2025, Vol. 49
文章信息
- 李锦, 黄洋, 茹笑影, 陈培培, 杨佳慧, 杨桐林, 朱琨锋, 邹一帆, 朱春华. 2025.
- LI Jin, HUANG Yang, RU Xiaoying, CHEN Peipei, YANG Jiahui, YANG Tonglin, ZHU Kunfeng, ZOU Yifan, ZHU Chunhua. 2025.
- 配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼消化道结构功能、免疫及抗氧化能力的影响
- Formulated feed induced structural, functional, immunity-related, and antioxidant capacity changes in the digestive tracts of juvenile greater amberjack (Seriola dumerili)
- 海洋科学, 49(6): 48-63
- Marine Sciences, 49(6): 48-63.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20241221001
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文章历史
- 收稿日期：2024-12-21
- 修回日期：2025-03-21
2. 南方海洋科学与工程广东省实验室, 广东 湛江 524025
2. Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory, Zhanjiang 524025, China
高体鰤(Seriola dumerili)又名章红鱼、红甘鱼, 隶属于鲈形目(Perciformes)、鲹科(Carangidae)、鰤属(Seriola), 为暖水性中上层海洋鱼类, 在中国沿海、夏威夷群岛和地中海等地的热带及亚热带海域均有分布[1]。高体鰤生长迅速、肉质鲜美, 备受消费者的欢迎。2023年我国鰤鱼养殖产量达19 352万吨, 主产于广东、福建沿海[2]。目前, 我国高体鰤网箱养殖投喂的饲料仍以冰冻的鲣鱼(Katsuwonus pelamis)、玉筋鱼(Ammodytes personatus)和沙丁鱼(Sardina pilchardus)等冰鲜杂鱼为主, 尚未成功研制出其专用的配合饲料[3]。鉴于高体鰤生长快, 对饵料需求量大, 且养殖环境远离陆地, 补给困难, 导致投喂难度大和成本高。随着高体鰤养殖业规模扩大, 对饵料的品质和数量要求更高。尽管投喂冰鲜杂鱼在一定程度上能够提升鱼肉营养价值和生长速度, 但冰鲜杂鱼的质量参差不齐, 饵料系数高, 易污染海域, 增加病害风险[4]。配合饲料作为一种经过科学调配的饲料, 在养殖业中得到了广泛运用。其可以平衡饲料中的营养成分, 提高营养价值, 并显著提升饲料的转化率, 同时减少营养物质在水体中的流失程度, 降低病害的发生, 从而展现出其环境友好型养殖特性[5]。因此, 成功研制高体鰤幼鱼配合饲料, 降低饲料成本及病死率, 对促进高体鰤养殖业的健康持续发展具有积极意义。
人工配合饲料和冰鲜杂鱼养殖对比实验已在各种经济鱼类中相继开展, 由于鱼种、饲料配方及养殖环境的差异, 配合饲料对鱼类生长性能产生的影响也有所不同。在胡椒鲷(Plectorhinchus)[4]和青石斑鱼(Epinephelus awoara)[6]的研究中, 投喂配合饲料的存活率与饲料效率高于投喂冰鲜杂鱼。在对大口黑鲈(Micropterus salmoides)[7]和黄姑鱼(Nibea albiflora)[8]的研究中发现, 配合饲料组鱼的特定生长率与冰鲜杂鱼组无显著差异, 且饲料系数更低。这些研究证明了配合饲料替代冰鲜杂鱼的可行性。饲料对消化和免疫功能的影响非常显著。在大黄鱼(Larimichthys crocea)的研究中发现, 配合饲料能够提高大黄鱼的抗氧化能力, 适宜蛋白质水平的软颗粒配合饲料能改善大黄鱼幼鱼的消化酶活性[9]。在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)中, 饲料中添加50~ 100 mg/kg γ-氨基丁酸可提高黄颡鱼胃、肝胰腺和肠道消化酶活性[10]。在黄鳝(Monopterus albus)的研究中, 配合饲料组黄鳝血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性比冰鲜杂鱼组明显降低, 表明配合饲料缓解了肝损伤[11]。因此, 配合饲料相较于冰鲜杂鱼不仅能提高水产动物的消化能力, 还能一定程度上提高免疫力。
目前, 国内外对高体鰤的相关研究主要集中在网箱养殖[12]、人工繁育技术[13]、性别鉴定[14]、生态环境胁迫[15]和饲料添加[16]等方面。研究发现, 配合饲料中组氨酸含量从1 %增加至1.5 %可以提高高体鰤亲鱼的繁殖性能, 且添加一定量的牛磺酸可以增加繁殖力, 保持鱼卵良好的受精率[17]。膳食中补充姜黄素可以提高非特异性免疫反应和抗氧化能力, 并增强高体鰤幼鱼对高氨胁迫的抵抗力[18]。此外, 在日粮中添加肌酐能增强高体鰤幼鱼的免疫力[19]。而日粮中添加30 g/kg以上的核苷副产物可以改善高体鰤幼鱼的非特异性免疫能力[20]。综上所述, 开发高体鰤专用配合饲料具有可行性。本实验通过投喂配合饲料和冰鲜杂鱼, 探讨配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼消化道指数、消化酶活性、肠道组织结构、菌群多样性、血清生化指标、免疫相关基因表达以及抗氧化能力的影响, 以期为成功研发高体鰤幼鱼配合饲料提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验饲料本研究开发的人工配合饲料配方和营养成分参考我们之前的研究(表 1)[3], 高体鰤幼鱼配合饲料委托广东越群生物科技股份有限公司(揭阳)代加工, 冰鲜杂鱼是以冰冻的鲣鱼、玉筋鱼和沙丁鱼为主要种类, 取自福建省东山县本地市场。配合饲料与冰鲜杂鱼营养成分委托四川威尔检测技术股份有限公司(成都)检测(表 2)[3]。
| 原料 | 质量分数/% |
| 鱼粉 | 45.00 |
| 面粉 | 10.00 |
| 去皮豆粕 | 10.00 |
| 鸡肉粉 | 5.00 |
| 谷朊粉 | 5.00 |
| 全虾粉 | 10.00 |
| 发酵豆粕 | 5.00 |
| 豆油 | 3.00 |
| 鱼油 | 3.00 |
| 磷酸二氢钙 | 1.50 |
| 多维1 | 0.40 |
| 多矿1 | 0.50 |
| 磷脂 | 1.00 |
| 氯化胆碱 | 0.20 |
| 维生素C磷酸酯V | 0.10 |
| 牛磺酸 | 0.10 |
| 赖氨酸 | 0.10 |
| 蛋氨酸 | 0.10 |
| 总和 | 100.00 |
| 注︰标有1的多维和多矿均由广东越群生物科技股份有限公司提供 | |
| 营养成分 | 配合饲料组S | 冰鲜杂鱼组B |
| 水分 | 5.90 | 71.40 |
| 粗蛋白 | 51.25 | 16.70 |
| 粗脂肪 | 13.20 | 7.80 |
| 粗灰分 | 16.70 | 3.10 |
实验用鱼为南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)2022年5月人工繁育的鱼苗。高体鰤为肉食性鱼类, 实验前须进行驯食: 每日投喂2次, 交替使用配合饲料与冰鲜杂鱼投喂, 直到连续1周投喂的配合饲料全被高体鰤幼鱼摄食, 并且水面无配合饲料残留, 此时驯食完成。
实验在福建省东山县富闽洋水产发展有限公司岐下村鱼排网箱(2 m×2 m×4 m)中进行养殖, 养殖海域水温22.0±4℃, 溶解氧5.9~8.7 mg/L, 盐度27.2~27.5, pH 8.0~8.2, 氨氮 < 0.02 mg/L, 亚硝酸盐 < 0.01 mg/L。
挑选180尾大小相近(初始均体质量274.93± 11.17 g、体长22.59±1.67 cm)的健康高体鰤幼鱼随机分为2组, 分别为配合饲料组(S)(仅投喂配合饲料)和冰鲜杂鱼组(B)(仅投喂冰鲜杂鱼), 每组设置3个平行, 每个平行网箱放30尾鱼。每天投喂量依据当天的天气情况、水温高低及鱼类摄食欲望强弱而定, 每日记录各网箱鱼的摄食量(投喂量–残留量)和健康状况及死亡情况, 进行60 d的养殖实验。
1.3 样品采集与处理实验开始时停食24 h, 每组随机挑选10尾鱼测量初始体质量。经过60 d的养殖实验后, 采样前停食24 h, 每组各随机挑选10尾鱼, 使用100 mg/L的丁香酚麻醉后用三角尺测量其体长和体质量, 再置于冰盘上进行尾静脉采血。血样于4 ℃冰箱中静置2 h, 在4 ℃, 3 500 r/min离心10 min制备血清, 后上清液移置–80 ℃超低温冰箱中保存备用, 制备2管血清, 一份用于血清生化指标检测, 另一份用于抗氧化酶活性检测。
取血后立即解剖高体鰤幼鱼采集肝脏、胃和肠道等组织, 用电子秤和三角尺测量其内脏团质量、肝质量、胃质量、幽门盲囊质量、肠质量和肠长用于计算消化道指数。胃组织置于无菌离心管内用于消化酶活性的测定; 取4份肠道组织, 2份置于无菌离心管内用于消化酶和抗氧化酶活性的测定; 1份置于Bouin′s液中固定, 用于组织学切片观察; 1份将内容物轻轻挤出后置于无菌离心管中用于肠道菌群的检测。另取3份肝脏组织, 2份用于测量消化酶和抗氧化酶活性; 1份剪碎置于RNALaterTM动物组织RNA稳定保护液中用于测定免疫相关基因的表达水平, 于4℃过夜后, 迅速转移至–80 ℃超低温冰箱中保存。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 消化道结构功能测定 1.4.1.1 消化酶活性测定消化酶活性的测定参照侯冬强[10]的方法测定, 将胃、肠道和肝脏样品进行解冻–冲洗–匀浆–离心–取上清液, –20 ℃保存, 用于胃、肠道和肝脏消化酶活性的测定。其中胃蛋白酶(Pepsase)、脂肪酶(Lipase)、α-淀粉酶(α-amylase)均采用南京建成试剂盒测定, 胰蛋白酶(Trypsin)用苏州格锐思试剂盒测定。酶活性单位采用U/mg和U/g等单位表示。
1.4.1.2 消化道指数测定消化道指数的测定参照尾崎久雄[21]的方法测定。相关计算公式如下:
脏体比(Ratio viscera to BW, %)＝100×内脏团质量/终末体质量;
肝体比(Ratio of hepatopancreas to BW, %)＝100×肝脏质量/终末体质量;
胃体比(Ratio of stomach to BW, %)＝100×胃质量/终末体质量;
幽门盲囊体比(Ratio of pyloric caecum to BW, %)＝100×幽门盲囊质量/终末体质量;
肠体比(Ratio of intestine to BW, %)＝100×肠道质量/终末体质量;
肠长比(Ratio of intestine to BL, %)＝100×肠道长/体长;
成活率(Survival rate, SR, %)＝100×终末鱼的尾数/初始鱼的尾数
1.4.1.3 肠道组织结构的观察将肠道组织横切取小段, 置于Bouin’s液中固定24 h, 通过梯度酒精进行脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋后、用石蜡切片机进行连续切片(5 μm), 经苏木精/伊红(HE)染色, 中性树脂封片, 使用正置荧光显微镜(尼康公司, 日本)进行观察拍照。
1.4.1.4 肠道菌群结构分析细菌16S rRNA (V3-V4)片段的扩增引物为341F (CCTACGGGNGGCWGCAG)和806R(GGACTACHVG GGTATCTAAT), 应用Illumina PE250完成序列测序。对原始数据进行拼接、过滤和去除嵌合体等多个数据处理过程后最终获得有效序列。采用QIIME2软件对样品序列进行多样性分析, 其中, Alpha多样性分析包括ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数的分析; 不同水平上各Rank的丰度值采用STAMP软件比较样本或组间丰度差异, 构建基于门和科的物种分布图。基于物种分类结果对不同饲料喂养的高体鰤幼鱼肠道样品进行LEfSe分析, 构建差异菌群物种信息树状图, 在LDA判别值> 2的判定标准下筛选在不同养殖密度组中存在显著差异(P < 0.05)的菌群。高通量测序分析由广州基迪奥生物科技有限公司完成, 数据分析利用Omicsmart Cloud平台(www.omicsmart.com)完成。
1.4.2 免疫指标测定 1.4.2.1 血清生化指标测定谷丙转氨酶(Glutamic pyruvic transaminase, ALT)、谷草转氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase, AST)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein, HDL-C)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)、甘油三脂(Triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL-C)、总胆固醇(Total cholesterol, TC)等血清生化指标均使用山东博科生物产业有限公司生产的试剂盒测定。
1.4.2.2 免疫相关基因表达测定利用Trizol试剂盒(Invitrogen, 15 596 108, 美国)提取肝脏总RNA, 方法参照说明书。总RNA用2000超微量核酸蛋白测定仪(Thermo Scientific, 美国)检测其浓度和质量, 用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性, 再放入–80 ℃冰箱中保存。
应用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa, RR047A, 日本)进行cDNA合成。
采用qPCR检测高体鰤幼鱼肝脏中免疫相关基因的表达水平。反应在Roche light Cycler 96实时荧光定量PCR仪(Roche, 瑞士)上进行。qPCR参照SYBR Gree Real Time PCR Master Mix (TOYOBO, QPK-201, 日本)试剂盒的说明书进行, 反应体系为: SYBR Gree Real Time PCR Master Mix 10 μL, 上下游引物各0.5 μL, cDNA模板1 μL, 用无酶水补齐至20 μL。反应程序为: 95 ℃ 300 s预变性; 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s(收集信号), 40个循环; 95 ℃ 10 s, 65 ℃ 60 s, 97 ℃ 1 s; 37 ℃ 30 s。高体鰤幼鱼免疫相关基因引物及内参基因β-actin引物序列见表 3, 引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所有实验重复2次。
| 引物 | 正向引物序列(5′→3′) | 反向引物序列(5′→3′) |
| il-6 | F: AGTTTGTCTCCGCTGGGTG | R: ATCAGGCCCTGGCTGTTGT |
| il-10 | F: CAGTGTTGTCGTTTCGTGGAG | R: ATGCTGTTCATTGCGTGGC |
| MyD88 | F: CTCTGTCCTGGAGCCCGAAAT | R: TGCGTGCATGGTCTGGTGTAG |
| TGF-β2 | F: CTCCGCACCTTCTGCTCAT | R: TGGCGTCATATCCCTTTGG |
| c3 | F: ATTCGCCTGGAACGGATTGA | R: TGCCCATGATAAGGTAGGTTT |
| Tnf-α | F: GGGTCAGTTGCACAAGCAG | R: TACGGCGGTGTACCAGTTT |
| β-actin | F: TGATGAAGCCCAGAGCAAGAG | R: CGTTGTAGAAGGTGTGATGCCA |
血清和肝脏中总抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)的测定均使用南京建成试剂盒, 参考试剂盒说明书测定。
1.5 统计分析使用Excel 2010整理实验数据, SPSS 16.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA), 用独立样本t检验方法比较两组间的差异性, 实验数据使用平均值±标准差(Mean±SD)表示, 以P < 0.05表示差异显著, P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼消化道结构功能的影响 2.1.1 配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼消化道指数的影响如表 4, 配合饲料替代冰鲜杂鱼会使高体鰤幼鱼的胃体比显著降低(P < 0.05), 终末体质量和终末体长极显著降低(P < 0.01), 肠体比显著增加(P < 0.05)。但对两组间幼鱼脏体比、肝体比、幽门盲囊体比、肠长比和成活率无显著差异影响(P > 0.05)。
| 项目 | 组别 | |
| 配合饲料组S | 冰鲜杂鱼组B | |
| 初始体质量/g | 274.93±11.17 | 274.93±11.17 |
| 终末体质量/g | 476.00±2.19 | 557.10±1.65** |
| 终末体长/g | 26.94±0.09 | 28.77±0.13** |
| 脏体比/(×10–2 %) | 5.87±0.38 | 5.93±0.84 |
| 肝体比/(%) | 0.14±0.00 | 0.13±0.00 |
| 胃体比/(×10–2 %) | 1.52±0.28 | 1.82±0.22* |
| 幽门盲囊体比/(×10–2 %) | 1.71±0.14 | 1.62±0.14 |
| 肠体比/(×10–2 %) | 1.38±0.20* | 1.17±0.13 |
| 肠体长/% | 0.78±0.13 | 0.72±0.13 |
| 成活率/% | 97.79 | 95.47 |
| 注: 表中标有*者表示组间有显著性差异(P < 0.05), 标有**者表示组间差异极度显著(P < 0.01), 无标注者表示组间无显著性差异(P > 0.05) | ||
配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼不同组织蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的影响如表 5。配合饲料替代冰鲜杂鱼投喂60 d后, 2组间高体鰤幼鱼肠道和胃的胃蛋白酶, 肝脏的胰蛋白酶, 肠道、胃和肝脏的脂肪酶和淀粉酶活性均无显著差异(P > 0.05), 唯有配合饲料组肠道胰蛋白酶活性显著高于冰鲜杂鱼组(P < 0.05)。
| 指标 | 组别 | |
| 配合饲料组S | 冰鲜杂鱼组B | |
| 肠道 | ||
| 胃蛋白酶/(U·mg prot–1) | 2.50±0.91 | 2.82±0.90 |
| 胰蛋白酶/(U·mg prot–1) | 7.47±1.74* | 3.70±1.74 |
| 脂肪酶/(U·g prot–1) | 100.51±24.26 | 105.72±22.59 |
| α-淀粉酶/(U·mg prot–1) | 0.69±0.07 | 0.70±0.11 |
| 胃 | ||
| 胃蛋白酶/(U·mg prot–1) | 2.10±0.45 | 2.25±0.24 |
| 脂肪酶/(U·g prot–1) | 110.74±17.94 | 101.24±13.39 |
| α-淀粉酶/(U·mg prot–1) | 0.62±0.06 | 0.67±1.45 |
| 肝脏 | ||
| 胰蛋白酶/(U·mg prot–1) | 2.53±0.23 | 2.73±0.25 |
| 脂肪酶/(U·g prot–1) | 38.13±6.25 | 40.23±5.20 |
| α-淀粉酶/(U·mg prot–1) | 0.23±0.02 | 0.27±0.04 |
| 注: 表中标有*者表示组间有显著性差异(P < 0.05), 无标注者表示组间无显著性差异(P > 0.05) | ||
肠道切片形态结构显微观察结果如图 1所示, 两组高体鰤幼鱼肠道黏膜组织清晰规整, 染色鲜明, 层次分明。由表 6可知, 与冰鲜鱼组相比, 配合饲料组高体鰤幼鱼肠道绒毛长度显著增加(P < 0.05), 而尽管肌层厚度和绒毛宽度有增加, 但和肠道褶皱数量一样, 无显著差异。
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| 图 1 配合饲料替代冰鲜杂鱼投喂高体鰤幼鱼8周后对肠道组织结构的影响 Fig. 1 Effects of replacing chilled trash fish with formulated feed on the intestinal tissue structure of Seriola dumerili juveniles fed for 8 weeks 注: 1~3: 冰鲜杂鱼组; 4~6: 配合饲料组; PW-绒毛宽度; PL-绒毛长度; MT-肌层厚度; GC-杯状细胞; IV-微绒毛 |
| 组别 | 肌层厚度/μm | 绒毛长度/μm | 绒毛宽度/μm | 肠道褶皱量/ind. |
| 冰鲜杂鱼组B | 329.00±9.64 | 800.40±161.27 | 60.20±11.91 | 74.67±8.33 |
| 配合饲料组S | 356.67±49.33 | 1 139.91±132.88* | 64.67±4.32 | 74.67±14.05 |
| 注: 表中标有*者表示组间有显著性差异(P < 0.05), 无标注者表示组间无显著性差异(P > 0.05) | ||||
对高体鰤幼鱼肠道进行高通量测序。结果如图 2所示, 冰鲜杂鱼组和配合饲料组特有的OTU数目分别是190个和27个, 共有OTU数目为73个, 冰鲜杂鱼组特有微生物种类多于配合饲料组。根据测序所获得的OTU分类及其丰度信息, 对各样本的Alpha多样性分析的结果见图 3, 相比于冰鲜杂鱼组, 配合饲料组的ACE指数、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数有所降低, 但无显著性差异(P > 0.05), 即两组间肠道微生物群落多样性和物种均匀度相似。
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| 图 2 配合饲料替代冰鲜杂鱼投喂高体鰤幼鱼8周后高体鰤幼鱼的肠道菌群共有OTU分析 Fig. 2 Analysis of the OTUs among intestinal microbiota of Seriola dumerili juveniles after 8 weeks of feeding on chilled trash fish with formulated feed replacement |
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| 图 3 肠道细菌群落Alpha多样性指数(ACE、Chao1、Shannon和Simpson) Fig. 3 Alpha-diversity indices (ACE, Chao1, Shannon, and Simpson) of the gut bacterial community |
基于门水平, 两组高体鰤幼鱼肠道丰度前10的优势菌门见图 4a。从图 4a可以看出, 变形菌门(Proteobacteria)作为冰鲜杂鱼组和配合饲料组高体鰤幼鱼肠道中的绝对优势菌门, 其中冰鲜杂鱼组中变形菌门占总数量的98.85 %, 配合饲料组中变形菌门更是占了总数量的97.79 %。
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| 图 4 细菌群落在门、科水平结构组成 Fig. 4 Structural composition of the gut bacterial communities at the phylum and family level |
在科水平上, 弧菌科(Vibrionaceae)是冰鲜杂鱼组高体鰤幼鱼肠道中的绝对优势菌科。配合饲料组高体鰤幼鱼肠道中有2个优势菌科, 为弧菌科和莫拉氏菌科(Moraxellaceae)。和冰鲜杂鱼组相比, 莫拉氏菌科在配合饲料组中的数量显著高于冰鲜杂鱼组(P < 0.05)。
在属水平上如表 7所示, 配合饲料组高体鰤幼鱼肠道优势菌为发光杆菌属(Photobacterium)(占71.94 %)和弧菌属(Vibrio)(占25.76 %)。冰鲜杂鱼组高体鰤幼鱼肠道优势菌为发光杆菌属(占77.24 %)、弧菌属(占11.97 %)和不动杆菌属(Acinetobacter)(占7.61 %)。配合饲料组中弧菌属的数量显著升高(P < 0.05), 不动杆菌属的数量极显著降低(P < 0.01)。
| 分类 | 丰度/% | |
| 冰鲜杂鱼组B | 配合饲料组S | |
| 发光杆菌属Photobacterium | 77.24 | 71.94 |
| 弧菌属Vibrio | 11.97 | 25.76* |
| 不动杆菌属Acinetobacter | 7.61** | 0.37 |
| 枸橼酸杆菌属Citrobacter | 0.13 | 0.14 |
| Pelomonas Pelomonas | 0.19 | 0.08 |
| 鲸杆菌属Cetobacterium | 0.03 | 0.02 |
| 特布尔西菌属Trabulsiella | 0.06 | 0.02 |
| 杆菌属Bacillus | 0.32 | 0.20 |
| 假单胞菌属Pseudomonas | 0.12 | 0.06 |
| 邻单胞菌属Plesiomonas | 0.01 | 0.01 |
| 其他 | 0.53 | 0.70 |
| 未知分类 | 1.74 | 0.63 |
| 注: 表中标有*者表示组间有显著性差异(P < 0.05), 标有**者表示组间差异极度显著(P < 0.01), 无标注者表示组间无显著性差异(P > 0.05) | ||
LEfSe分析结果如图 5a, 两组高体鰤幼鱼肠道样品共有9个不同分类水平的细菌类群存在显著差异(P < 0.05)。相比于冰鲜杂鱼组, 配合饲料组个体中有2类存在显著差异(P < 0.05), 分别是颤螺菌科UCG_005属和黄杆菌属(Chryseobacterium); 冰鲜杂鱼组肠道的显著性优势菌群主要是Bifidobacterium_pseudocatenulatum_DSM_ 20438_JCM1200_LMG_10505、短波单胞菌属(Brevundimonas)和泡囊短波单胞菌(Brevundimonas_ vesicularis)。
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| 图 5 LEfSe分析冰鲜杂鱼组和配合饲料组差异肠道菌群 Fig. 5 Differences between the gut bacterial communities of formulated feed and chilled trash fish groups analyzed by LEfSe |
配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼血清ALT、AST、HDL-C、LDL-C、ACP、ALP、TG和TC含量的影响如表 8。配合饲料高体鰤幼鱼血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量和甘油三酯(TG)含量显著低于组冰鲜杂鱼组(P < 0.05), 总胆固醇(TC)含量极显著低于配合饲料组(P < 0.01), 其他指标在组间无显著差异(P > 0.05)。
| 项目 | 组别 | |
| 配合饲料组S | 冰鲜杂鱼组B | |
| 谷丙转氨酶ALT/(U·L–1) | 2.79±0.87 | 3.97±1.95 |
| 谷草转氨酶AST/(U·L–1) | 39.34±11.04 | 42.11±26.22 |
| 酸性磷酸酶ACP/(U·L–1) | 3.11±0.50 | 3.53±0.56 |
| 碱性磷酸酶ALP/(U·L–1) | 38.89±4.75 | 47.46±9.09 |
| 高密度脂蛋白HDL-C/(mmol·L–1) | 4.34±0.27 | 4.72±0.14* |
| 低密度脂蛋白LDL-C/(mmol·L–1) | 1.43±0.43 | 2.05±0.79 |
| 甘油三酯TG/(mmol·L–1) | 1.10±0.40 | 1.68±0.45* |
| 总胆固醇含量TC/(mmol·L–1) | 5.32±0.49 | 6.73±0.83** |
| 注: 表中标有*者表示组间有显著性差异(P < 0.05), 标有**者表示组间差异极度显著(P < 0.01), 无标注者表示组间无显著性差异(P > 0.05) | ||
RT-qPCR结果如图 6所示, 在养殖60 d后, 配合饲料组高体鰤幼鱼肝脏白细胞介素-6(il-6)基因相对表达量显著低于冰鲜杂鱼组(P < 0.05), 髓样分化因子88(myd88)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)基因相对表达量极显著低于冰鲜杂鱼组(P < 0.01), 白细胞介素-10(il-10)和转化生长因子-β2(tgf-β2)基因相对表达量显著高于冰鲜杂鱼组(P < 0.05)。两组间补体C3(c3)基因相对表达量无显著差异(P > 0.05)。
 |
| 图 6 高体鰤幼鱼肝脏中免疫相关基因的相对表达量 Fig. 6 Relative expression levels of the liver immune-related genes in Seriola dumerili juveniles 注：*表示组间有显著性差异(P < 0.05)；**表示组间差异极度显著(P < 0.01) |
配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼肝脏和血清T-AOC、SOD、GPX、CAT和MDA的影响如表 9。配合饲料组血清中T-AOC活性显著大于冰鲜杂鱼组(P < 0.05); 配合饲料组肝脏MDA含量和血清GPX活性显著低于冰鲜杂鱼组(P < 0.05), 血清MDA含量极显著低于配合饲料组(P < 0.01)。其他指标在组间无显著差异(P > 0.05)。
| 项目 | 组别 | |
| 配合饲料组S | 冰鲜杂鱼组B | |
| 肝脏 | ||
| 总抗氧化能力T-AOC/(U·L–1) | 0.48±0.21 | 0.55±0.24 |
| 超氧化物歧化酶SOD/(U·mg prot–1) | 2.43±0.38 | 2.32±0.25 |
| 谷胱甘肽过氧化物酶GPX/U | 33.02±4.82 | 31.29±3.25 |
| 过氧化氢酶CAT/(U·mg prot–1) | 1.92±0.99 | 2.76±0.94 |
| 丙二醛MDA/(nmol·mg prot–1) | 0.96±0.68 | 5.18±2.20* |
| 血清 | ||
| 总抗氧化能力T-AOC/(U·mg–1) | 5.32±0.73* | 4.19±0.94 |
| 超氧化物歧化酶SOD/(U·ml–1) | 14.09±3.70 | 11.52±1.91 |
| 谷胱甘肽过氧化物酶GPX/U | 423.42±31.65 | 493.68±64.47* |
| 过氧化氢酶CAT/(U·mL–1) | 1.48±1.27 | 2.08±1.18 |
| 丙二醛MDA/(nmol·mL–1) | 6.04±4.64 | 32.70±8.75** |
| 注: 表中标有*者表示组间有显著性差异(P < 0.05), 标有**者表示组间差异极度显著(P < 0.01), 无标注者表示组间无显著性差异(P > 0.05) | ||
鱼类消化道指数是鱼体健康生长的指标之一[22]。配合饲料组和冰鲜杂鱼组高体鰤幼鱼平均脏体比分别为5.87%和5.93%, 超过了肉食性大银鱼(Protosalanx hyalocranius)的3.8 %[23]; 平均肝体比为1.37 %和1.31 %, 符合一般硬骨鱼类肝体比在3%以下的规律[24]; 其肠长比分别为0.778和0.717, 接近肉食性大银鱼和五条鰤(Seriola quinqueradiata)[21], 但远小于杂食性黄颡鱼和长鳍篮子鱼(Siganus canaliculatus)[25], 更远小于植食性鲢(Hypophthalmichthys molitrix)[26], 表明高体鰤幼鱼期为肉食性。
消化酶活性是衡量鱼类消化吸收能力的关键, 而饲料成分会影响幼鱼消化酶活性[27]。胰蛋白酶活力能反映消化机能状态。研究发现, 饲料蛋白质水平提升能显著增强草鱼肝胰脏中蛋白酶活性; 在适宜的范围内, 适度增加饲料中的蛋白质比例, 可有效刺激鱼类肝胰脏分泌胰蛋白酶, 进而促进肠道对食物的消化与吸收[28]。本研究中, 配合饲料替代冰鲜杂鱼显著提高高体鰤幼鱼肠道胰蛋白酶活性, 而胃和肝脏消化酶活性无显著变化, 可能是由于配合饲料蛋白质水平适中, 能满足高体鰤幼鱼的营养需求, 促进肠道消化。但整体上, 幼鱼肠道消化能力仍有所减弱。
鱼类肠道由黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层构成[29]。其中黏膜层的肠道褶皱形态对消化吸收至关重要。有研究发现, 日粮中添加80~120 g/kg的大豆活性肽能够有效增加肠道绒毛长度与隐窝深度的比值, 表明适量添加水解大豆蛋白对肉鸡肠道发育有促进作用[30]。高纤维含量的饲料会对肠绒毛产生影响[31]。在本实验中, 配合饲料组高体鰤幼鱼肠道绒毛长度相较于冰鲜杂鱼组显著增高, 但肌层厚度和褶皱数量并无显著变化, 与上述研究结果相似, 推测高体鰤幼鱼为了适应高纤维配合饲料, 肠道绒毛发生了适应性改变, 以增强营养吸收能力。
肠道作为鱼类消化与吸收的主要器官, 其内部微生物与宿主形成共生关系, 影响宿主代谢、营养吸收及免疫功能, 细菌群落营养主要来自宿主组织液或食物残渣[32], 因此, 饲料质量的优劣对肠道微生物群落结构的塑造起着举足轻重的作用。肠道微生物群与宿主间存在着动态平衡, 失衡时可引发疾病[33]。本实验中, 对配合饲料组和冰鲜杂鱼组Alpha多样性指数进行比较, 发现配合饲料组的各项指数略低于冰鲜杂鱼组, 但并无显著差异, 表明投喂配合饲料不会降低高体鰤肠道菌群的丰富度和多样性, 这与徐晓莹等[34]在钝吻黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)中的研究结果相似。鱼类肠道中的主导菌群是变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门[35]。本实验中, 配合饲料组和冰鲜杂鱼组高体鰤幼鱼肠道菌群在门分类水平上种类与相对丰度均无显著差异, 其中变形菌门作为唯一的优势菌门, 在两组中均占据了细菌总量的95 %以上。然而在科水平上, 配合饲料组高体鰤肠道中莫拉氏菌科的数量极显著高于冰鲜杂鱼组, 这种机会性病原菌的增多可能与实验期间夏季养殖水域温度升高、水体微生物数量激增有关, 且其含量的增加往往预示着鱼群生长迟缓和免疫状况下降[36]。同时在属水平上, 相较于冰鲜杂鱼组, 配合饲料组中弧菌属的数量呈现出显著的上升趋势, 而不动杆菌属的数量则呈现出极显著的下降趋势。弧菌和不动杆菌都是水产动物领域中常见的致病菌。值得注意的是, 鳗弧菌(V. anguillarum)、副溶血性弧菌(V. parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和哈维氏弧菌(V. harveyi)等高危致病菌, 已被多次报道是易引发养殖高体鰤弧菌病的关键因素[37]。不动杆菌属为非发酵革兰氏阴性杆菌, 广泛分布于水体和土壤, 多为条件致病菌且毒力较低, 但在宿主免疫力降低或受损时可引发感染。本实验中, 配合饲料组的弧菌属丰度显著升高, 而不动杆菌属丰度极显著降低。这一结果表明投喂配合饲料会使高体鰤幼鱼的肠道健康状况下滑, 为高危致病菌的大量繁殖提供了机会, 最终导致肠道菌群失衡, 对高体鰤幼鱼的生长发育产生了极为不利的影响。
上述结果表明, 投喂配合饲料替代冰鲜杂鱼虽在一定程度上提高了高体鰤幼鱼肠道胰蛋白酶活性, 增强了营养吸收能力, 但也导致肠道菌群结构失衡, 对肠道健康和免疫功能产生不利影响。因此在饲料配方设计中需综合考虑营养成分与微生物平衡, 以确保高体鰤幼鱼的肠道健康。
3.2 配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼免疫能力的影响血清生化指标是评估鱼类健康状况及环境应激响应的关键手段[38]。其中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)等脂质代谢指标是评估机体脂肪沉积及分布状况的关键因素[39]。本实验中, 相较于冰鲜杂鱼组, 配合饲料组高体鰤幼鱼血清TG和HDL-C含量均显著降低, TC含量极显著降低。这一现象与在黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)[40]、星斑川鲽(Platichthys stellatus)[41]和银鲑(Oncorhynchus kisutch)[42]中的研究结论相吻合, 即随着饲料中植物蛋白替代比例的增加, 血清TC含量呈现下降趋势。鉴于周围组织为脂肪从肝脏中运出经代谢后剩余部分的贮存场所, 其脂肪含量的多少可以从侧面反映高体鰤幼鱼对脂肪的利用效率。这些结果表明高体鰤幼鱼对配合饲料脂肪成分利用效率低, 导致机体能量需求难以满足[43]。空腹时, 由肝脏向血液中转移的TG量相对有限, 因而高体鰤幼鱼血清TG主要源自于体内储备的脂肪组织[44], 进一步表明配合饲料组高体鰤幼鱼在消耗除肝脏外其他周围组织脂肪的能力上相对较弱, 这也合理解释了配合饲料组高体鰤幼鱼内脏脂肪积累较少的现象。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)作为肝脏组织中的关键酶类, 是评估鱼类肝脏受损状况的重要标志物。未应激时, 动物血清中的转氨酶活性通常保持在相对稳定的水平, 而当肝脏或其他组织遭受病理损伤时, 其转氨酶活性才会显著且持续地升高[45]。碱性磷酸酶(ALP)与营养免疫密切相关, 在动物代谢中起着重要的调控作用, 若动物血清中的ALP活性降低, 表明肝组织受到了一定程度的损伤[46]。进一步分析发现, 与冰鲜杂鱼组相比, 配合饲料组高体鰤幼鱼血清中ALT和AST活性无显著变化, 但ALP活性有所降低, 表明养殖过程肝脏可能遭受了一定程度的损伤。这可能是由于配合饲料的营养中某些营养元素缺失和植物脂肪成分未满足其生长需求所导致的, 但具体机理有待进一步研究。
炎症反应作为鱼类抵御外界胁迫的重要机制, 其调控过程复杂而精细[47]。IL-6和TNF-α作为促炎细胞因子家族的成员, 在免疫细胞的成熟、活化和免疫调节等多个环节中均发挥重要作用[48]。相反, IL-10则通过抑制T淋巴细胞的增殖、活化以及迁移, 有效约束炎症反应的过度扩展[49]。而TGF-β则是通过直接抑制炎性细胞因子释放来进一步缓解炎症反应[50]。MyD88作为细胞内传递信号的关键衔接蛋白, 在免疫中发挥重要作用。MyD88依赖的信号通路在多种病原体致病机制中占据核心地位, 与肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等密切相关, 被认为是这些疾病治疗的关键靶点。李培佳等[51]发现, 在高糖饲料中添加牛磺酸能显著下调杂交鳢(Channa argus)肝脏中myd88和tnf-α基因的表达水平, 同时显著上调il-10和tgf-β基因的表达, 通过精准调控MyD88依赖的信号通路, 有效抑制促炎细胞因子如TNF-α等的释放, 进而改善机体免疫力, 缓解肝脏的炎症反应。这和本实验结果类似, 相较于冰鲜杂鱼组, 配合饲料组高体鰤幼鱼肝脏il-6基因相对表达量显著降低, myd88与tnf-α基因相对表达量更是极显著下降, 而il-10与tgf-β2基因相对表达量则显著上升。这表明虽然配合饲料替代冰鲜杂鱼会对高体鰤幼鱼肝脏造成一定程度的轻微损伤, 但可通过促进抗炎因子表达和抑制促炎因子表达的双重机制, 有效减轻肝脏的炎症反应, 优化免疫功能。
综合来看, 尽管配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼的脂肪代谢和肝脏健康产生了一定影响, 但通过调节MyD88依赖的信号通路, 可显著缓解炎症反应, 进而优化免疫功能。然而, 配合饲料的营养配比仍需进一步优化, 以减少对肝脏的损伤风险, 满足高体鰤幼鱼的生长需求。
3.3 配合饲料替代冰鲜杂鱼对高体鰤幼鱼抗氧化能力的影响脂类氧化是水产动物肉质腐败的主要原因。在此氧化过程中, 脂类物质会分解产生丙二醛(MDA), 作为脂类氧化的标志性产物, MDA的含量是评估脂类氧化程度的关键指标, 其水平的高低能在一定程度上间接映射出细胞受损的状况[52]。通过监测MDA的含量变化, 能够更为精确地了解水产动物肉质腐败的实际程度。本实验中, 相较于冰鲜杂鱼组, 配合饲料组高体鰤幼鱼血清中MDA的含量极显著降低(P < 0.01), 同时肝脏中MDA的含量也显著降低(P < 0.05)。这表明配合饲料替代冰鲜杂鱼有效抑制了高体鰤幼鱼体内的脂类氧化过程。
过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内清除过氧化氢的重要酶类, 在通过将过氧化氢还原为氧分子和水的过程中发挥着重要作用, 从而维护机体的正常生理活动, 是鱼类机体在氧化应激状态下的重要指示物[53]。有研究表明, 在饲料中分别添加100 mg/kg的叶黄素、虾青素、雨生红球藻以及角黄素均能显著提升金鱼肝脏的T-AOC, 并降低MDA含量, 表明这4种添加剂对金鱼抗氧化酶活性有提升的作用[54]。高糖饲料中适量添加益生菌可显著降低鲤鱼肠道中的MDA含量, 提升T-AOC, 进而增强肠道的抗氧化能力, 减轻氧化损伤[55]。本实验中两组间高体鰤幼鱼血清CAT活性无显著差异。但与冰鲜鱼组相比, 配合饲料组血清中GPX活性显著降低(P < 0.05), MDA活性极显著降低(P < 0.01), 同时T-AOC活性显著升高(P < 0.05), 表明配合饲料替代冰鲜杂鱼能够提升高体鰤幼鱼血清中抗氧化酶的活性, 进而增强其整体的抗氧化能力。
4 结论本研究表明, 采用配合饲料替代冰鲜杂鱼投喂高体鰤幼鱼可改善高体鰤幼鱼肠道组织学结构, 能增强机体的抗氧化能力, 并通过调控有关MyD88的信号通路相关因子来提高免疫力, 从而弥补投喂配合饲料引起部分消化能力、免疫性能减弱以及致病菌的丰度升高来致使肠道健康下滑的状况。由此可见研制专用的高体鰤幼鱼配合饲料具有很大的潜力, 但后续饲料配方中与肠道微生物平衡相关的营养成分比例的配置还需进一步优化。
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