藻类利用色素捕获光能进行光合作用, 是海洋中重要的初级生产者, 在海洋生态系统的物质循环和能量流动中具有至关重要的作用^[1-2]。藻类中的光合色素可以分为3类: 叶绿素、类胡萝卜素和藻胆蛋白。其中, 叶绿素a (Chl a)含量是估算浮游植物生物量的重要生态学参数^[3], 而一些类胡萝卜素组分可以作为区分不同浮游植物类群的特征色素^[4], 如岩藻黄素(fucoxanthin, Fuco)可被用来指示硅藻, 多甲藻素(peridinin, Peri)用来指示甲藻等。对Chl a的定量分析通常采用荧光法, 而高效液相色谱法(high- performance liquid chromatography, HPLC)主要用于多种光合色素的定性和定量分析, 可以实现对大量样品的快速处理^[4-5]。基于对浮游植物样品中Chl a和特征色素含量的分析数据, 可以应用CHEMTAX或R phyto包等软件解析浮游植物群落组成及不同类群对浮游植物总生物量的贡献(以Chl a表示)。这些方法在一定程度上弥补了传统镜检方法花费时间长、对微微型浮游植物鉴定能力不足等缺点, 为浮游植物和有害藻华研究提供了重要途径^[6-7]。通过色素分析可以辅助鉴定有害藻华原因种, 监测有害藻华的动态变化, 有助于有害藻华的监测、预警和防控。此外, 色素分析还是研究微藻和大型藻光合生理特性的重要手段, 在水产养殖、食品、医药、化工等领域有广泛的应用潜力^[8-11]。

色素分析首先要将色素从藻细胞中提取出来, 通常采用研磨、超声、浸提等色素提取方法^[12-13]。由于许多微藻细胞具有细胞壁, 因此在色素提取过程中多采取研磨和超声处理以破坏细胞壁, 但两种方式均会产生热量, 导致色素降解, 影响实验结果; 浸提法虽然操作简单, 但存在提取时间长、效率低等弊端。对大型藻中色素的提取方法以超声和浸提法居多, 但未形成统一规范的提取方法。甲醇、乙醇、丙酮和二甲基甲酰胺(DMF)是常见的藻类色素提取溶剂, 不同提取剂对于藻类色素的提取效果有较大差别。其中, 丙酮对于Chl a等极性较低的色素提取效率较好, 而甲醇更适合于对类胡萝卜素的提取。在以往研究中, 对浮游植物生物量的估算大多采用90%丙酮溶液作为提取剂, 而对浮游植物群落的研究多采用95%甲醇作为溶剂^[14]。

综上可见, 藻类样品中色素的提取过程是影响色素分析效率和准确性的关键环节。对此, 本研究选择了藻类色素提取中经常使用的研磨和超声处理手段, 同时结合冷冻研磨仪的应用, 对5种细胞破碎色素提取方法的效果进行了对比分析。冷冻研磨仪具有样品处理高效、保存条件好、结果重现性高等优点, 在生物、医学、食品等许多领域得到了广泛应用^[15-17], 但在色素分析方面的应用还较少。为便于对比, 统一采用95%甲醇作为色素提取溶剂。用于提取色素的藻类样品选取了硅藻中的圆海链藻(Thalassiosira rotula)、甲藻中的米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、天然海水样品中的浮游植物、褐藻中的铜藻(Sargassum horneri)以及绿藻中的浒苔(Ulva prolifera)。针对多种藻类样品, 通过对比不同方法的色素提取效果, 探究更加高效、便捷的藻类色素提取方式, 为藻类生物学和浮游植物生态学研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验设计

本研究共设计了以下5种细胞破碎色素提取方式进行对比(表 1)。此外, 还设计实验对大型藻样品Chl a提取效率进行了评估。在按照表 1流程对浒苔和铜藻样品中的色素进行初次提取后, 以1 400 μL 95%甲醇水溶液再次提取沉淀中的残余色素, 并采用冷冻研磨+超声处理方法分析样品中残留的Chl a, 再次提取后大型藻残渣已接近白色, 认为其接近100%提取, 基于多次提取法采取如下公式计算色素初次提取效率:

$ {R_i} = \frac{{{S_{\text{f}}}}}{{{S_{\text{r}}} + {S_{\text{f}}}}} \times 100\% , $

(1)

其中, R_i为提取效率, S_f为初次提取Chl a色谱峰面积, S_r为二次提取色谱峰面积。

1.2 材料与试剂

实验采用内标定量法进行色素分析, 内标(internal standard, IS)为8′-阿朴-β, ψ-胡萝卜醛(trans- beta-apo-8′-carotenal), 购自Sigma公司(美国); 其他标准色素均为DHI公司(丹麦)产品, 涉及的色素: 多甲藻素(peridinin, Peri)、19′-丁酰氧基岩藻黄素(19′-butanoyloxyfucoxanthin, But-fuco)、岩藻黄素(fucoxanthin, Fuco)、新黄素(neoxanthin, Neox)、紫黄素(violaxanthin, Viol)、硅甲藻黄素(diadinoxanthin, Diad)、别黄素(alloxanthin, Allo)、玉米黄素(zeaxanthin, Zeax)、叶黄素(lutein, Lute)、叶绿素b(chlorophyll b, Chl b)、叶绿素a(chlorophyll a, Chl a)、β, Ɛ-胡萝卜素(β, Ɛ-carotene, Acar)、β, β-胡萝卜素(β, β-carotene, Bcar)、脱植基叶绿素a(chlorophyllide a, Chlide a)。

试剂: 甲醇、乙腈、丙酮(色谱纯, J. T. Baker公司), 吡啶(色谱纯, 上海麦克林生化科技有限公司), 乙酸(优级纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司)、超纯水由Milli-Q Reference超纯水系统制备(Merck, Germany)。

1.3 样品收集

圆海链藻和米氏凯伦藻在L1培养基中培养至指数期, 培养温度17 ± 1 ℃, 光照强度约40 μmol·m⁻²· s⁻¹, 光暗周期L∶D为14 h∶10 h, 取20~30 mL藻液过滤到GF/F玻璃纤维滤膜(Whatman, 直径25 mm, 孔径约0.68 μm)。于2024年9月在青岛近岸海域采集自然海水, 经200 μm筛绢过滤后, 取300 mL海水过滤到GF/F滤膜上以收集浮游植物, 滤膜用铝箔包被, 置于−80 ℃冷冻保存直至分析。

浒苔于实验室L1培养基中培养, 培养温度20 ± 1 ℃, 光照强度约50 μmol·m ⁻²·s ⁻¹, 光暗周期L∶D为14 h∶10 h, 实验前取新鲜藻体剪成1 cm左右的小段, 用吸水纸擦干。铜藻采集自黄海海域, 冷冻保存, 自然解冻后用吸水纸擦干, 取铜藻叶片剪成1 cm左右的小段。

各处理组中的样品均设置3个平行。

1.4 样品处理与上机

HPLC色素提取和分析参照Zapata等^[18]建立的方法并稍作修改。对于滤膜过滤的微藻样品, 置于2 mL研磨管中, 加入1 300 μL 95%甲醇水溶液, 同时加入内标溶液(750 μg·L⁻¹)。对于大型藻类, 用电子天平(Sartorius, Germany)称取0.02 g样品, 置于50 mL研磨管中, 加入10 mL 95%甲醇水溶液提取色素, 同时加入内标溶液(750 μg·L⁻¹)。将手动研磨或冷冻研磨后的大型藻碎片置于倒置生物显微镜(ICX41系列, 宁波舜宇仪器有限公司, 10X)下观察, 比较样品破碎效果。

各实验组提取的色素溶液以孔径0.22 μm有机相针头滤器(天津津腾科学仪器公司)过滤, 吸取800 μL滤液移至1.5 mL棕色样品瓶中, 加入160 μL超纯水, 振荡混匀后立即使用高效液相色谱仪(HPLC)进行色素分析。具体分析过程参考孔凡洲^[19]建立的方法, 采用Waters E2695高效液相色谱系统(Waters Corporation, Singapore), 配备Waters 2998二极管阵列检测器(Waters Corporation, Singapore)。通过比对色素标准品的保留时间和吸收光谱特征, 对样品中的色素进行定性确认。采用内标定量法, 根据标准色素相对于内标的响应因子和内标回收率计算色素含量。

1.5 统计分析

采用Waters公司Empower 2软件进行色素数据收集与分析。不同实验组别之间的色素含量差异通过单因素方差分析(ANOVA, analysis of variance)进行差异显著性检验, 显著性水平为P < 0.05。

2 结果 2.1 不同提取方式对微藻样品中色素分析结果的影响

以不同提取方式对2种微藻样品及自然海水样品中的色素提取分析结果如图 1所示。对圆海链藻的分析结果显示, 采取研磨方式(冷冻与手动研磨)的处理组Chl a含量显著低于其他组(P < 0.05), 而Chlide a色素含量则显著高于其他组(P < 0.05)。此外, 冷冻研磨组中Fuco色素含量也显著低于其他组(P < 0.05)。各组中Diad和Bcar色素含量也有明显差异, 冷冻研磨+超声处理组中Diad、Bcar含量显著高于其他组(P < 0.05)。

对米氏凯伦藻的提取分析结果显示, 各组中But-fuco和Fuco色素含量没有显著差异, 而Diad和Gyro等色素含量则有一定差别, 其中冷冻研磨+超声组和手动研磨+超声组中色素含量显著高于其他组(P < 0.05), 冷冻研磨+超声组中Chl a含量也显著高于手动研磨+超声组(P < 0.05)。

在自然海水样品中共检测到10种色素, 其中, 各实验组间Peri、Hex-fuco、Diad、Chl b及Bcar没有明显差异。各组中Chl a含量存在显著差异, 冷冻研磨+超声组的Chl a含量显著高于其他组, 手动研磨组含量次之, 超声和冷冻研磨组显著偏低(P < 0.05)。除Chl a外, 超声处理组的Fuco、Chlide a、Viol、Zeax等色素含量也显著低于其他组(P < 0.05)。对比各组结果可以看出, 各处理组对藻类色素的提取分析效果因藻种和色素而异, 但综合来看冷冻研磨+超声处理对微藻样品色素提取效果最好, 手动研磨+超声处理组次之。

2.2 不同提取方式对大型藻样品中色素分析结果的影响

不同提取方式对大型藻样品中色素的提取分析结果如图 2所示。对浒苔中色素的分析结果显示, 各组Chl a和Chl b含量并无显著差异(P < 0.05)。对比其他色素来看, Chlide a含量在手动研磨组最高, 而Viol含量在超声组最高, Neox和Lute等色素含量在冷冻研磨+超声组中最高。对初次研磨后的浒苔样品碎片进行显微观察(图 3a、b), 可以看出冷冻研磨组仍然存在一些细小的藻体碎片, 色素未能充分提取; 而手动研磨组色素残留较少。总体而言, 手动研磨组与冷冻研磨+超声组对于浒苔中色素提取效果较好, 而超声组效果最差。

从铜藻叶片中色素的提取效果可以看出, 手动研磨组Chl a含量显著低于其他组(P < 0.05), 其他各组色素含量并无显著差异, 其中冷冻研磨+超声组提取的色素含量最高。对研磨后铜藻样品的显微观察(图 3c、d)显示, 手动研磨的铜藻叶片边缘仍有残留色素, 而冷冻研磨组中的铜藻叶片已被破碎成颗粒状(图 3c), 没有明显的色素残留。因此, 对于铜藻叶片, 冷冻研磨+超声组的色素提取效果最好, 超声组、手动研磨超声组、冷冻研磨组次之, 手动研磨组提取效果最差。

综上可见, 不同提取方式对于大型藻样品中色素提取效果有一定差异。例如, 手动研磨组对浒苔的提取效果较好, 但对于铜藻样品却不理想, 而超声组恰好相反。冷冻研磨+超声组对色素的提取效果总体最好。

2.3 浒苔和铜藻中Chl a提取效率

5种提取方式对浒苔和铜藻中色素的提取效率实验结果如表 2所示, 可以看出浒苔中Chl a提取效率整体高于铜藻, 其中手动研磨+超声组最高(99.7%), 冷冻研磨组均略低于手动研磨组。对于铜藻样品, 冷冻研磨+超声组效果最好, 达到94%, 且冷冻研磨结果均好于手动研磨。不同方式对两种大型藻色素提取效率的差异, 推测是受到大型藻组织结构差异的影响。

3 讨论

藻类中的光合色素是用以反映浮游植物生物量和分析群落组成的重要指标, 以往学者开发了许多方法对藻类中的色素进行分析。常见方法有分光光度法、荧光法和高效液相色谱法等, 这些方法都需要破碎藻细胞, 从而提取细胞中的光合色素。但是, 受到藻类细胞壁结构和色素组成等因素影响, 色素提取过程存在不确定性^{[12, 20]}。同时, 复杂的提取过程也会导致色素转化或降解^[21], 从而影响色素分析结果的精确性和准确性。因此, 在色素分析过程中, 需要综合考虑色素提取的稳定性、重复性、便利性和安全性等。

本研究结果表明, 微藻种类对色素提取效果存在明显影响。以往研究也发现, 微藻细胞壁结构和代谢过程都会影响色素提取效率^[22-23]。在本研究中, 超声处理相比于研磨处理对硅藻色素的提取效率更高。而米氏凯伦藻等甲藻缺乏细胞壁, 甲藻中的色素(如叶绿素和类胡萝卜素)提取效率通常较高^[24], 本研究中2种研磨方式和超声处理对色素的提取效果也相近, 将冷冻研磨与超声处理相结合有助于达到更好的色素提取效果。此外, 色素提取效果还可能与不同培养条件有关, 本实验以硅藻为主的自然海水中, 叶绿素和Fuco在单一超声提取条件下, 提取效率较低, 而在实验室培养的硅藻中未发现此现象, 可能由于野外海水中的复杂成分干扰超声提取过程, 野外环境胁迫、浮游动物摄食等可能诱导硅藻等细胞壁加厚^[25], 而实验室培养的单一硅藻环境适宜且大多处于指数生长期, 因此其细胞结构也有所差异。对大型藻类而言, 浒苔和铜藻中色素的提取状况也存在差异。浒苔藻体是由单层细胞组成的中空管状结构^[26], 重量较轻, 易漂浮于海面。在冷冻研磨过程中, 浒苔的片段会漂浮在提取液表层, 难以充分研磨。而手动研磨可以有意识地针对细小的藻体片段进行研磨, 具有更好的色素提取效率。而铜藻叶片由表皮、皮层等多层细胞组成, 不易悬浮, 且细胞壁中含有褐藻胶和岩藻多糖等物质^[27], 手动研磨难以充分提取色素, 在锯齿状叶片的边缘容易出现色素残留, 而冷冻研磨仪则可以通过施加更强的机械力, 将铜藻叶片充分破碎, 提高色素提取效率。如果辅以超声处理, 可以更好地破坏细胞壁结构, 使得色素更加充分。总之, 针对不同种类的大型藻, 需要有针对性的选择色素提取方法, 提高色素提取效率。

从实验结果可以看出, 藻类中色素的提取效果还与色素种类有关。在提取过程中, 藻类色素受到化学环境改变或酶促反应影响, 会出现转化或降解, 产生各种衍生物, 如Chl a在提取过程中会降解生成多种衍生物^[18]。而研磨和超声过程中产生的热量会激活叶绿素酶活性, 促进色素降解^[28-30], 生成Chlide a等衍生物。硅藻细胞中叶绿素酶活性变化最大, 本研究在通过手动研磨提取圆海链藻、浒苔及自然海水中的色素时, Chlide a色素含量都有明显上升, 说明手动研磨会促进Chl a的降解。自然海水样品中Chlide a和Fuco含量较高, 也反映了海水中浮游植物以硅藻为主的组成状况, 符合采样期间青岛近岸海域浮游植物的组成特征^[31]。与手动研磨相比, 冷冻研磨仪可以控制研磨期间的温度, 降低色素分解。同时, 使用冷冻研磨仪能够避免杂质干扰及交叉污染, 重复性和稳定性也比较好。用超声波处理藻类样品能够降低色素分解, 提高提取效率^[32]。在本研究中, 将冷冻研磨与超声处理相结合, 色素提取效果明显好于其他处理方法。

在海洋生态学研究中, 往往有大量野外样品需要进行处理。因此, 样品的研磨时间、强度和温度等条件直接影响样品的处理效率。冷冻研磨可以显著提高样品的处理效率和稳定性^[33-34]。冷冻研磨仪处理样品操作便捷, 可以快速、高效地实现样品批量处理。对比手动研磨和冷冻研磨仪的处理效率, 手动研磨时每个样品处理时间约60 ~ 90 s, 而冷冻研磨仪仅需30 s便可同时处理48个微藻样品, 显著提高了样品处理效率。同时, 冷冻研磨仪通过高速旋转和振动, 可以将样品研磨成细小的颗粒, 提高样品处理的均一性和重复性。此外, 冷冻研磨仪的使用还提高了样品处理过程的安全性^[35]。由于色素提取剂多为有毒或易燃的有机试剂, 对人体健康和实验室安全具有一定的风险, 使用冷冻研磨仪可以减少实验者与有机提取剂的接触, 降低了有机试剂对实验人员身体的损害。因此, 冷冻研磨仪适用于藻类色素提取过程, 在相关的科学研究和工业生产领域具有广阔的应用前景。

4 总结

本研究对比了5种细胞破碎色素提取方法对藻类样品中色素的提取分析效果, 结果表明藻类色素提取效果不仅与提取方法有关, 还与目标藻种和色素种类有关。总体而言, 冷冻研磨辅以超声处理对藻类样品中的色素提取效果最好。对具有硅质细胞壁的硅藻来说, 超声处理也有较好的效果。对于实验的2种大型藻, 结构相对简单的浒苔中色素提取效果总体好于铜藻, 冷冻研磨对铜藻色素的提取效果好于手动研磨, 而浒苔则呈现出相反的结果。由于提取过程中Chl a易于分解, 在不同色素提取方法中含量差异最为明显。在具体应用过程中, 采用冷冻研磨仪可以更好地简化操作、提高效率, 增加安全性, 有进一步推广应用的价值。