2025, Vol. 49
文章信息
- 王淑瑞, 郇丽, 顾文辉, 王旭雷, 牛建峰, 王广策. 2025.
- WANG Shurui, HUAN Li, GU Wenhui, WANG Xulei, NIU Jianfeng, WANG Guangce. 2025.
- 基于CRISPR/Cas12a基因转化的条斑紫菜基因编辑底盘藻株构建
- Construction of a Pyropia yezoensis strain as a gene-editing chassis using CRISPR/Cas12a
- 海洋科学, 49(5): 34-46
- Marine Sciences, 49(5): 34-46.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250213001
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文章历史
- 收稿日期：2025-02-13
- 修回日期：2025-03-20
2. 青岛海洋科技中心海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 水产品种创制与高效养殖重点实验室(中国科学院), 山东 青岛 266404;
4. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China;
3. Key Laboratory of Breeding Biotechnology and Sustainable Aquaculture(CAS), Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266404, China;
4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
基因编辑技术能够对生物体内的目标基因进行精确的遗传修饰, 从而改变基因的结构和功能。早期的锌指核酸内切酶(ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)等方法存在着脱靶效应以及组装过程复杂等缺陷, 这在一定程度上限制了它们在基因编辑领域的广泛应用[1]。而规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas)基因编辑系统, 为基因编辑领域带来了重大变革。该系统依据RNA与DNA之间的碱基互补配对原则, 精准地将Cas蛋白引导至目标序列执行切割功能[2]。凭借操作简便、编辑效率高以及特异性优良等诸多优势, CRISPR/Cas系统发展成为了新一代基因编辑技术的代表, 极大地拓宽了基因编辑技术的应用和发展空间。
CRISPR/Cas系统可以依据Cas效应蛋白的构成差异划分为两类, 第一类是由多蛋白复合物构成, 而第二类则是由单一的Cas蛋白构成[3], 因而相较于第一类, 第二类系统在基因组编辑以及基因筛选领域展现出更为巨大的潜力, 例如Ⅱ型的Cas9、Ⅴ型的Cas12a、Ⅵ型的Cas13a以及Cas13b系统[4]。2015年, Ⅴ型Cas12a被证实具备核酸内切酶活性, 与其他类型的CRISPR系统相比, CRISPR/Cas12a的crRNA长度更短, 其二级结构也更简洁, 从而能更为便捷经济地获得crRNA[5]。CRISPR/Cas12a系统的向导RNA(sgRNA)仅具有crRNA结构, 通过单RNA引导Cas12a蛋白就能实现对目标DNA的精准识别, 而CRISPR/Cas9系统的sgRNA则由crRNA和tracrRNA共同组成。此外, Cas12a核酸酶能够自主加工pre-crRNA, 无需依赖核糖核酸酶Ⅲ, 这可以弥补一些物种中核糖核酸酶Ⅲ活性不足的问题, 进而提升DNA的切割效率[6]。而且, Cas12a切割DNA链后会形成5’端突出的黏性末端, 有利于促进同源重组修复(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)进行精准的基因替换; 而Cas9切割产生的平末端缺口基因替换效率相对较低[7]。CRISPR/Cas12a弥补了CRISPR/Cas9系统在上述方面的不足之处, 为基因编辑技术提供了更多的选择方案。
条斑紫菜(Pyropia yezoensis)隶属于红藻门(Rhodophyta)、红毛菜纲(Bangiophyceae)、红毛菜目(Bangiales)、红毛菜科(Bangiaceae)、紫菜属(Pyropia), 常栖息在沿海潮间带区域[8]。中国作为全球最大的紫菜生产国, 紫菜年总产值达50亿元。其中条斑紫菜广泛栽培于江苏、山东沿海地区, 是最具经济价值的大型栽培海藻之一[9]。在海洋生态修复方面, 条斑紫菜也发挥着关键作用, 它能够吸收海水中的氮、磷等营养元素, 从而降低海水富营养化程度; 它还具备强大的固碳功能, 在创造经济效益的同时, 有助于修复海域环境和增加海洋碳汇[10]。但近年来条斑紫菜栽培规模的持续扩大, 引发了局部栽培密度过高的问题, 进而影响了条斑紫菜的产量[11]。同时, 全球气候变暖使得栽培海区的温度不断上升, 干扰了紫菜的正常生长代谢过程, 使其更容易遭受病害侵袭, 甚至出现大规模的病烂现象[12]。环境条件的不稳定, 也导致紫菜品质和单位面积产量呈现逐年下滑的趋势, 这对紫菜的种质品系提出了新的挑战。然而, 传统的育种技术存在培育周期长、育种效率低、优良性状单一等局限性, 严重阻碍了藻类产业的可持续发展。因此, 探索一种高效、精准的基因编辑技术, 建立一种更加经济环保的育种模式, 成为解决上述问题的关键策略, 而CRISPR/Cas12a系统的优越性, 为条斑紫菜的遗传改良育种提供了重要的支持。
目前判断外源基因是否成功转入受体细胞最常用的方法是抗生素筛选, 这就要求在构建重组载体的过程中, 插入抗生素抗性基因(ARGs)。在大型海藻基因编辑领域, 潮霉素抗性基因是一种常用的筛选标记基因。HE等[13]和SHIN等[14]均利用了依据条斑紫菜密码子偏好性优化的潮霉素抗性基因PyAph7, 成功筛选出了具有潮霉素抗性的转基因阳性藻株; ELÉOUËT等[15]也在龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)外源基因转化实验中利用潮霉素抗性基因筛选获得阳性藻株。
本研究根据条斑紫菜的密码子偏好性优化Cas12a基因, 并在潮霉素抗性标记基因PyAph7前进行序列改造, 探究优化后的Cas12a蛋白表达及对潮霉素抗性基因的编辑活性, 从而构建可用于研究条斑紫菜功能基因编辑的底盘藻株, 以期为CRISPR/Cas12a系统在条斑紫菜基因编辑中的相关研究提供基础。
1 材料与方法 1.1 材料本实验所用藻种来源于日照养殖区的条斑紫菜叶状体发育所得纯系配子体, 定义为野生型(WT)。培养温度(15±1)℃, 光照由LED灯或荧光灯提供, 光强50 μmol·m–2·s–1, 光周期为14 h光: 10 h暗。培养体系使用高温灭菌后的天然海水(盐度30), 添加营养盐(NaNO3 42.49 mg/L、KH2PO4 6 mg/L、KI 0.38 mg/L、柠檬酸铁0.26 mg/L、维生素B1 0.25 mg/L、维生素B12 0.25 mg/L), 同时添加4 mg/L二氧化锗预防硅藻污染, 每7天更换一次。
pMAL-MBP-His质粒由中国科学院水生生物研究所韩丹翔研究员馈赠, pEA7-PyAmCFP质粒由北海道大学Uji Toshiki教授馈赠。
1.2 方法 1.2.1 Cas12a密码子优化依据条斑紫菜密码子偏好性优化Cas12a基因序列, 同时在其序列前后设计添加核苷酸片段“CCCAAGAAGAAGCGCAAGGTG”与“AAGCGCCCCGCGGCGACCAAGAAGGCCGGCCAAGCGAAGAAGAAGAAG”, 使之在最终翻译所得的氨基酸序列前后添加核定位信号“PKKKRKV”与“KRPAATKKAGQAKKKK”, 交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行优化合成, 利用其GeneOption平台的GeneTuner自动序列分析及密码子优化软件完成密码子适配。
1.2.2 基因转化质粒改造因潮霉素抗性基因不含利用Cas12a的潜在切割位点, 因此利用Guide design resources-Zhang Lab软件(https://zlab.squarespace.com/guide-design-resources)在潮霉素抗性标记基因PyAph7转录起始位点前设计原型间隔序列毗邻基序(PAM)和相应的单导向RNA (sgRNA)序列, 选取预测切割效率高、脱靶率低的PAM序列。以pEA7-PyAmCFP质粒为模板, 利用引物Aph7-F/Aph7-R(表 1)进行PCR反应, 将PAM序列添加至PyAph7转录起始位点前。PCR反应所用酶为2×Es Taq MasterMix(Dye)(Cwbio, 中国), 反应程序为: 95℃变性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸20 s、30个循环, 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物, Gel Extraction Kit(Omega Bio-Tek, 美国)回收目标DNA片段。
| 引物名称 | 引物序列(5'→3') |
| Aph7-F | GCCCACTCTCTCGCCACCTTC |
| Aph7-R | CTGCGTCATACGAAATCTAGACTTGC |
| IN-Aph7-F | TTTCGTATGACGCAGGAGTCCCTGCT |
| IN-Aph7-R | AAGGTGGCGAGAGAGTGGGCA |
| 1025F | CCAATACGCAAACCGCCTCT |
| 1025R | GCCAGGTCCACGAAGATGTT |
| cas12-MAL-F | AAAAGAGAAAAGTAATGTCTAAGCTGGAGAAGTTCAC |
| cas12-MAL-R | TTCGTTTTATTTGAAGCTCACTTCTTCTTCTTCGC |
| IN-MAL-F | GCTTCAAATAAAACGAAAGGCTC |
| IN-MAL-R | CATTACTTTTCTCTTTTTCTTTGGAGGT |
| cas12-BL21F | CCTGTACTTCCAGGGCGAAT |
| cas12-BL21R | TTCACCGACAAACAACAGATAAAAC |
| cas12-sgRNA-F | GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAATTTCTACTAAGTGTAGATGTATGACGCAGGAGTCCCTGCTG |
| cas12-sgRNA-R | CAGCAGGGACTCCTGCGTCATACATCTACACTTAGTAGAAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC |
| 1223F | GCTGATACCGCTCGCCGC |
| 1223R | CGCTTCAAATACGCCCAG |
| cas12-F | GCGTCACCTTCGCCACCCCATGGCGCCCAAGAAGAAGCG |
| cas12-R | ACGATCGGGGAAATTCGAGCTCTCACTTCTTCTTCTTCGCT |
| IN-pEA7-F | GAGCTCGAATTTCCCCGATCGT |
| IN-pEA7-R | GGGGTGGCGAAGGTGAC |
| C12-F | GCACCGATTGCTTCTCTCTT |
| V3R | CTGAGAGTGCACCATAAATTCCC |
| Cas12DNA-F1 | ACCGATTGCTTCTCTCTTCCG |
| Cas12DNA-R1 | CGGATTTGCCCGTGGTTG |
| Cas12DNA-F2 | CGGGCAAATCCGCCTGAG |
| Cas12DNA-R2 | ATCATCGCAAGACCGGCAA |
| qCas12-F | CGACCTCCATTGCCTTTC |
| qCas12-R | CCCGACTCCGTCACAAAC |
| qEF1a-F | TTTTGGTGGCACTGCTGAT |
| qEF1a-R | TACACGCACAAGTTGGGGA |
采用引物IN-Aph7-F/IN-Aph7-R(表 1)线性化pEA7-PyAmCFP质粒载体。使用高保真酶KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-(Toyobo, 日本), 98 ℃变性10 s、58 ℃退火5 s、68 ℃延伸100 s、30个循环, PCR产物经凝胶电泳后回收线性化质粒片段。
利用In-Fusion无缝克隆技术, 将改造后的包含潮霉素抗性基因的片段连接到pEA7-PyAmCFP质粒载体。反应条件为50 ℃、25 min, 反应体系为2×Basic Assembly Mix(TransGen Biotech, 中国)1.5 μL、线性化质粒载体0.3 μL、目标DNA片段1.2 μL。将In-Fusion产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中, 使用引物1025F/1025R(表 1)进行菌落PCR验证与Sanger测序分析, 测序正确的菌株用于后续PyCas12a基因转化载体质粒的构建。
1.2.3 PyCas12a原核表达载体的构建PCR反应以Cas12a密码子优化后的pUC57Amp-PyCas12a质粒为模板, 使用KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-(Toyobo, 日本)高保真酶, 引物cas12-MAL-F/cas12-MAL-R(表 1), 变性98 ℃ 10 s、退火60 ℃ 5 s、延伸68 ℃ 30 s、30个循环。电泳分离后胶回收PyCas12a基因片段。
采用引物IN-MAL-F/IN-MAL-R(表 1)线性化pMAL-MBP-His质粒载体, PCR程序除延伸时间为60 s以外, 其余同上, 琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物, 胶回收得到线性化质粒片段。
利用In-Fusion无缝克隆技术, 将PyCas12a基因插入至pMAL-MBP-His载体, 反应条件与体系见1.2.2, In-Fusion产物转化至BL21大肠杆菌感受态细胞中。选用引物cas12-BL21F/cas12-BL21R(表 1)进行PCR检测与测序分析, 测序正确的阳性菌株用于后续PyCas12a原核表达实验。
1.2.4 PyCas12a原核表达与细胞外活性验证将1 mL过夜培养的PyCas12a原核表达菌液接种到100 mL LB液体培养基(含氨苄青霉素100 μg/mL), 37 ℃、160 r/min培养约5 h, 至OD600达到0.6~0.8, 向菌液中加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷16℃、160 r/min诱导表达16 h。5 000 ×g离心10 min收集菌体, 置冰上, 按每克菌体湿质量加5 mL裂解缓冲液(50 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸5 mmol/L Mg2+, 1 mmol/L NaCl, 10 mmol/L咪唑, 10%甘油, 2 mmol/L ꞵ-巯基乙醇, pH=7.5)的比例重悬大肠杆菌细胞。每毫升细胞悬液加入4 μL蛋白酶抑制剂(Bestbio, 中国), 冰浴、超声破碎至细胞悬液澄清。4 ℃、10 000 ×g离心20 min去除细胞碎片, 0.22 μm滤膜过滤获得蛋白提取液。
以5倍柱体积的裂解缓冲液平衡HisSep Ni-NTA柱, 按0.5 mL/min流速将蛋白上清样品上柱, 10倍柱体积的裂解缓冲液清洗未结合的杂蛋白, 后加入5倍柱体积的洗脱缓冲液(50 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸, 5 mmol/L Mg2+, 1 mmol/L NaCl, 250 mmol/L咪唑, 10%甘油, pH=7.5), 以0.5 mL/min流速进行洗脱。收集洗脱液中段部分, 利用30 kDa超滤管, 于4 ℃、3 000 ×g离心30 min浓缩, 分装保存于–80 ℃超低温冰箱。
利用Guide design resources-Zhang Lab软件(https://zlab.squarespace.com/guide-design-resources), 设计靶向敲除序列改造后PyAph7基因的sgRNA序列。人工合成DNA单链cas12-sgRNA-F与cas12-sgRNA-R (表 1), 退火反应后获得sgRNA的双链DNA产物, 反应程序为: 95 ℃ 10 min, 95 ℃至16 ℃降温15 min (Ramp 0.1℃/sec)。利用T7 High Yield RNA Transcription Kit(Vazyme, 中国)试剂盒体外转录获得sgRNA, 采用氯化锂法[16]纯化sgRNA产物。
以潮霉素基因改造后的CGT-pEA7-PyAmCFP质粒为模板, 利用引物1223F/1223R(表 1)合成目标DNA, 聚合酶为2×Es Taq MasterMix(Dye)(Cwbio, 中国), PCR程序为: 95 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s、30个循环。PCR产物经凝胶电泳回收。将6 μL纯化的cas12a蛋白与6 μL纯化的sgRNA混合, 在37 ℃孵育15 min使形成核糖核蛋白复合物, 再加入2 μL Cas Reaction Buffer(GenScript, 美国)、1 μL目标DNA以及ddH2O至总体积为20 μL, 37 ℃孵育1 h。对照组将cas12a蛋白与sgRNA形成的RNP替换为ddH2O。琼脂糖凝胶电泳分析比较对照组与实验组目的DNA片段位置与大小。
1.2.5 PyCas12a基因转化载体构建PCR反应以Cas12a密码子优化后的pUC57Amp-PyCas12a质粒为模板, 使用引物cas12-F/cas12-R(表 1), PCR反应程序同1.2.3节, 凝胶电泳分离PCR产物后回收PyCas12a DNA片段。采用引物IN-pEA7-F/IN-pEA7-R (表 1)线性化潮霉素抗性基因改造后的CGT-pEA7-PyAmCFP质粒载体。PCR程序除延伸时间为70 s以外, 其余同1.2.3节, PCR产物经凝胶电泳后回收线性化质粒片段。
利用In-Fusion无缝克隆技术, 将PyCas12a基因连接到PyAph7序列改造后的CGT-pEA7-PyAmCFP质粒载体, 反应条件与体系见1.2.2节, 反应产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞, 选用引物C12-F/V3R (表 1)进行菌落PCR验证, 测序正确的菌株用于后续条斑紫菜的外源基因转化。
1.2.6 基因枪轰击取30 mL氨苄青霉素浓度为100 μg/mL的LB液体培养基置于50 mL离心管, 加入上述含PyCas12a基因的载体质粒的大肠杆菌菌液20 μL, 37 ℃、160 r/min过夜培养14 h。利用Plasmid Mini Kit Ⅱ(Omega Bio-Tek, 美国)试剂盒提取质粒, NanoPhotometer-NP80测定浓度。
收集生长状态良好、长度约为0.5 cm的条斑紫菜野生型(WT)配子体, 均匀平铺在Whatman GF/F玻璃纤维滤纸(Cytiva, 美国)上, 并用镊子将其转移到LB固体培养基中央。微弹制备及基因枪转化方法参照CAO等[17]。取30 mg直径0.6 μm的金粉悬浮于1 mL 70%乙醇中, 25 ℃静置15 min, 离心, 用ddH2O清洗3次, 再将金粉悬浮在500 μL 50%无菌甘油溶液中, 取50 μL金粉溶液边涡旋边依次加入5 μg PyCas12a质粒、50 μL 2.5 mol/L CaCl2、20 μL 0.1 mol/L亚精胺。涡旋2 min后10 000 ×g离心2 s, 去上清。所得金粉用140 μL 70%乙醇洗涤, 再用48 μL无水乙醇重悬备用。取15 μL微弹涡旋混匀, 平铺于载体膜中央, 风干后尽快组装与轰击, 每个质粒轰击3次。轰击后的条斑紫菜配子体叶片转移至无菌海水中, 15 ℃避光培养48 h后, 恢复正常培养至条斑紫菜释放单孢子。
1.2.7 单藻株筛选与验证待基因枪轰击的条斑紫菜释放单孢子后, 加入1 g/L潮霉素B进行6~8周的阳性藻株筛选。抗性筛选结束后, 利用倒置显微镜分离存活的条斑紫菜单孢子, 转移至不含潮霉素B的海水培养基中进行单株培养约4周。收集单培养藻株发育所得配子体幼苗, 采用HP Plant DNA Kit(Omega Bio-Tek, 美国)试剂盒提取基因组DNA, 进行基因组PCR(gPCR)检测。首先利用引物IN-Aph7-F/1223R(表 1)对潮霉素抗性基因进行PCR检测, PCR反应程序同1.2.4节。对于潮霉素抗性基因验证阳性的子代藻株, 再分别用引物Cas12DNA-F1/Cas12DNA-R1与Cas12DNA-F2/Cas12DNA-R2(表 1)对PyCas12a靶基因进行分段验证, 验证的序列区间中需包含启动子、PyCas12a靶基因和终止子, PCR反应程序同1.2.3节。琼脂糖凝胶电泳分离gPCR产物, 测序验证的阳性藻株被重置于潮霉素筛选环境继续培养。
使用TRIcom Reagent(Genstone Biotech, 中国)提取各阳性藻株的总RNA, NanoPhotometer-NP80测定其浓度和纯度, 按照SPARKscript Ⅱ All-in-one RT SuperMix for qPCR(SparkJade, 中国)说明书合成cDNA。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术, 测定上述阳性藻株中PyCas12a的靶基因表达水平。本实验选用转录延伸因子基因(elongation factor 1 alpha, EF1A)作为内参基因, 通过Primer Premier 5.0软件(Premier Biosoft, 加拿大)设计引物qCas12-F/qCas12-R与qEF1a-F/qEF1a-R(表 1)。反应体系为2×SYBR Green qPCR Mix (SparkJade, 中国) 5 μL、RNase Free H2O 1.5 μL、正向引物与反向引物各0.5 μL、样本cDNA (RNase Free H2O稀释5倍)2.5 μL, 反应条件: 95 ℃变性10 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸25 s、40个循环。每个样本重复测定3次, 选择样本中目标基因与内参基因ΔCt值最高的样本作为基因表达水平比较的基准, 通过2–ΔΔCt法计算其他样本的PyCas12基因相对表达值, 并进行差异显著性分析(P<0.05, 单因素方差分析)。
1.2.8 引物信息本研究使用引物见表 1。
2 结果 2.1 PyCas12a密码子优化依据条斑紫菜密码子偏好性优化后的PyCas12基因序列如图 1所示。
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| 图 1 PyCas12基因核苷酸与氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide sequence of PyCas12 and the encoded amino acid sequence |
根据图 2电泳结果所示, 第2泳道的1 152 bp处有明亮且符合预期的条带, Sanger测序验证证明已将改造后的含PyAph7基因序列的目的片段(图 3)插入pEA7-PyAmCFP质粒载体, 成功构建具有潮霉素抗性基因Cas12a的PAM位点的基因转化质粒CGT-pEA7-PyAmCFP。
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| 图 2 基因转化质粒鉴定 Fig. 2 Identification of transgenic plasmid 第1泳道为空白对照; 第2泳道是以含有PyAph7基因转化质粒的大肠杆菌菌液为模板的PCR产物; M. DL2000 DNA Marker (Uelandy, 中国) |
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| 图 3 基因转化质粒PyCas12a的原型间隔序列毗邻基序测序结果 Fig. 3 Protospacer adjacent motif sequencing in PyCas12a transformation plasmid |
根据图 4电泳结果所示, 第1泳道的3 859 bp处有明亮且符合预期的条带。Sanger测序验证证明已将PyCas12a基因插入pMAL-MBP-His质粒载体, 成功构建PyCas12a重组原核表达质粒pMAL-PyCas12a。
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| 图 4 PyCas12a原核表达质粒鉴定 Fig. 4 Identification of the PyCas12a prokaryotic expression plasmid M. DL5000 DNA Marker(Uelandy, 中国); 第1泳道是以含有PyCas12a原核表达质粒的大肠杆菌菌液为模板的PCR产物; 第2泳道为空白对照 |
如图 5琼脂糖凝胶电泳结果所示, 待切割目标DNA片段与Cas12a蛋白和sgRNA的RNP复合物在37 ℃共同孵育1 h后, 第1泳道中不添加RNP复合物的对照组待切割目标DNA片段无变化, 第2泳道中添加RNP复合物的反应产物中出现切割条带, 经Sanger测序验证, 目标DNA片段在PAM位点下游发生断裂, 证明Cas12a蛋白与sgRNA能够对目标质粒进行有效切割。
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| 图 5 Cas12a蛋白细胞外切割活性实验 Fig. 5 Extracellular cleavage activity of the Cas12a protein M. DL2000 DNA Marker(Uelandy, 中国); 第2泳道为不添加Cas12a蛋白与sgRNA的RNP复合物的对照组; 第3泳道为添加Cas12a蛋白与sgRNA的RNP复合物的实验组 |
琼脂糖凝胶电泳结果显示(图 6), 第1、3、4泳道在4 189 bp处有明显条带, 经Sanger测序验证, 证明已将PyCas12a基因序列插入CGT-pEA7-PyAmCFP质粒载体, 成功构建PyCas12a基因枪转化载体质粒CGT-pEA7-PyCas12a。
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| 图 6 PyCas12a基因转化载体质粒鉴定 Fig. 6 Identification of the PyCas12a transgenic plasmid M. DL5000 DNA Marker(Uelandy, 中国); 第1~5泳道是以氨苄青霉素抗性阳性单菌落为模板的PCR产物; 第6泳道为空白对照 |
利用基因枪法将PyCas12a转化载体质粒导入条斑紫菜配子体幼苗, 完成转基因操作的条斑紫菜幼苗在无菌海水中恢复培养至释放单胞子, 之后向无菌海水培养基中加入质量浓度为1 g/L的潮霉素B, 继续筛选6~8周, 直到大部分条斑紫菜叶片颜色变白并逐渐死亡。在倒置显微镜下挑选经过潮霉素B筛选后仍存活的条斑紫菜单株配子体转移至不含潮霉素B的无菌海水培养基中持续培养, 直至其释放单孢子并发育为配子体幼苗。
2.5 基因转化藻株验证利用PCR验证潮霉素抗性基因, 如图 7琼脂糖凝胶电泳结果所示, 野生型所在的第1泳道无条带, 经过潮霉素B筛选后存活的子代藻株基因组PCR产物所在的第3、8、9、11、16、18、19、22、24泳道, 在1 248 bp处出现明亮且符合预期的条带。
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| 图 7 潮霉素抗性基因阳性株DNA水平验证 Fig. 7 DNA-based verification of the hygromycin-resistant algal strains M. DL2000 DNA Marker(Uelandy, 中国); 第1泳道为空白对照; 第2~24泳道是以潮霉素抗性基因阳性株DNA为模板的PCR产物 |
再对上述筛选出的子代藻株进行PCR, 验证PyCas12a基因。如图 8所示, 野生型所在的第1泳道均无条带, 图 8a在第2、7、9、10泳道的2 370 bp处有明亮且与预期一致的条带, 图 8b在相同泳道的1 618 bp处有明亮且与预期一致的条带。Sanger测序证明已成功获得PyCas12a转基因条斑紫菜藻株。
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| 图 8 PyCas12a基因转化藻株DNA水平验证 Fig. 8 DNA-based verification of the PyCas12a positive transgenic algal strains a. PyCas12a基因转化阳性株DNA水平验证片段一: M. DL5000 DNA Marker(Uelandy, 中国); 第1泳道为空白对照; 第2~10泳道是以PyCas12a转基因阳性株DNA为模板的PCR产物; b. PyCas12a基因转化阳性株DNA水平验证片段二: M. DL2000 DNA Marker(Uelandy, 中国); 第1泳道为空白对照; 第2~10泳道是以PyCas12a转基因阳性株DNA为模板的PCR产物 |
经DNA验证, 共获得了4株PyCas12a基因转化阳性藻株, 将其分别编号为C12-1至C12-4, 采用实时荧光定量PCR技术检测PyCas12a基因表达水平, 各样本基因表达量以3个生物学重复的平均值表示, 结果如图 9所示。与野生型条斑紫菜株相比, PyCas12a转基因阳性条斑紫菜株C12-2、C12-3、C12-4均有PyCas12a基因表达, 其中C12-4相对表达量最低, 用作目标基因表达的基准, C12-3相对于另外两株的PyCas12a基因表达水平更高, 约为C12-2的1.355倍和C12-4的3.748倍, 将以此基因转化藻株用于后续研究。
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| 图 9 野生型和基因转化藻株的PyCas12a基因相对表达水平 Fig. 9 Relative expression levels of PyCas12a gene in wild type and transgenic algae strains WT. 野生型条斑紫菜株; C12. PyCas12a转基因阳性条斑紫菜株; *. 差异显著(P<0.05), **. 差异极显著(P<0.01) |
为加速条斑紫菜良种化进程, 推动大型海藻栽培产业的可持续发展, 亟需探索稳定高效的靶向分子育种技术。CRISPR/Cas12a系统作为一种精准的基因编辑技术已经在高等植物、海洋微藻领域取得了显著的应用成果, 但在大型海藻基因编辑领域还存在许多未能解决的问题。首先由于Cas基因较大, 再加上携带的sgRNA等表达元件共同构成载体质粒, 使得利用基因枪转化条斑紫菜幼苗的难度较大。同时要从大量的转化个体中筛选出具有特定基因编辑效果的藻株, 此过程也非常繁琐和困难, 例如本实验在构建底盘藻株的过程中, 该批次挑选的23株转化藻株仅有3株通过RNA转录水平验证为阳性, 且在此之前已进行多次筛选均未能达到预期要求。这一方面可能是由于PyCas12a基因在条斑紫菜细胞中整合不稳定, 导致在基因转化的过程中发生丢失[18]。另一方面即使在DNA水平上获得阳性转化藻株, 也可能因为其整合到基因组的转录不活跃区或异染色质区, 导致在RNA水平无法检测到基因表达; 或是由于外源基因的插入破坏了宿主基因组的甲基化平衡, 诱导细胞启动防御系统使外源PyCas12a基因易发生甲基化, 从而阻碍了转录的顺利进行[19]。若每次基因编辑都需要重复进行这一操作流程, 不仅增加了培育时间和成本, 而且繁琐步骤中的不可控性也使得实验常常难以得到满意的结果。
但如果通过构建PyCas12a转基因载体并将其导入条斑紫菜细胞, 提前筛选获得Cas12a蛋白能够稳定表达的底盘藻株, 后续仅需导入目标基因sgRNA, 极大地简化了基因功能研究过程, 易于获得理想结果。在条斑紫菜的育种应用实践中, 通过建立细菌介导的无痕转化技术, 构建基于附加体(episome)的包含目标基因sgRNA与潮霉素抗性基因sgRNA的表达载体, 将其导入CRISPR/Cas12a底盘藻株, 可同时敲除目标基因与潮霉素抗性基因。附加体是一种游离的载体, 与整合型质粒不同, 它具有不与宿主染色体整合的特性, 其携带的基因不整合进宿主基因组[20]。利用细菌接合将基于附加体的CRISPR/Cas系统导入条斑紫菜藻株, 可以使基因编辑载体以非转基因的方式进入细胞, 避免了在基因编辑过程中外源DNA序列随机插入宿主基因组中对其他基因和宿主细胞造成的危害[21]。
3.2 底盘藻株潮霉素抗性基因PyAph7敲除的可行性潮霉素B磷酸转移酶基因Aph7’’来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus), 是一种常用的抗生素选择标记基因, 该基因编码的潮霉素磷酸转移酶通过催化潮霉素B的磷酸化反应使其失去活性, 从而使受体细胞获得潮霉素抗性。UJI等[22]根据条斑紫菜的密码子偏好性对Aph7’’基因进行优化, 获得能在条斑紫菜细胞中稳定表达和发挥作用的潮霉素抗性标记基因PyAph7, 并将其用作大型海藻遗传转化的选择标记。然而, 抗生素抗性基因所编码的蛋白在转基因生物体内残留, 潜移默化地威胁着人体健康和生态环境, 是影响转基因生物安全性的重要原因[23]。此外, 抗生素抗性标记基因的存在并不符合中国关于转基因生物安全管理的相关规定, 其持久性和难以消除的特性, 也在一定程度上限制了转基因生物在商业化应用方面的前景, 因而能否去除转基因生物中的抗生素抗性基因显得尤为重要。
CRISPR/Cas12a系统识别5’-TTTV-3’ PAM位点并在下游互补链和非互补链的第23位和18位核苷酸处切割产生黏性末端[5], 鉴于PyAph7基因序列中没有可供CRISPR/Cas12a系统识别的PAM位点, 故而本文结合Guide design resources-Zhang Lab软件给出的评分结果, 在PyAph7基因的转录起始区前插入Cas12a的PAM位点序列, 在保证插入的碱基数是三的倍数的前提下, 该碱基序列的插入既不会影响PyAph7基因的潮霉素抗性功能, 又能在其发挥作用后借助CRISPR/Cas12a系统终止它的转录过程, 从而达到敲除潮霉素抗性标记基因的目的, 获得不具有潮霉素抗性的转基因条斑紫菜株。本文通过引入Cas12a的PAM序列的方法, 构建了基因转化质粒, 经后续的基因枪转化与筛选过程, 也验证了改造后的质粒仍可以发挥潮霉素抗性标记的筛选功能。
3.3 获得PyCas12a稳定表达的条斑紫菜底盘藻株意义与微藻、水稻、拟南芥等物种相比, CRISPR/Cas基因编辑系统在条斑紫菜中的研究进展较为缓慢, 这可能是由于该系统在细胞内发挥功能时会影响宿主基因组的稳定性, 从而激活条斑紫菜细胞内存在的纠错修复系统, 自行修复受损的遗传物质, 导致CRISPR/Cas系统的基因编辑效果不能达到预期要求[24]。同时如果外源基因的表达过于强烈, 可能会引发共抑制现象, 即外源基因和内源基因的表达同时受到抑制, 这也会抑制Cas蛋白的翻译, 无法产生足够的功能性蛋白来执行剪切功能[25]。此外, 利用基因枪法转化目标基因的插入位点具有随机性, 进一步增加了实验结果的不确定性。为获得PyCas12a基因稳定表达的条斑紫菜底盘藻株, 提高基因编辑的成功率, 在本文实验过程中进行了多次基因枪转化与阳性藻株的筛选工作, 并借助实时荧光定量PCR等技术, 对获得的阳性藻株进行PyCas12a基因的表达量分析, 选取转录水平适中的条斑紫菜藻株进行后续研究。
3.4 影响外源基因表达效率的潜在因素通过将外源基因转入受体细胞中稳定表达, 使其获得新的性状或增强优良性状从而培育新品系, 是基因工程研究的主要目的, 但在转基因过程中外源基因的表达效率受到多种因素的影响。诱发外源基因表达沉默的原因主要可以分为3个层面, 一是在染色体水平上, 外源基因在转入宿主细胞后未能成功整合到宿主基因组中, 或是整合到了转录活性低、甲基化程度高的异染色质区域, 都会导致外源基因不能成功表达[26]。二是转录水平的基因沉默(TGS), DNA甲基化是影响外源基因正常表达的重要原因, 常发生在外源基因启动子区CpG岛的胞嘧啶上, 通过对该区域碱基的甲基化阻碍了转录因子与外源基因启动子的结合, 抑制转录的启动[27]。此外, 外源基因在整合到宿主细胞基因组上时易产生多拷贝重复序列, 重复序列之间的异位配对使得该整合位点区域发生异染色质化, 紧密的结构限制了转录因子与外源基因的结合, 从而导致了外源基因的表达沉默[28]。三是转录后水平的基因沉默(PTGS), 外源基因虽然能够转录产生mRNA, 但并不能正常翻译为蛋白质。共抑制是常见的转录后水平的基因沉默现象, 由于宿主细胞内存在与外源基因同源的内源基因, mRNA在细胞核中大量积累, 但当其进入细胞质后, 超出阈值的mRNA水平诱发了细胞降解机制, 致使内源与外源基因共同被抑制[29]。另外, 外源基因在整合到宿主基因组中时, 由于插入方向的不同, 在转录后会形成反义RNA, 它们与正义RNA配对形成RNA双链, 在核糖核酸酶Ⅲ的作用下产生小分子干扰RNA(siRNA), siRNA与RNA诱导沉默复合物结合, 通过碱基互补配对定位至同源mRNA, 促使mRNA降解, 从而抑制外源基因的表达[30]。
外源基因的表达沉默受到宿主细胞内多种基因表达调控机制的影响, 通过优化密码子减少与宿主基因组的碱基组成差异消除DNA甲基化、或降低外源基因序列与内源基因的同源性、选择更好的转化方法和重组载体等方式, 可以在一定程度上克服基因沉默现象, 从而提高外源基因的表达效率。
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