2025, Vol. 49
文章信息
- 孟雪, 李爽, 张杰, 段德麟. 2025.
- MENG Xue, LI Shuang, ZHANG Jie, DUAN Delin. 2025.
- 海带(Saccharina japonica)甘露糖醛酸C5异构酶的功能分析
- Functional analysis of mannuronan C5-epimerases from Saccharina japonica
- 海洋科学, 49(6): 15-24
- Marine Sciences, 49(6): 15-24.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250225003
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文章历史
- 收稿日期：2025-02-25
- 修回日期：2025-04-07
2. 青岛海洋科技中心 海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266000;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266000, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
褐藻胶是主要由褐藻和细菌产生的一类独特的多糖, 它是褐藻细胞壁的主要组成成分[1]。从化学结构分析, 褐藻胶是一种线性高分子聚合物, 由1, 4-糖苷键连接的β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid, 简称M)及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-guluronic acid, 简称G)组成[1-3]。褐藻胶中β-D-甘露糖醛酸与α-L-古罗糖醛酸这两种结构单元的主要区别体现在-OH基团在C5位上的空间位置不同, 以及分子空间排布和构象特征的不同[4]。在褐藻胶中, 这些醛酸主要以3种不同的方式排列: 连续的M残基(称为MM区块), 连续的G残基(称为GG区块), 以及M和G残基交替排列(称为MG区块)[1-5]。高古罗糖醛酸含量的褐藻胶对Ca2+、Zn2+等二价离子具有更高的亲和力, 通过与二价离子结合产生凝胶并形成“蛋盒结构”[4-6], 这种特性的凝胶在高温和酸性条件下仍保持稳定性, 因此在食品、制药和纺织工业等领域的应用受到高度重视, 使这种类型的褐藻胶成为固定化生物催化剂的优良材料, 在生物工程领域具有重要应用价值[7-8]。
尽管目前对细菌中褐藻胶的生物合成已经进行了明确的研究, 并且已经确定了参与该合成过程中的关键酶, 但对褐藻中褐藻胶合成的分子机制知之甚少[9-11]。此前, Michel等[12]研究了褐藻胶在细菌(铜绿假单胞菌, Pseudomonas aeruginosa)和长囊水云(Ectocarpus siliculosus)体内的合成途径, 证实有13种酶参与细菌体内的褐藻胶合成过程, 并确定了甘露糖醛酸C5异构酶(Mannuronan C5-epimerase, 简称MC5E)在褐藻的褐藻胶合成途径中发挥功能。褐藻中褐藻胶的M/G比值通常根据褐藻的种类、培养条件和生长季节等因素而产生变化[13-15]。因此, 开发褐藻胶合成途径中的关键催化酶, 并提高其催化活性, 对生产高质量褐藻胶至关重要。MC5E是褐藻胶合成中的关键修饰酶, 可将β-D-甘露糖醛酸(M)催化成α-L-古罗糖醛酸(G)[16-17], 目前, 细菌MC5E的结构和功能研究的较为透彻[18-20], 但未见褐藻MC5E的相关研究。由于MC5E可以通过改变M/G比值和嵌段分布而设计出具有特定性质的褐藻胶, 因此, 深入了解MC5E的催化机制和理化特性, 已成为当前热门的研究领域[5]。
本研究基于海带基因组序列和转录组数据[21], 对SjMC5E序列进行系统地生物信息学分析, 筛选出高表达的SjMC5E3序列并对其进行了表征, 测定了其酶活性。本文旨在验证SjMC5E3作为甘露糖醛酸C5异构酶的催化特性及其合成G残基的能力, 以期为生产高硬度褐藻胶提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 样品采集海带的新鲜样品采集于中国荣成的山东高绿水产养殖公司。将收集到的海带样品使用无菌水洗涤3次, 并使用纸巾吸干海带表面的水分。随后将样品于液氮中迅速冷冻, −80 ℃保存, 用于后续实验。
1.2 SjMC5E3基因的克隆候选的SjMC5E3基因从海带转录组数据库中检索(NCBI登录号: PRJNA512328)。使用SPARK easy多糖多酚/复杂植物RNA试剂盒(思科捷, 中国)提取总RNA, 并将提取到的RNA根据SPARK script Ⅱ RT Plus Kit(with gDNA Eraser)试剂盒(思科捷, 中国)转化为cDNA。利用设计的引物F(5′-CGCCATATGA TGGCGGGCCAGATC -3′)和引物R(5′-CCGGAATTCCTAGTCGGTATCCGA-3′)扩增SjMC5E3的开放阅读框区域。利用SjMC5E3-F1/R1引物和Prime STAR Max DNA聚合酶(Takara, 日本)扩增SjMC5E3基因cDNA, 设置反应体系如下: 2×Phanta Master Mix(诺维赞, 中国)10 µL, cDNA 4 µL, F/R引物各1 µL, 总体系为20 µL。将反应体系于PCR仪中扩增并设置PCR反应程序如下: (1)95 ℃, 3 min, 1次循环; (2)95 ℃ 15 s, 57 ℃ 15 s, 72 ℃ 100 s, 35次循环; (3)72 ℃ 5 min, 1次循环。将扩增产物克隆到载体TOPO中, 整个克隆区域(TOPO-SjMC5E3)通过测序分析得到确认。
1.3 SjMC5E3基因的序列分析使用ORF Finder(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)将得到的SjMC5E3序列翻译成氨基酸序列, 并通过SignalP(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)预测信号肽[22]。应用ProtParam预测SjMC5E3的蛋白分子量和等电点等理化参数[23]。二级结构预测采用SOPMA软件(https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)。通过TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测序列是否含跨膜结构域[24]。使用Clustal W(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)对NCBI(National Center for Biotechnology Information)中引用的SjMC5E3目标序列进行氨基酸序列比对[25], 并使用ESPript 3.0整理[26]。SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)用于预测和模拟候选SjMC5E3蛋白的三维结构[27]。
1.4 SjMC5E3的体外表达及纯化将提取的TOPO-SjMC5E3质粒分别使用EcoR I和Nde I进行双酶切, 并与T4连接酶连接, 构建融合质粒pCold-SjMC5E3。然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中。重组蛋白在含有100 µg/mL氨苄和20 µg/mL氯霉素的LB培养基中表达, 于37 ℃, 120 r/min下振荡培养, 当培养液OD600值达到0.6时将终浓度为0.1 mmol/L的IPTG加入培养瓶中, 15 ℃下120 r/min孵育24 h。孵育结束后于4 ℃, 4 500 r/min条件下离心30 min收集菌体沉淀。将沉淀重新悬浮在平衡缓冲液(20 mmol/L磷酸钠、500 mmol/L NaCl、5%甘油和30 mmol/L咪唑缓冲液, pH=7.5)中, 并加入蛋白酶抑制剂(罗氏, 瑞士)。通过振荡旋涡使溶液完全混合后进行超声破碎处理(破碎5 s, 间隔10 s, 功率30%, 温度10 ℃), 随后在4 ℃, 12 000 r/min条件下离心45 min, 去除细胞碎片。SjMC5E3粗蛋白在ÄKTA纯化设备(GE Healthcare, 美国)上进行分离纯化, 使用HisTrapTM HP亲和柱(GE Healthcare, 英国)。将目的粗蛋白使用平衡缓冲液稀释至样品体积的3倍, 过0.45 μm滤膜, 然后在ÄKTA系统上以1 mL/min的速率上样, 随后使用洗脱缓冲液(20 mmol/L磷酸钠、500 mmol/L咪唑、500 mmol/L NaCl和5%甘油, pH=7.5)按梯度洗脱粗蛋白。纯化后的样品使用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离, 并采用Western blot检测目的蛋白的存在, 使用抗His标签小鼠单克隆抗体(1∶5 000, CWBIO, 中国)和山羊抗小鼠IgG抗体(HRP偶联)(1∶1 000, CWBIO, 中国)。
1.5 SjMC5E3的酶活性测定利用核磁共振光谱分析(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy, 简称 1H NMR)检测酶活性[18]。总酶促反应体系由300 μL MOPS(100 mmol/L)、300 μL NaCl(1 mmol/L)、12 µL CaCl2(1 mmol/L)、300 μL海藻酸钠(2.5%)和60 μL SjMC5E3组成。同样方法制备不含SjMC5E3的未经处理的对照组。制备的反应体系在30 ℃条件下反应40 h, 然后在95 ℃下加热10 min, 于4 ℃, 12 000 r/min下离心15 min, 以去除变性蛋白。随后, 在上清液中加入4倍体积的无水乙醇, 涡旋混匀, 于4 ℃, 12 000 r/min下离心15 min。使用无水乙醇反复洗涤沉淀3次, 并于37 ℃环境下干燥沉淀。最终, 将得到的沉淀溶于D2O中并迅速用液氮冷冻。冷冻后的样品在冷冻干燥机(CHRIST, Alpha 1-2 LD plus, 德国)中使用D2O反复冷冻3次, 最后溶解在D2O中, 在Bruker AVANCE Ⅲ 600上进行1H NMR核磁共振光谱分析, 检测温度为25 ℃[28, 29-31]。M/G比值的计算基于公式[28, 31-32]: FM+FG=1。
2 结果 2.1 SjMC5E3的序列分析SjMC5E3的ORF长度为1 065 bp, 编码354个氨基酸, 预测分子量为39.27 kDa。SjMC5E3的序列特征分析总结如表 1所示。
| 名称 | SjMC5E3 |
| 序列长度/bp | 1 065 |
| 氨基酸数目 | 354 |
| 膜螺旋结构 | 0 |
| 等电点 | 4.26 |
| 分子量/kDa | 39.27 |
| α-螺旋/% | 0.28 |
| Extended strand/% | 27.68 |
| Random coil/% | 72.03 |
信号肽预测结果显示, SjMC5E3序列在34~35位点之间存在一个信号肽, 且不含跨膜结构, 预测位于细胞膜外(图 1)。三维结构结果表明, SjMC5E3与已知的AlgG T265N的晶体结构(4ozy.1.A)一致性为21.53%, 以此为模板模拟出SjMC5E3的三维结构具有典型的β-螺旋结构域(图 1), 属于β-螺旋家族成员。此外, 预测分析显示, SjMC5E3具有2个结构域功能, 一个是周质铜结合蛋白(NosD)(PF05048), 另一个是典型的右手β螺旋区域(PF13229)。为了进一步解析其结构特征, 我们将SjMC5E3的三维结构模型与SWISS-MODEL模板库中已知的同源性最高的10个模板结构进行了比对, 其中90%来自广泛系统发育起源的甘露糖醛酸C5异构酶, 包括细菌(固氮菌AlgE4、AlgE6及大肠杆菌)以及海带(Laminaria japonica MC5E), 其催化核心区域呈现相似性。
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| 图 1 SjMC5E3的生物信息学分析 Fig. 1 Bioinformatics analysis of SjMC5E3 注: C-score, 原始切割位点评分; S-score, 信号肽评分; Y-score, 综合切割位点得分, 为C-score和S-score的几何平均值; TMHMM, 跨膜螺旋结构 |
BLAST分析表明, SjMC5E3序列包含2个典型的右旋β-超螺旋结构, 属于β-超螺旋家族。使用Clustal W对SjMC5E3序列进行建模, 并利用ESpript 3.0软件进行多序列比对(图 2)。比对结果显示, SjMC5E3与水云Ectocarpus sp. CCAP 1310/34的MEP14(NCBI参考序列: CAB1098160.1)和长囊水云(NCBI参考序列: CBJ31264.1)的相似性分别为79.55%和79.26%。
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| 图 2 SjMC5E3与Ectocarpus sp. CCAP 1310/34的MEP14(NCBI参考序列: CAB1098160.1)和长囊水云MC5E(NCBI参考序列: CBJ31264.1)的多序列比对 Fig. 2 Alignment of the SjMC5E3 sequence with Ectocarpus sp. CCAP 1310/34 MEP14 (NCBI accession: CAB1098160.1) and E. siliculosus MC5E (NCBI accession: CBJ31264.1) |
为了对SjMC5E3进行体外表征并测定其酶的特性, 我们首先在体外诱导SjMC5E3蛋白表达, 然后对其进行蛋白纯化。重组His标记的SjMC5E3分子量约为41 kDa。重组His标记的SjMC5E3蛋白纯化后, SDS-PAGE(图 3a)和Western blot结果显示(图 3b), 目的蛋白的分子量与预期相符。
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| 图 3 重组SjMC5E3的SDS-PAGE和Western blot结果 Fig. 3 SDS-PAGE and Western blot analysis of the recombinant SjMC5E3 注: Marker, 蛋白Marker; (a)1: 粗蛋白; 2-6: 纯化蛋白; (b)1: 粗蛋白; 2-5: 纯化蛋白 |
纯化后, 采用核磁共振氢谱法对提取的蛋白进行结构分析。测定α-L-古罗糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)的特异峰, 用于计算M/G比值(图 4)。结果表明, 实验组的FM峰降低, FG峰升高, 说明重组SjMC5E3蛋白具有甘露糖醛酸C5异构酶的活性, 能将β-D-甘露糖醛酸(M)转化为α-L-古罗糖醛酸(G), 其M/G比值为4.63(表 2)。
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| 图 4 SjMC5E3酶活性测定的核磁共振分析谱图 Fig. 4 Proton nuclear magnetic resonance spectra of SjMC5E3 in the epimerase activity assay 注: M: β-D-甘露糖醛酸; G: α-L-古罗糖醛酸; 在约5.05处的峰值来自G残基的H-1; 在约4.61处的峰值来自M残基的H-1 |
| 分组 | FM | FG | M/G |
| 实验组 | 0.822 4 | 0.177 6 | 4.63 |
| 对照组 | 0.898 6 | 0.101 4 | 8.86 |
本研究从海带中筛选出高表达的SjMC5E3序列, 对其进行序列分析和结构预测, 证实其与其他来源的甘露糖醛酸C5异构酶一样, 属于β-螺旋家族成员。异源表达、纯化后的酶活分析结果显示, 重组的SjMC5E3具有催化β-D-甘露糖醛酸向α-L-古罗糖醛酸转化的活性。
甘露糖醛酸C5异构酶是褐藻胶合成代谢途径中的重要修饰酶[1], 可催化β-D-甘露糖醛酸(M)向α-L-古罗糖醛酸(G)的差异异构化, 由一个多基因家族编码[10], 主要有褐藻和细菌两个主要来源, 且不同来源的MC5E具有不同的性质及特征[34-35]。此前, 基因组分析显示, 掌状海带(Laminaria digitata)、长囊水云(E. siliculosus)和海带中分别存在56、31和143条MC5E序列, 这些研究表明, 不同褐藻物种中MC5E基因的数量存在差异, 且褐藻中的MC5E序列明显多于细菌[8, 18-20]。一般而言, 褐藻胶是由M和G两种单体组成的共聚物, 其性质随M与G比例的变化而变化, 并且与MM、GG和MG嵌段结构密切相关[6]。在褐藻胶中M与G残基的构象特征明显不同, M残基通常以4C1的构象形式存在, 而G残基则以1C4的构象形式存在[4-5]。在MG嵌段结构中, 由于M和G两种结构单元交替连接形成糖苷键, 其分子构象与MM、GG嵌段结构相比具有更高的弹性特征[5-6]。
目前, 细菌中MC5E的研究较为透彻, 但褐藻MC5E的生化特性等相关研究仍处于初步阶段[35-36]。Nyvall等[20]于2003年首次从掌状海带中分离得到与细菌甘露糖醛酸C5异构酶基因相似的全长cDNA, 提出MC5E基因参与褐藻中褐藻胶生物合成途径的最后一步, 此后关于甘露糖醛酸C5异构酶的研究一直备受关注。虽然此前有报道称从极北海带(Laminaria hyperborea)的柄部中提取的褐藻胶的M/G比值仅为0.4[17-18], 但是以该类褐藻为原料的提取工艺存在局限性, 将叶片与柄部分离面临难题, 使得G残基的含量很难再进一步提高。而目前在褐藻胶工业生产中对低M/G比值的需求很大, 这一定程度上刺激了酶制剂和褐藻胶生产工艺的改进。因此, 开发褐藻胶合成途径中的关键催化酶, 并提高其催化活性, 对生产高质量的褐藻胶至关重要。本研究首次报道了SjMC5E3的异源表达和纯化, 支持了Nyvall等[20]的假设。SjMC5E3的三维结构模型与SWISS-MODEL模板库中模板结构比对表明, 与其他MC5E一样, SjMC5E3属于β-螺旋家族成员, 尽管这些酶来自不同的系统发育分支, 但其催化核心区域呈现相似性, 这表明在系统发育远缘的物种之间存在保守的催化机制。
目前褐藻胶广泛应用于各种工业领域, 因此控制其机械性能, 包括机械强度和刚度对工业生产来说是至关重要的[36]。高G含量褐藻胶通常被认为能形成具有高刚性和高机械强度的凝胶, 这些凝胶通常用于需要高机械强度的工业中[36]。G残基含量受藻类种类、藻类比例、收获季节、藻类生长环境等多种因素的影响, 因此M/G转化率随这些因素而变化[35-36]。为了获得较高G残基含量的褐藻胶, 我们筛选SjMC5E3序列并测定其酶活性, 检测到SjMC5E3具有甘露糖醛酸C5异构酶的功能。
在本研究中, 我们测量了SjMC5E3在催化M到G的转化过程中的酶活性(图 5), 据核磁共振氢谱分析结果, 在30 ℃条件下, SjMC5E3可催化β-D-甘露糖醛酸(M)向α-L-古罗糖醛酸(G)的差异异构化, M/G的比值为4.63。目前, 从褐藻中获得高硬度褐藻胶的方法主要有三种: 改变褐藻种类、化学改性和生物改性[21]。虽然从极北海带和褐藻(Lessonia trabeculata)中可以获得M/G比值低至0.4的褐藻胶[17-18], 从掌状海带中可以获得M/G比值约为1.9的褐藻胶, 但这些藻类的来源非常有限, 在提取工艺中存在一系列问题, G残基含量只能控制在较高的水平。通过化学方法可以获得M/G比值约为1.8的褐藻胶[37-38], 但该法改变褐藻胶的结构, 存在一定的不可控性。同时, 在这个过程中温度的控制也存在较大局限性。高温可能导致褐藻胶降解, 低温可能引入其他化学物质导致污染问题[17]。因此, 本研究利用生物酶法改变褐藻胶的性质, 获得的产物M/G比值为4.63, 该法既可以打破褐藻来源的限制, 也不会产生二次污染问题。迄今为止, 虽然已经确定MPI(Mannose-6-phosphate isomerase)、PMM(Phosphomannomutase)、GMD(GDP-mannose 6-dehydrogenase)和MC5E在褐藻的褐藻胶合成中起作用, 但相关研究仍处于初级阶段[12]。本研究在原核细胞中成功表达了可溶性的SjMC5E3融合蛋白。该方法可减少变性引起的活性损失, 缩短表达周期, 特异性强, 效率高, 并在很大程度上能够降低成本。因此, 本研究结果可为生产高G含量的褐藻胶提供理论依据, 未来可进一步探索MC5E的最佳反应条件, 为满足高性能藻酸盐的需求贡献更多的技术支撑。
4 结论本研究实现可溶性SjMC5E3的体外表达, 并对其作为甘露糖醛酸C5异构酶的活性进行了表征。核磁共振光谱分析结果表明, SjMC5E3可催化β-D-甘露糖醛酸(M)生成α-L-古罗糖醛酸(G), 使产物中G残基的含量升高, M/G比值为4.63, 显示出甘露糖醛酸C5异构酶活性的功能。本文可为生产较硬特性的褐藻胶提供理论依据。
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