2025, Vol. 49
文章信息
- 滕镜如, 刘新雨, 谭素建, 郇聘, 刘保忠. 2025.
- TENG Jingru, LIU Xinyu, TAN Sujian, HUAN Pin, LIU Baozhong. 2025.
- 3种典型贝壳形成基因在红条毛肤石鳖早中期担轮幼虫中的表达特征
- Expression characteristics of three shell-formation-associated genes in trochophore larvae of the chitona Acanthochitona rubrolineata
- 海洋科学, 49(6): 25-36
- Marine Sciences, 49(6): 25-36.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250226002
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文章历史
- 收稿日期：2025-02-26
- 修回日期：2025-05-01
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
贝壳是软体动物的钙化结构[1], 也是重要的保护器官[2]。在不同的软体动物类群中, 贝壳的形态和数目表现出丰富的多样性[3]。与此相对的是, 早期贝壳发育作为贝壳形成的起始事件, 在不同的软体动物之间具有一定的保守性[4]。不同软体动物类群的贝壳发育都起始于原肠胚时期, 胚胎背侧的外胚层中间区域细胞增厚并逐渐内陷(多板纲动物的贝壳形成没有内陷过程), 形成将来分泌贝壳的组织——贝壳发育区(shell field)[5], 随后其内的细胞逐渐分化并分泌贝壳相关的不溶性物质[6], 最终沉积碳酸钙形成贝壳。这一过程非常保守, 细胞谱系研究表明, 软体动物贝壳发育区的细胞大都是由2d小卵裂球及其子代细胞发育而来[7](在部分类群中, 是2d和2c卵裂球及其子代细胞)。目前, 贝壳发育机制的研究已经深入到分子水平。分析表明, 贝壳发育相关基因也具有一定程度的保守性。这类研究主要聚焦在两类基因[8]上, 一类是编码直接参与贝壳形成蛋白或酶的基因, 如酪氨酸酶基因(tyrosinase, tyr)、碱性磷酸酶基因(alkaline phosphatase, ap)[9]、几丁质合酶基因(chitin synthase, cs)[10]等; 另一类是编码细胞信号通路分子或转录因子的基因, 如bmp2/4[11]、hox[12]和engrailed[13]等。上述两类基因在许多物种中的表达模式十分相似, 提示了不同软体动物类群的早期贝壳发育过程可能存在着相似的分子调控机制。
石鳖是多板纲软体动物(Polyplacophora)的现存成员[14], 是唯一一类有8片贝壳的软体动物, 它的贝壳在背部呈“覆瓦状”重复排列[15]。除数量外, 石鳖贝壳与其他软体动物贝壳的形成过程也有所不同[16]。其他动物在早期发育过程中仅形成1片贝壳(又称壳板), 而石鳖的不同壳板则是分步形成的: 前7个壳板的原基在早期发育阶段形成, 变态后迅速形成壳板, 而第8个壳板则要在更晚的阶段形成[17]。这些独特的贝壳表型与石鳖独特的演化地位有关[18]。根据目前系统演化研究的结果, 软体动物门分为有刺亚门(Aculifera)和有壳亚门(Conchifera), 在寒武纪甚至更早即互相分离。两个亚门的主要区分标志之一是钙化结构的差别(棘刺和贝壳)[19]。棘刺是有刺亚门(多板纲、无板纲)的钙化结构, 而贝壳是有壳亚门(腹足纲、双壳纲等)的钙化结构。石鳖的独特之处在于, 作为有刺亚门的一员[20], 其不仅长有棘刺, 还具有贝壳。长期以来, 石鳖的贝壳一直是领域内关注的焦点问题, 例如其与有壳亚门软体动物贝壳的同源性[21], 以及与棘刺之间的关系[22]等, 一直存在争议[23]。从分子水平比较石鳖与其他软体动物贝壳形成的异同, 有助于回答上述问题。
本实验以红条毛肤石鳖(Acanthochitona rubrolineata)为研究对象, 分析了一系列参与有壳亚门软体动物贝壳发育的典型基因[24-27]的表达模式, 包括酪氨酸酶基因、信号通路分子bmp2/4基因和转录因子gata2/3基因, 探讨了这些基因与石鳖贝壳形成的相关性。结果发现这些基因的表达模式与有壳亚门软体动物中的表达模式差异较大, 从而在分子水平揭示了石鳖与其他软体动物贝壳发育机制的差异。本研究结果为解析多板纲软体动物的贝壳形成机制提供了理论支撑, 对于理解软体动物贝壳的发育及演化具有重要意义。
1 材料与方法 1.1 石鳖幼虫样品的收集与固定在山东省青岛市黄岛区海域采集性腺成熟的红条毛肤石鳖个体。待其产卵和产精后收集生殖细胞, 在六孔板中混合进行体外人工授精, 于25 ℃培养箱中培养, 并使用光学显微镜观察幼虫后续发育状态。使用4%多聚甲醛溶液分别在24 hpf(hours post fertilization)、36 hpf和48 hpf三个发育阶段(早、中期担轮幼虫)固定样品, 甲醇梯度脱水后于−20 ℃保存。
1.2 基因的序列特征与聚类分析将已知贝壳发育相关的基因与石鳖转录组进行Blast比对, 筛选得到tyr、bmp2/4和gata2/3的同源序列, 分别命名为AR-tyr1、AR-tyr2、AR-bmp2/4和AR-gata2/3。对4个基因编码的氨基酸序列进行保守性分析, 利用NCBI的CDD数据库检索了各基因编码蛋白的保守结构域情况(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi), 利用MEGA 6.0软件的ClustalW功能分别对红条毛肤石鳖与其他种属动物中Tyr、BMP2/4和GATA2/3的氨基酸序列进行多重比对, 并采用Maximum Likelihood (ML) 法构建了系统演化树, 检验方法为Bootstrap, 检验次数设置为1 000次。
1.3 整装原位杂交实验根据筛选得到的AR-tyr1、AR-tyr2、AR-bmp2/4和AR-gata2/3基因序列设计引物(表 1), 扩增基因片段为模板, 使用DIG标记的NTP混合物和T7 RNA聚合酶转录合成RNA探针。通过整装原位杂交实验研究AR-tyr1、AR-tyr2、AR-bmp2/4和AR-gata2/3基因的表达模式。整装原位杂交实验参照本课题组前期的方法[28]。
| 基因名 | 引物序列 |
| AR-tyr1 | F: 5′TCAATAGTGCTGTCGTCTCCTTCA3′ |
| R: 5′GTCCCTGTCGGTTTGTCATTCG3′ | |
| AR-tyr2 | F: 5′TGGTACAGGACACGTTAGAGGAC3′ |
| R: 5′GGTCTGTCTGATTGTCTCGGAATT3′ | |
| AR-bmp2/4 | F: 5′TCTCAGTTCAGCGAAGAGGACAA3′ |
| R: 5′CCGCAGCCTTCTACAACCATATC3′ | |
| AR-gata2/3 | F: 5′CAGGCGGGAGTCAGGTTTGT3′ |
| R: 5′ATACTGGATGACGATGAGAGGTTGA3′ |
4个基因编码蛋白的序列分析结果在图 1中展示。AR-Tyr1和AR-Tyr2具有保守的酪氨酸酶结构域, 其中有2个铜离子结合结构域。酪氨酸酶在该结构域有6个组氨酸与2个铜离子结合, 但是在石鳖中有2个位点发生了突变, 只有4个组氨酸保守位点。此外, AR-Tyr1还包含一个几丁质结合结构域。AR-BMP2/4包含一个TGF-β结构域, 在TGF-β家族成员中高度保守[29]。大多数家族成员通过链间二硫键将单体连接在一起形成二聚体[30]。AR-GATA2/3包含两个保守的锌指结合域, 没有信号肽。锌指结构域可以识别靶基因启动子序列中保守的(A/T)GATA(A/G)基序, 从而调控基因的表达[31], 这是GATA蛋白质家族成员的典型特征[32]。
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| 图 1 AR-Tyr1、AR-Tyr2、AR-BMP2/4和AR-GATA2/3以及有壳亚门软体动物的相关蛋白结构示意图 Fig. 1 Diagrams of AR-Tyr1, AR-Tyr2, AR-BMP2/4, and AR-GATA2/3 and their conchiferan homologs 注: 左侧展示了石鳖相关蛋白, 作为对比, 右侧展示了有壳亚门软体动物长牡蛎(Crassostrea gigas)的相关蛋白 |
AR-tyr1、AR-tyr2基因聚类分析结果见图 2, 酪氨酸酶家族显示出明显的复杂性和多样性。不同动物类群的酪氨酸酶家族成员各自聚集为一支, 包括软体动物分支、线虫动物分支、节肢动物分支和脊索动物分支。在软体动物分支内部, AR-Tyr1和AR-Tyr2并不聚集在一起, 而是分别与两种石鳖(日本花棘石鳖Liolophura japonica和鳞侧石鳖Leptochiton asellus)的酪氨酸酶聚为一支, 提示他们可能是不同类型的编码酪氨酸酶的基因, 在石鳖中发生了种系特异性分化。除这4种石鳖的酪氨酸酶外, 演化树中其余软体动物分支的酪氨酸酶均来自有壳亚门软体动物, 但它们也并不聚为一支, 而是分成两支, 且其分布关系与来源动物的亲缘关系并不一致。例如, 两个分支中均同时包含双壳纲和腹足纲动物, 这些结果提示, 有壳亚门软体动物内部也存在酪氨酸酶基因在分子类型方面的分化。
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| 图 2 AR-tyr1和AR-tyr2的基因聚类分析 Fig. 2 Phylogeny analysis of AR-tyr1 and AR-tyr2 |
BMP家族成员分为两大支(图 3), 一支为BMP2/4, 另一支为BMP5-8。BMP5-8(在节肢动物中有时被称为Gbb)包括软体动物分支、节肢动物分支、线虫动物分支和脊索动物分支。BMP2/4(在节肢动物中有时被称为DPP)包括软体动物分支、节肢动物分支和脊索动物分支。AR-BMP2/4位于BMP2/4分子中的软体动物分支, 与日本花棘石鳖L. japonica的BMP2聚为有刺亚门分支。
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| 图 3 AR-bmp2/4的基因聚类分析 Fig. 3 Phylogeny analysis of AR-bmp2/4 注: DPP全称Decapentaplegic, 是BMP2/4在一些节肢动物中的同源蛋白; Gbb全称Glass boat bottom, 是BMP5-8在一些节肢动物中的同源蛋白; 一种不属于BMP蛋白家族的TGF-β蛋白在本分析中作为外群 |
GATA家族的聚类结果显示, GATA家族的成员分为2个分支, 分别是GATA1/2/3和GATA4/5/6(图 4)。GATA4/5/6分支包括脊索动物的GATA4、GATA5和GATA6以及节肢动物的Pannier, 其分别聚集成脊索动物门和节肢动物门分支。GATA1/2/3分支进一步分成GATA1和GATA2/3的两个亚分支, 其中GATA1仅包括脊索动物, 而GATA2/3则分别聚集成软体动物门、扁形动物门、环节动物门和脊索动物门分支。AR-GATA2/3位于GATA2/3分子中软体动物下的有刺亚门分支, 与日本花棘石鳖L. japonica的GATA3亲缘关系最近, 支持了它高度的保守性。
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| 图 4 AR-gata2/3的基因聚类分析 Fig. 4 Phylogeny analysis of AR-gata2/3 |
AR-tyr1基因在3个发育阶段的表达模式差异不大, 主要在3个区域表达: 担轮环细胞、腹侧细胞和顶部细胞(图 5)。其中, 在担轮环的两排细胞中表达量较高, 呈带状(图 5a—i); 在身体后部腹侧中央区域的表层细胞中存在较大面积的表达(图 5d—i), 近似“倒三角”状; 在幼虫顶端的表达范围很小, 呈点状(图 5d—i), 位于外胚层和中胚层交界处, 可能在外胚层基部。与其他软体动物不同的是, AR-tyr1在石鳖的贝壳发育区不表达。
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| 图 5 AR-tyr1在24~48 hpf的表达模式 Fig. 5 Expression patterns of AR-tyr1 in 24–48 hpf (hours post fertilization) 注: AR-tyr1信号在石鳖幼虫中的分布。在顶部的信号用黑色无尾箭头指示, 担轮环处信号用黑色箭头指示, 腹侧信号用白色箭头指示。白色叉号指示的为非特异性信号。dorsal背侧视图, lateral侧面视图, ventral腹侧视图, pt担轮环, sf贝壳发育区, gf贝壳发育区外周的环带发育区, cr贝壳发育区的中央区域 |
AR-tyr2在石鳖中表达的区域和AR-tyr1大致类似, 都在担轮环细胞、腹侧外胚层细胞和顶部细胞中表达, 但信号的排布模式有所不同(图 6)。在担轮环的细胞中, AR-tyr2的信号表现出明显的胞内聚集现象(图 6a—i), 呈圆斑状, 其原因和意义尚不清晰。AR-tyr2在幼虫躯干部腹侧多数外胚层细胞中都表达(图 6d—i)。与AR-tyr1相比(图 5d—i), AR-tyr2的表达面积明显更大。在幼虫的头部外胚层中, AR-tyr2有广泛的表达(图 6a—i), 表达模式没有明显规律, 但是表达区域比AR-tyr1的表达区域大。与AR-tyr1相同的是, 它们都不在石鳖的贝壳发育区细胞中表达。
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| 图 6 AR-tyr2在24~48 hpf的表达模式 Fig. 6 Expression patterns of AR-tyr2 in 24–48 hpf (hours post fertilization) 注: AR-tyr2信号在石鳖幼虫中的分布。在顶部的信号用黑色无尾箭头指示, 担轮环处信号用黑色箭头指示, 腹侧信号用白色箭头指示。白色叉号指示的为非特异性信号。dorsal背侧视图, lateral侧面视图, ventral腹侧视图, apical顶部视图, pt担轮环, sf贝壳发育区, gf贝壳发育区外周的环带发育区, cr贝壳发育区的中央区域 |
AR-bmp2/4在幼虫顶部、担轮环、腹侧表面和背侧的中胚层细胞中表达。顶部的信号更靠近背侧, 呈现出多个细胞(图 7a—f, j—l)半包围一个中心细胞(图 7a, c, j—l)的模式。其中, 中心细胞很可能是顶纤毛细胞。在担轮环上的信号呈线状, 环绕幼虫整个身体(图 7a—i, m—o)。这些信号的分布部位明显位于担轮环的内侧, 可能是紧邻担轮环的神经或肌肉细胞。在背侧中胚层中的信号由两部分组成, 一部分靠近担轮环正中间位置, 在其内侧的中胚层有一个短竖线状的表达(图 7a—c), 另一部分在担轮环下方的中胚层中呈横向成对排列、呈“V”形的信号(图 7a—f), 从24 hpf到48 hpf, 成对信号逐渐靠近。从侧面看, 这些信号形成了一条在背侧中胚层中紧贴身体的线(图 7d—f)。在幼虫的腹侧, 担轮环下方有几个细胞的表达(图 7g—i), 躯干部分的表层细胞有少量信号表达, 但是没有明显的排布规律(图 7d, f—i)。
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| 图 7 AR-bmp2/4在24~48 hpf的表达模式 Fig. 7 Expression patterns of AR-bmp2/4 in 24–48 hpf (hours post fertilization) 注: AR-bmp2/4信号在石鳖幼虫中的分布。在顶部的信号用黑色和白色无尾箭头指示, 其中白色无尾箭头指示顶部表达该基因的细胞里处于中心位置的细胞, 黑色无尾箭头指示顶部表达该基因的细胞中位于外周的细胞。担轮环处信号用紫色箭头指示, 腹侧信号用黑色双箭头和黑色箭头指示, 其中黑色双箭头指示靠近担轮环处的信号, 黑色箭头指示腹侧躯干部位的信号, 背侧信号用白色双箭头和白色箭头指示, 白色双箭头指示靠近担轮环处的信号, 白色箭头指示背侧中胚层的信号。dorsal背侧视图, lateral侧面视图, ventral腹侧视图, apical1顶部视图, apical2更深部焦面的顶部视图, pt担轮环, sf贝壳发育区, gf贝壳发育区外周的环带发育区, cr贝壳发育区的中央区域 |
AR-gata2/3在石鳖贝壳发育区的几乎所有细胞中都表达, 涵盖了贝壳发育区中央区域(central region, cr)以及外周的环带发育区(girdle field, gf)(图 8a—f)。其中, 贝壳发育区中央区域包括凹陷的壳板形成区(shell plate field, pf)和凸起的脊(ridge, ri)(图 8e—f)。AR-gata2/3的表达区域被不表达该基因的担轮环区域隔开(图 8a—c)。由于石鳖背部的脊凸起, 而壳板形成区凹陷, 在显微镜下呈现出明显的7条条纹状信号(图 8a—c), 但仔细观察表明脊部的表达水平并不比壳板形成区高。同时, AR-gata2/3也在腹侧表达, 呈两条纵向“索”状的信号表达模式(图 8g—i), 与腹神经索的部位大致重合。
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| 图 8 AR-gata2/3在24~48 hpf的表达模式 Fig. 8 Expression patterns of AR-gata2/3 in 24–48 hpf (hours post fertilization) 注: AR-gata2/3信号在石鳖幼虫中的分布。在腹侧的信号用白色箭头指示。dorsal背侧视图, lateral侧面视图, ventral腹侧视图, pt担轮环, sf贝壳发育区, gf贝壳发育区外周的环带发育区, cr贝壳发育区的中央区域, ri贝壳发育区中央区域中突起的脊, pf贝壳发育区中央区域中凹陷的壳板形成区 |
在多种软体动物的研究中发现, 虽然贝壳的形态结构具有多样性, 但是其早期发育过程在物种之间相对保守[6], 而且许多贝壳发育基因在不同种类有壳亚门软体动物中的表达模式也十分相似。本文利用整装原位杂交的方法, 研究了4个典型的贝壳形成相关基因(AR-tyr1、AR-tyr2、AR-bmp2/4、AR-gata2/3)在红条毛肤石鳖中表达模式。令人惊讶的是, 这4个基因在石鳖中的表达模式与在有壳亚门软体动物中截然不同, 提示有刺亚门软体动物的贝壳发育与有壳亚门软体动物间存在显著的差异。
酪氨酸酶是3型铜蛋白超家族的成员[33], 有2个保守的铜结合结构域[34], 具备氧化酶活性, 因其在黑色素合成中发挥关键的生物学作用而广为人知[35]。在软体动物中, 酪氨酸酶有生物合成[36]、色素沉着[24]和生物矿化[37]的作用。在马氏珠母贝Pinctada fucata中发现三种酪氨酸酶基因, 其中Pfty1和Pfty2参与棱柱层的色素沉着[24], OT47参与角质层形成[25]。此前课题组在长牡蛎C. gigas中发现cgi-tyr1在幼虫贝壳发育的初始阶段发挥作用[36], 参与贝壳生长。对北戴河笠贝Lottia peitaihoensis (曾称Lottia goshimai) 的研究发现lpe-tyr1在担轮幼虫的贝壳发育区特异性表达, 而且该基因在贝壳发育区的边缘和中央区域表达模式不同[38]。对皱纹盘鲍Haliotis discus hannai的研究发现, Hdi-tyr1和Hdi-tyr2基因在幼虫贝壳发育区特异性表达, 表达区域紧密相邻[39]。
上述研究表明酪氨酸酶广泛参与了有壳亚门贝壳形成的多个方面, 然而在红条毛肤石鳖中的研究结果却与之不同。虽然AR-tyr1和AR-tyr2在石鳖广泛的区域内表达, 但是基本不在贝壳形成相关的细胞中表达, 这提示酪氨酸酶可能不参与贝壳形成。这与在其他软体动物中观察到的酪氨酸酶与贝壳形成高度关联[36, 38]的现象存在巨大差异。对于这种“反常”现象背后的原因, 推测有以下几种可能。首先, Hass等[40]提到石鳖只有一层很薄且不完全聚合的有机物膜, 而不是像有壳亚门软体动物一样在钙质结构上覆盖着由有机聚合物(鞣质蛋白质)组成的真正角质层。他将石鳖中这种类似角质层的结构命名为“properiostracum”。酪氨酸酶基因不在石鳖的贝壳发育区表达可能因为properiostracum不像真正的角质层一样需要酪氨酸酶参与合成。其次, 本研究只关注了早、中期担轮幼虫(24~48 hpf)时期。在此阶段没有检测到酪氨酸酶基因的表达, 不能代表在其他发育阶段不表达。有蛋白质组学研究指出石鳖成体贝壳的壳基质蛋白中含有酪氨酸酶, 它可能参与构成石鳖成体的贝壳[41]。这提示在石鳖的贝壳形成后可能有酪氨酸酶表达, 但是本研究关注的发育阶段中石鳖的贝壳尚未形成, 因此未能检测到其表达。
AR-tyr1和AR-tyr2信号的分布可能与神经细胞或感觉细胞相关。据前期研究, 酪氨酸酶基因表达的3个区域都分布有神经和感觉细胞[42]。在石鳖的顶部及腹侧分别有顶感受器和主要的神经系统结构, 即侧神经索与足神经索。此外, Voronezhskaya等[43]在Ischnochiton hakodadensis中发现担轮环前部区域有许多树突结构, 这种结构延伸到幼虫表皮的感觉细胞。石鳖的担轮环内部也有神经相关组织分布。Vöcking等[44]通过原位杂交的方法发现鳞侧石鳖L. asellus的神经相关基因表达在担轮环上。这些观察与石鳖的酪氨酸酶基因在担轮环前部及担轮环细胞上的表达模式相吻合。此外, 虽然AR-tyr1和AR-tyr2表达范围大体相同, 但是仍然存在着明显的差别: 在担轮环上, 分别呈现出带状和环绕整个幼虫身体的圆斑状表达模式(二者位置可能相邻甚至部分重合); 在腹侧, 虽然信号的分布都为弥散状, 但AR-tyr2的表达区域略大于AR-tyr1的表达区域; 在头部, AR-tyr1在外胚层基部呈点状表达, 而AR-tyr1的信号在表层细胞中弥散排布。以上实验结果提示, 虽然两种酪氨酸酶基因可能都与神经系统相关, 但是二者可能执行不同的功能。
BMP是骨发生蛋白的简称[45], 属于TGF-β超家族[46]。BMP家族成员BMP2/4(在部分节肢动物中称作DPP)与软体动物贝壳发育高度相关。早在2002年即发现腹足纲动物帽贝Patella vulgata的dpp在贝壳发育区的外缘细胞中表达, 可能负责建立贝壳发育区的边界[27]。之后在多种其他软体动物中也发现了bmp2/4在贝壳发育区的外周区域表达的现象。比如在腹足纲动物Nipponacmea fuscoviridis中, bmp2/4表达在幼虫的贝壳发育区边缘, 抑制bmp2/4的表达后会阻碍壳区边缘细胞的增殖[47]。此前, 课题组在长牡蛎C. gigas的研究中发现, bmp2/4参与了从贝壳发育区开始分化到早期贝壳形成的全过程[48]。bmp2/4除了参与早期的贝壳形成过程, 还参与生物矿化作用: 在Haliotis diversicolor中, Hd-bmp2/4在外套膜皱褶和外套膜边缘的角质层沟处表达, 参与棱柱层和珍珠层的形成[49]; 在马氏珠母贝P. fucata中, bmp-2在外套膜处高表达, 参与贝壳珍珠层的形成[50]。从某种意义上, bmp2/4是最早发现和被广泛研究及认可的贝壳发育基因之一。
令人十分意外是, 在石鳖中并没有发现AR-bmp2/4在贝壳发育区的表达, 提示该基因与石鳖贝壳发育的相关性不强。相反, AR-bmp2/4在背部外胚层表达量很低, 主要呈“V”字型表达在背部中胚层, 这在软体动物中十分少见。在课题组对北戴河笠贝L. goshimai的研究中发现, 4d卵裂球向双侧对称分裂形成两条胚胎组织, 即中胚层带(mesodermal band)。其更靠近背侧, 也呈“V”字型, 并且表达twist1、snail1等中胚层标记基因[51]。此外, 在多板纲动物Acanthochitona fascicularis的研究中也发现中胚层标记基因Mox1的早期表达呈“V”字型[52], 与我们观察到的AR-bmp2/4表达模式类似。这些证据提示, AR-bmp2/4可能参与中胚层带的形成。此外, AR-bmp2/4在顶部、腹侧的表达与神经组织的分布重合度比较高, 似乎提示了其在神经系统发育中发挥作用。
GATA是广泛分布在多细胞生物中的转录因子家族[53], 它通常分为两个亚家族, GATA1/2/3和GATA4/5/6[32]。它们包含2个高度保守的锌指结构域, 即N端锌指和C端锌指。其中C端锌指结构用于与DNA结合, N端锌指结构负责与其他辅助因子相互作用从而稳定与DNA的结合[54-55]。gata是BMP信号通路的下游基因[56], 参与软体动物的造血[57]和贝壳形成[58]。在扇贝Chlamys farreri中发现, Cfgata在鳃和肝胰腺中表达量最高, 抑制其表达后血细胞更新频率和循环显著降低, 这提示了它可能参与并调节血细胞的产生[59]。此前课题组研究了cgi-gata2/3在长牡蛎C. gigas早期发育过程中的表达模式, 观察到cgi-gata2/3表达于贝壳发育区的外缘和腹侧, 结果提示该基因可能参与长牡蛎贝壳的形成[58], 这是gata2/3参与贝壳形成的首次报道。之后在北戴河笠贝L. goshimai的研究中发现gata2/3在幼虫贝壳发育区外缘细胞中连续表达, 参与贝壳形成的早期过程[60]。
AR-gata2/3在石鳖贝壳发育区的所有细胞中都表达, 这一结果表明AR-gata2/3与贝壳发育显著相关。gata2/3不仅参与有壳亚门软体动物贝壳的形成, 也参与有刺亚门软体动物贝壳的形成。但是gata2/3在2个类群中的表达模式明显不同。如上文所述, gata2/3仅在有壳亚门软体动物贝壳发育区的外缘表达[58, 60], 而该基因在石鳖贝壳发育区的所有细胞中表达。这说明gata可能在有壳亚门和有刺亚门软体动物贝壳发育的过程中发挥着不同功能。其次, 尽管AR-gata2/3与贝壳形成相关, 但是与石鳖的其他贝壳形成基因相比, 它们的表达模式也大不相同。此前已经发现很多基因与石鳖的贝壳形成相关, 比如hox1-5在贝壳发育区特定的条带状区域中表达[28], engrailed也在贝壳发育区呈现出7条条带的表达模式[61-62]。这些基因的条带状表达模式与石鳖早期的7个壳板原基相对应, 说明它们在贝壳发育区的特定细胞群中发挥功能。但是AR-gata2/3与这些基因的表达模式都不相同, 它广泛地在贝壳发育区所有细胞中表达, 提示AR-gata2/3执行的功能可能与石鳖其他的贝壳形成基因不同。AR-gata2/3这种广泛而特异性表达于石鳖贝壳发育区的表达规律也使其成为石鳖贝壳发育区的理想分子标记。
4 结论综上所述, 本研究展示了4个典型的贝壳发育相关基因(AR-gata2/3、AR-bmp2/4、AR-tyr1、AR-tyr2)在石鳖早期贝壳发育区的表达模式。研究结果发现它们在石鳖中的表达模式均不同于在有壳亚门软体动物中的表达模式, 其中仅AR-gata2/3与贝壳发育相关, 提示了有刺亚门软体动物的贝壳与有壳亚门软体动物的贝壳不仅数量和结构有所差异, 而且背后的分子调控机制也存在显著的差别, 这为深入理解软体动物贝壳的同源性和演化历史提供了支持。
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