间带盐度、亚硝酸盐、铵盐以及磷酸盐与细菌群落多样性指数和丰富度指数表现出不同程度的相关性。我们发现夏秋季的微生物丰度均与环境因子存在较强的相关性, 且不同季节的微生物受不同的环境因子影响, 表现出不同的丰度变化。在两个季节中, pH与TN、Cr、Cu、Zn等因素呈正相关, TN却与这些因素呈负相关。绿弯菌门(Chloroflexi)和疣微菌门(Verrucomicrobiota)在夏季仅与TP有较强相关性, 但是在秋季, 包括Hg、Pb、Cd、pH在内的多种因子都是影响这两个微生物门类丰度的关键环境因素。Rao等[25]在对热泉的研究中已经发现绿弯菌门存在对二氧化碳固定和硫代谢的相关基因, 而我们的研究揭示绿弯菌门对磷也可能存在相关代谢机制。分布广泛的疣微菌门(Verrucomicrobiota)不管在富营养还是寡营养环境下都可以利用环境中的物质进行代谢获得能量, 是一类生态友好的微生物[26]。本研究中, 秋季疣微菌门对金属因子的响应揭示它可能有更多对环境变化的适应机制。硫酸盐还原菌门(Desulfobacterota)和厚壁菌门(Firmicutes)在夏季对环境因子响应均不强, 但在秋季表现出与多个环境因素较强相关性(P<0.01)。同时, 颗粒直径也是夏秋季影响微生物丰度的重要因素。我们推测微生物对季节变化的响应是复杂的, TN和pH等随着季节变化影响沉积物中其他理化因子, 并进一步影响微生物的丰度。
3.4 夏秋季黄河口潮间带沉积物微生物的生态功能预测比较潮间带生态系统的微生物在氮、磷等营养物质的循环中发挥着不可替代的作用, 此外潮间带往往容易受到人类活动的污染, 微生物可以降解多种污染物和参与重金属迁移。尹霞等[7]发现黄河口潮间带微生物功能丰富, 其中膜运输、碳水化合物代谢、氨基酸代谢功能最为活跃。本研究发现, 沉积物微生物与氮循环相关的硝化作用、好氧氨氧化作用和硝酸还原等功能, 两个季节相差不大。沉积物微生物与硫循环相关的硫化合物的呼吸作用和硫酸盐呼吸(sulfate respiration)等功能, 在两个季节都相对稳定。两个季节微生物生态功能的不同之处, 主要是秋季自养代谢活动较为强烈, 而在夏季, 微生物更倾向于进行分解代谢。
4 结论我们通过对东营黄河口潮间带夏秋季96个表层沉积物样本的16S rRNA扩增子研究发现, 黄河口潮间带沉积物主要的微生物类群为变形菌门、拟杆菌门和脱硫菌门, 夏秋季微生物的α和β多样性存在显著差异, 且秋季物种丰富度和均匀度均高于夏季, 表明季节变化在一定程度上驱动了微生物群落结构的变化。不同季节条件下, 相同门类微生物的丰度受不同环境因子的影响, 相同环境因子在不同季节也和不同微生物存在相关性, 表明季节变化是影响潮间带表层沉积物微生物多样性变化的重要因素, 且存在较为复杂的影响机制。根据功能预测分析, 我们推测氮、硫循环可能在夏秋季潮间带沉积物微生物的代谢过程中占据重要地位; 夏秋季的微生物群落在功能代谢上存在差异显著, 具体表现为秋季微生物更倾向于进行自养代谢, 而夏季微生物中异养分解代谢占主导地位。
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