2025, Vol. 49
文章信息
- 丛思璇, 邓鹏辉, 徐明策, 闻建晴, 王淏, 毕允晨. 2025.
- CONG Sixuan, DENG Penghui, XU Mingce, WEN Jianqing, WANG Hao, BI Yunchen. 2025.
- Ⅱ型鲨鱼源单域抗体EF73在大肠杆菌中的稳定表达
- Robust expression of the Type Ⅱ shark-derived single domain antibody EF73 in Escherichia coli
- 海洋科学, 49(6): 86-97
- Marine Sciences, 49(6): 86-97.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250430001
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文章历史
- 收稿日期：2025-04-30
- 修回日期：2025-05-13
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 青岛海洋科技中心 海洋生物学与生物技术功能实验室, 山东 青岛 26600
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266000, China
骆驼科[1]和软骨鱼纲[2]动物体内存在一种天然缺失轻链、仅含重链的重链抗体, 分别为HcAb(heavy- chain antibody)和IgNAR(immunoglobulin new antigen receptor)。重链抗体的可变区VHH和VNAR具有与传统抗体相同的抗原结合能力, 称为单域抗体[3], 是目前已知的最小抗体[4]。单域抗体具有分子量小、组织渗透性强、稳定性高、亲和力好、易于改造、生产成本低等优势, 在医学成像[5]、疾病诊断和治疗[6]、蛋白结构与功能研究[7]、表观遗传分析[8]等方面得到广泛应用。2014年, 全球单域抗体的专利申请数量首次超过1 000, 此后该数目每年增长20%[9]。针对获得性血栓性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎和癌症免疫治疗的单域抗体药物Caplacizumab[10]、Ozoralizumab[11]和Envafolimab[12]已经获批上市, 同时, 还有多个单域抗体药物已进入临床试验阶段, 适应症涵盖癌症、病毒感染以及自身免疫病等[6]。
VHH和VNAR分别为骆驼科动物和软骨鱼来源的单域抗体。目前, 受制于养殖条件等因素, VNAR的研究和应用相较于VHH仍较为有限。然而, 从结构层面分析, VNAR展现出与VHH相当甚至更好的稳定性, 具有可观的应用潜力。VHH和VNAR都由一条肽链组成, 分别包含9个β折叠和8个β折叠, 各自形成两层β片层[13]。它们都由多个框架区(FR)和抗原互补决定区(CDR)组成, 框架区序列高度保守, 主要维持单域抗体的基本结构, 抗原互补决定区多样性强, 有利于抗原识别和结合。VHH包含4个FR和3个CDR, VNAR包含4个FR和2个CDR, 缺少的CDR2变化为两个高可变区(HV2、HV4), FR3也相应分为FR3a、FR3b。与传统抗体重链可变区VH相同[14], VHH[15]和VNAR[16]在框架区都含有2个经典半胱氨酸残基, 它们在2个β片层间形成一对经典二硫键, 发挥稳定单域抗体结构的作用。除此之外, 部分单域抗体还存在非经典半胱氨酸[17-18], 它们多位于CDR1、CDR3、FR2和FR4, 形成一对或多对额外的非经典二硫键, 能够进一步提高单域抗体的稳定性[19]。根据非经典半胱氨酸残基的位置和数目, VNAR可以分为Ⅰ-Ⅳ四个亚型[20], 其中以Ⅱ型VNAR最为常见, 例如, 条纹斑竹鲨超过70%的VNAR属于Ⅱ型VNAR[21-22], 护士鲨中Ⅱ型VNAR在各类VNAR中占比最高[23]。Ⅱ型VNAR在CDR1和CDR3区分别存在1个非经典半胱氨酸, 能够形成一对额外的非经典二硫键。由于VNAR中含有非经典二硫键的比例高于VHH[24], VNAR的稳定性也更好。但同时, CDR1和CDR3位于单域抗体表面, 其中的非经典半胱氨酸残基易受周围环境的影响。因此, 为了确保VNAR的正确折叠和二硫键的正确形成[25], VNAR对表达条件的要求更为苛刻。
单域抗体常用的重组表达系统是大肠杆菌表达系统[26], 在大肠杆菌中, 影响蛋白表达的因素通常有单域抗体氨基酸序列的固有特性、表达定位、载体和启动子、菌株、诱导和培养条件、融合标签等。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌, 除分泌表达外, 其蛋白重组表达的定位主要有2个, 周质空间和胞质内, 其中, 胞质内为还原环境, 而周质空间为氧化环境。由于单域抗体通常至少含有一对二硫键, 因此大肠杆菌周质空间是单域抗体重组表达的首选场所, 该表达定位过程主要通过信号肽(如pelB、ompA)引导完成[27-29]。然而, 虽然胞质内部由于存在硫氧还蛋白还原酶B(thioredoxin reductase B, TrxB)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)等, 表现为还原环境[30], 但目前已经开发出细胞质还原酶基因突变(trxB-、gor-)的特定工程菌株[31](如SHuffle® T7(NEB)、OrigamiTM B(DE3)(Novagen))。这些菌株的胞质内环境相对温和, 有利于二硫键的形成[32]。其中, SHuffle® T7菌株不仅是胞质还原酶突变菌株, 其胞质内还表达二硫键异构酶DsbC, 用于促进二硫键的形成与正确配对[33]。此外, 共表达分子伴侣(如SurA、FkpA)或促溶标签(如MBP、SUMO、GST、TrxA)等还可以促进胞质中目标蛋白的正确折叠, 增强目标蛋白的溶解性, 防止蛋白在胞质内聚集, 从而提高目标蛋白的可溶性表达产量[31, 34-35]。
大肠杆菌中外源蛋白的重组表达通常依赖诱导型启动子(如Lac启动子、T7启动子), 因此, 重组表达过程需要先通过小体积培养表达的方式摸索最佳诱导条件, 包括诱导时细胞密度、诱导剂浓度、诱导温度等[36-37]。通过摸索获得最适合特定单域抗体表达的诱导条件, 进而在大体积培养表达过程中取得最优单域抗体产量。目前VHH的主流表达载体为pMES4[38]、pHEN6[39-40]载体, 主流表达菌株为WK6菌株, 该重组表达系统将蛋白定位于周质空间进行表达, 常用TB培养基培养细胞, 在OD600达到0.6~0.8时采用0.1~1 mmol/L IPTG诱导剂(isopropyl β-D-thiogalactoside, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)于28 ℃诱导表达, 产量可达1~10 mg/L。有关VNAR表达体系的研究报道较少, 目前常见的表达载体为附带T7强启动子的pET系列质粒, 主要表达菌株为BL21 (DE3)[41-42], 该大肠杆菌周质空间表达系统常使用2YT或LB培养基培养细胞, 在OD600达到0.5~0.8范围时采用0.1~1 mmol/L IPTG诱导剂于16~37 ℃对VNAR进行诱导表达。此外, 也有报道采用Origami™ B(DE3) [43]、SHuffle® T7[44]等菌种表达VNAR, 或使用噬菌粒展示载体直接在WK6菌种中表达VNAR[45]。虽有报道采用上述方法在大肠杆菌周质空间中获得了单域抗体的表达, 但在实际研究中, 鲨鱼源单域抗体的表达纯化仍然面临一些问题, 例如, 二硫键无法正确折叠和蛋白聚集等导致的VNAR难以表达, 批次间表达产量差异大等[46-47], 严重制约了鲨鱼源单域抗体的研究和应用。
本研究以一例常见的Ⅱ型VNAR为研究对象, 使用pET系列质粒分别搭配BL21(DE3)和SHuffle® T7 2种菌株, 研究了鲨鱼源单域抗体在大肠杆菌周质空间和胞质内重组表达的策略, 确定了在不同表达位置实现VNAR稳定重组表达的方法, 为鲨鱼源单域抗体的研究和应用奠定了基础。
1 材料与方法Ⅱ型鲨鱼源单域抗体EF73来自本课题组噬菌体展示筛选实验, 原展示载体pComb3XSS、质粒pET-22b、pET-32a均为本实验室保存。
本研究涉及实验主要包括单域抗体重组表达载体构建、单域抗体诱导表达条件摸索、单域抗体大体积表达纯化。
1.1 大肠杆菌周质空间表达载体pET-22b- EF73的构建为了判断EF73中二硫键的数量和位置, 首先从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中下载已报道三维结构实验数据的Ⅱ型VNAR的氨基酸序列, 通过MEGA12软件进行序列比对, 并在Jalview中可视化分析EF73的半胱氨酸保守性。随后使用AlphaFold Server (https://alphafoldserver.com/)对EF73进行结构预测, 并将预测得到的三维结构导入PyMOL, 结合EF73半胱氨酸残基的保守性分析结果, 判断EF73中哪些半胱氨酸残基可以形成二硫键及其形成位置。
以单域抗体的展示载体pComb3XSS-EF73为模板, 设计引物并通过PCR扩增VNAR基因片段。使用Dpn Ⅰ酶(NEB)于37 ℃水浴1 h消化模板DNA, 后经琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中300 bp左右的条带, 通过FastPure® Gel DNA Extraction Mini Kit (DC301, Vazyme)试剂盒回收该条带, 纯化VNAR核酸片段, 并使用超微量分光光度计检测核酸产物纯度和浓度。以pET-22b空质粒为模板, 设计引物通过PCR扩增引入依据VNAR序列设计的同源臂并获得线性化载体。利用琼脂糖凝胶电泳分离5.5 kb左右的条带, 并按照上述步骤对该条带进行纯化。
用Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit (Vazyme)将线性化的pET-22b载体和VNAR插入片段进行同源重组。对于单片段重组, 载体和插入片段的最佳摩尔比为1∶3, 最佳DNA加入总量为0.02~ 0.5 pmol, 配制重组酶反应体系, 于水浴锅内50 ℃反应1 h。
将重组产物通过热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞, 取复苏后细胞悬液涂布于含氨苄青霉素的LB平板, 37 ℃倒置培养12~14 h。次日挑取阳性单克隆, 用10 μL无菌水重悬, 部分用于菌落PCR检测, 部分接种于1 mL含氨苄青霉素的2YT培养基(2YT-Amp) 中培养。对PCR结果呈阳性的单克隆进行Sanger一代测序, 鉴定VNAR序列正确性。序列验证无误后, 将阳性克隆接种于5 mL 2YT-Amp培养基中过夜培养, 使用FastPure® Plasmid Mini Kit (DC201, Vazyme)试剂盒提取质粒, 构建成功的重组质粒命名为pET-22b-EF73。
1.2 小体积EF73诱导表达条件优化通过热激法将重组质粒pET-22b-EF73转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经氨苄青霉素平板筛选和菌落PCR鉴定阳性克隆。将阳性克隆接种于10 mL 2YT-Amp培养基中过夜培养(37 ℃, 220 r/min, 12 h)。取500 μL过夜培养的阳性克隆菌液加入终浓度为25%的无菌甘油, 液氮速冻, 制备为甘油菌(质粒pET-22b-EF73, 菌株BL21(DE3))并储存于−80 ℃。为优化诱导表达条件, 取上述过夜培养菌液按照1∶100的比例扩大接种, 并设置3组不同的诱导温度进行实验。具体如下, 分别取1 mL过夜培养菌液加入100 mL 2YT-Amp培养基, 于37 ℃、220 r/min培养至OD600达到0.6~0.8, 加入诱导剂IPTG至终浓度0.1 g/L, 将摇床温度分别调至16 ℃、28 ℃、37 ℃, 在220 r/min下诱导表达16 h。诱导结束后, 在4 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min, 弃上清, 收集菌体。渗透压法破碎大肠杆菌细胞壁: 将上步收集的菌体转移到玻璃匀浆器中, 加入TES缓冲液(1 L TES: 24.22 g Tris, 0.19 g EDTA, 171.15 g蔗糖, pH=8.0)重悬制备高渗细胞悬液, 于4 ℃孵育1 h; 随后加入等体积ddH2O使细胞处于低渗环境, 继续于4 ℃条件下孵育1 h, 通过细胞内外的蔗糖渗透压差破坏细菌细胞壁, 实现周质空间蛋白的释放。最后将混合液离心(4 ℃, 14 000 r/min, 30 min), 分离上清和沉淀。
从上清和沉淀中分别取样制备SDS-PAGE电泳样品, 上清样品中加入5×还原型上样缓冲液(25 mmol/L Tris, 10% SDS, 0.5 %溴酚蓝, 50%甘油, 5% β-巯基乙醇); 将沉淀重悬于10倍体积的细胞裂解缓冲液(Lysis Buffer: 25 mmol/L Tris, 0.1 mol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 8 mol/L Urea, 5% SDS, pH=8.0), 在金属浴中加热振荡(95 ℃, 1 500 r/min, 10 min)并离心(室温, 10 000 r/min, 10 min), 取离心后上清加入5×还原型上样缓冲液。配制2块12.5%的聚丙烯酰胺凝胶, 对上述样品进行两组完全相同的SDS-PAGE电泳。一组电泳结果进行考马斯亮蓝染色, 用于评估目标蛋白的纯度及其对应分子量; 另一组电泳结果用于免疫印迹分析, 采用5%脱脂奶粉封闭后, 依次孵育一抗His-Tag (27E8) Mouse mAb (2366, Cell Signaling Technology)和二抗Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (7076, Cell Signaling Technology); 最终使用ECL发光液(36208, Yeasen)显色并通过成像系统检测目标蛋白条带。
1.3 EF73大体积的表达纯化取EF73冻存甘油菌(质粒pET-22b-EF73, 菌株BL21(DE3)), 接种至100 mL 2YT-Amp培养基中过夜培养(37 ℃, 220 r/min, 12 h)。按照1∶100的比例接种培养物, 取10 mL过夜培养菌液接种至1 L 2YT-Amp培养基, 于37 ℃、220 r/min培养至OD600达到0.6~0.8, 加入诱导剂IPTG至终浓度0.1 g/L, 调节摇床温度至诱导温度, 在220 r/min下诱导表达16~20 h。收集菌体并通过渗透压法释放周质空间蛋白, 经离心获取上清; 将上清与镍填料Ni-NTA(QIAGEN N.V.)于4 ℃混合孵育1 h; 通过重力柱法初步洗脱杂质蛋白, 然后分别用10倍柱体积的Wash Ⅰ淋洗液(25 mmol/L HEPES, 1 mol/L NaCl, 20 mmol/L Imidazole, pH=7.5)和Wash Ⅱ淋洗液(25 mmol/L HEPES, 0.1 mol/L NaCl, 40 mmol/L Imidazole, pH=7.5)淋洗, 进一步去除杂质蛋白; 目标蛋白使用30 mL Elution洗脱液(25 mmol/L HEPES, 0.1 mol/L NaCl, 300 mmol/L Imidazole, pH=7.5)分2次洗脱。使用截留分子量为10 kDa的超滤管去除10 kDa以下的杂质蛋白分子, 并将洗脱蛋白浓缩至最终体积500 μL。浓缩样品经离心(4 ℃, 12 000 r/min, 20 min), 取上清上样至Cytiva的AKTA Pure 25 mol/L快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography, FPLC)系统, 使用层析柱SuperdexTM 75 10/300 GL(Cytiva)在4 ℃条件下(流动相为FPLC Buffer: 25 mmol/L HEPES, 0.1 mol/L NaCl, pH=7.5)对样品进行尺寸排阻层析; 收集蛋白洗脱样品, 并通过SDS-PAGE凝胶电泳及免疫印迹对目的蛋白的纯度和特异性进行分析。
1.4 EF73多克隆表达和胞质内表达多克隆表达的实验步骤为: 质粒转化后不挑取单个阳性克隆, 而是刮取抗性平板筛得的所有阳性菌落并重悬在2YT培养基中, 制备成细胞悬液, 接种至2YT-Amp培养基中进行扩大培养体积的表达纯化。后续表达纯化步骤详见材料与方法1.3。
胞质内表达的实验步骤为: 通过分子克隆, 为EF73添加N端促溶标签TrxA, 构建胞质内融合表达载体pET-32a-TrxA-EF73(载体构建步骤同材料与方法1.1中所述); 再将重组质粒pET-32a-TrxA-EF73转化到大肠杆菌SHuffle® T7(NEB)感受态细胞, 采用多克隆表达策略进行表达。表达与纯化步骤见材料与方法1.3。SDS-PAGE凝胶电泳样品制备使用5×非还原型上样缓冲液(25 mmol/L Tris, 10% SDS, 0.5 %溴酚蓝, 50%甘油)。细胞破碎方式改为高压破碎, 具体为, 离心收集菌体沉淀并加入TES缓冲液重悬, 使用UH-06高压细胞破碎机(永联生物)在4 ℃、800 bar压力下破碎10 min, 后经离心分离沉淀, 收集上清进行后续纯化。纯化步骤同材料与方法1.3。
2 结果与分析 2.1 EF73小体积诱导表达对单域抗体EF73的氨基酸序列进行分析发现, 该蛋白中存在4个半胱氨酸残基, 分别为C22、C29、C83和C90。将EF73与其他已经获得结构解析信息、具有Ⅱ型VNAR特征、含有非经典二硫键的VNAR进行氨基酸序列保守性分析, 结果显示, C22、C29和C83位于CDR1及框架区(FR), 在所有比对序列中均高度保守(图 1a); C90位于CDR3, 该区域为VNAR中抗原结合的关键区域, 氨基酸数量差异较大, 结构柔性较强, 因而保守性较低, 但比对的其他VNAR在该位置附近均含有一个半胱氨酸残基(图 1a)。以上结果提示, EF73中包含的4个半胱氨酸残基可能形成一个经典二硫键(C22–C83)和一个非经典二硫键(C29–C90)。进一步使用AlphaFold Server对EF73进行三维结构预测, iPTM值为0.85, 表明预测结果置信度较高。使用PyMOL进行三维结构模型分析显示(图 1b), EF73在FR1和FR3b间由C22和C83形成一个经典二硫键, 在CDR1和CDR3之间还存在由C29和C90形成的一个非经典二硫键。该结果与氨基酸序列保守性分析结果的提示完全一致, 即EF73属于Ⅱ型VNAR, 能够形成两个二硫键。
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| 图 1 EF73结构预测、周质空间表达载体构建和诱导表达条件优化 Fig. 1 Structure prediction of the EF73 protein, construction of a periplasm-specific expression plasmid, and optimization of EF73 induction conditions 注: (a)蓝色背景标示保守性为100%的氨基酸残基, 红框标示半胱氨酸残基, 红色三角标示EF73中的半胱氨酸残基; (b)蓝色标示CDR1、粉色标示HV2、绿色标示HV4、红色标示CDR3; (c) pET-22b-EF73构建示意图; (d)采用免疫印迹方法检测, 泳道M为蛋白分子量标准, 泳道“EF73上清”表示不同诱导温度(16 ℃、22 ℃、37 ℃)下EF73的可溶性蛋白表达情况, 泳道“EF73沉淀”代表不同诱导温度(16 ℃、22 ℃、37 ℃)下EF73的包涵体表达情况 |
为确保以上两个二硫键的正确折叠和EF73的正常表达, 我们选择以质粒pET-22b为骨架, 通过同源重组的方法构建EF73的大肠杆菌周质空间表达载体pET-22b-EF73(图 1c)。pET-22b-EF73配有T7强启动子, 可驱动EF73的高效转录; N端信号肽pelB能够通过Sec途径将EF73转运至大肠杆菌周质空间, 保证EF73在相对氧化的环境中正确折叠并形成二硫键, C端6×His标签便于EF73通过镍柱亲和层析进行纯化。
pET-22b-EF73质粒含有T7启动子, 并受到乳糖操纵子调控, 因此需添加IPTG进行诱导。为优化诱导表达条件, 在进行大体积培养前, 首先选择诱导温度这一经验上最重要的条件对EF73进行小体积培养下的表达测试。通过热激法将重组质粒pET-22b- EF73转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。按照材料与方法1.2中实验方法选择单个阳性克隆过夜培养, 并取部分过夜培养菌液制备冻存甘油菌(质粒pET-22b-EF73, 菌株BL21(DE3))。分别设置16 ℃、22 ℃、37 ℃三组不同诱导温度, 将剩余过夜培养的菌液接种到100 mL 2YT-Amp培养基中诱导表达, 16 h后收集菌体, 通过渗透压法破碎细胞壁, 离心获得蛋白上清和沉淀。上清和沉淀中的蛋白分别代表了目标蛋白的周质空间可溶性表达形式和包涵体形式。
对三组实验的上清和沉淀样品进行免疫印迹分析, 结果显示(图 1d), 6个样品泳道中, 均在15 kDa标准蛋白附近出现条带, 该位置与EF73的分子量相近(EF73的预测分子量为12.79 kDa, https://web.expasy.org/protparam/), 提示EF73在三种温度诱导下均可在大肠杆菌周质空间中获得可溶性表达, 同时存在一定比例的包涵体。进一步横向比较不同条带的灰度值显示, 在上清样品中, 22 ℃条件下的目标蛋白条带灰度值最高, 其次为16 ℃, 37 ℃最低; 而在沉淀样品中, 16 ℃条件下的目标蛋白条带灰度值最高, 37 ℃最低, 22 ℃介于两者之间。上述结果说明, 在100 mL小体积培养体系下, 37 ℃的诱导温度抑制了EF73的蛋白表达, 其上清和沉淀样品中目标蛋白的条带灰度值均最低, 16 ℃和22 ℃的诱导温度能够显著提高蛋白的表达量, 但是16 ℃时, 绝大部分蛋白以包涵体的形式存在。因此, 综合考虑蛋白可溶性表达与表达效率, 22 ℃作为诱导表达条件时, EF73的可溶性表达水平最高, 表达效果最好, 宜选为EF73大体积培养表达的诱导温度。
2.2 EF73大体积培养批次间表达不稳定通过对EF73诱导表达温度的优化, 发现22 ℃诱导条件下, EF73在大肠杆菌周质空间内的可溶性表达水平最高。将2.1中冻存甘油菌(质粒pET-22b-EF73, 菌株BL21(DE3))接种到2 L 2YT-Amp培养基中扩大培养, 培养至OD600达到0.6~0.8, 加入诱导剂IPTG至终浓度0.1 g/L, 于22 ℃诱导表达16 h。按照1.3中的实验方法收集菌体, 利用渗透压法破碎细胞壁, 离心获得上清组分, 并依次通过镍柱亲和层析和尺寸排阻层析对样品进行纯化。结果如图 2a所示, 采用SuperdexTM 75 10/300 GL进行尺寸排阻层析, EF73在15~16 mL处洗脱, 峰形较对称, 洗脱体积为15.59 mL时达到最大瞬时洗脱浓度。SDS-PAGE电泳结果显示, 洗脱样品条带单一、无明显杂质, 条带位置约为15 kDa, 与2.1中免疫印迹结果一致。说明EF73能够通过载体pET-22b在大肠杆菌周质空间中实现大体积(2 L)培养的有效表达, 并可依据1.3中实验方法纯化获得高纯度目标蛋白。
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| 图 2 EF73大体积表达的批次间差异 Fig. 2 Variability in EF73 expression among different batches during scale-up culture 注: (a-c)分别对应3次EF73表达纯化的FPLC纯化结果与SDS-PAGE电泳分析。图中黄色阴影区域表示对应洗脱体积范围内的UV280吸光值积分面积(S), 红色竖直箭头指示UV280吸光值达到峰值时所对应的洗脱体积; SDS-PAGE电泳图中, 泳道M为蛋白分子量标准, 红色水平箭头指示FPLC洗脱峰对应的目标蛋白条带位置, Frac表示收集的相应洗脱体积的蛋白样品 |
利用Beer-Lambert法则(公式1)对EF73的表达产量进行定量计算, 其中, A为吸光度(无单位), ε为摩尔消光系数(单位: L·mol-1·cm-1), c为摩尔浓度(单位: mol·L–1), l为光程长度(单位: cm)。已知EF73对应洗脱体积范围内的FPLC UV280吸收峰积分面积(S)为432.8, AKTA UV280检测系统的光程长度(l)为0.2 cm, 大肠杆菌培养体积(V)为2 L, EF73-6×His的预测分子量(MW)为12 790 g·mol–1, 预测摩尔消光系数(ε)为20 190 L·mol-1·cm-1(https://web.expasy.org/protparam/)。将上述参数代入变形公式(2), 计算得出, 所收集样品中对应的EF73蛋白产量(Y)为每升培养基0.69 mg。
| $ A = \varepsilon \times c \times l, $ | (1) |
| $ Y = \frac{{S \times {M_{\text{w}}}}}{{V \times \varepsilon \times l \times {{10}^3}}}. $ | (2) |
随后使用同一冻存甘油菌对EF73进行8 L培养体积的表达纯化, 实验步骤参照材料与方法1.3。结果如图 2b所示, 尺寸排阻层析实验在11~12 mL处出现洗脱峰, 其中洗脱体积为11.56 mL时达到最大瞬时洗脱浓度。该洗脱样品的还原型SDS-PAGE电泳结果显示, 蛋白条带单一、无杂质, 但蛋白条带位置在25 kDa左右, 明显高于EF73的理论分子量, 且洗脱峰位置和电泳结果均与先前EF73有效表达的实验结果不符, 提示本次实验未能成功表达目标蛋白EF73, 推测质粒丢失可能是造成上述现象的原因之一。
为验证这一假设, 将pET-22b-EF73质粒重新转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中, 并通过氨苄青霉素平板筛选结合菌落PCR鉴定阳性克隆。随后, 按照材料与方法中1.3的步骤进行大体积表达和纯化。FPLC和SDS-PAGE结果如图 2c所示, 尺寸排阻层析实验在15~16 mL处出现洗脱峰, 洗脱体积15.54 mL时达到最大瞬时洗脱浓度, 但该峰的峰形较差, 存在明显拖尾现象; SDS-PAGE电泳结果显示, 洗脱样品中蛋白条带单一、无明显杂质, 洗脱蛋白条带位置在15 kDa左右, 与EF73蛋白的预期分子量相符。根据变形公式(2)计算, 所收集样品对应的EF73蛋白产量为每升培养基0.10 mg, 相比于此前实验所得产量显著降低。为进一步验证表达的不稳定性, 重复转化质粒并制备新的克隆菌株, 结果发现EF73的产量仍无明显提升, 且部分重复实验结果与前述8 L培养表达实验结果相似, 出现EF73表达缺失现象(数据未展示)。
综上所述, 尽管Ⅱ型鲨鱼源单域抗体EF73能够在大肠杆菌周质空间中实现大体积表达和纯化, 但是不同表达批次间的产量表现出显著不稳定性, 甚至出现“有”和“无”的表达差异(数据未展示), 说明以EF73为代表的VNAR在大肠杆菌周质空间表达系统中存在表达不稳定的问题。
2.3 EF73大体积表达策略优化为了应对EF73在大肠杆菌周质空间表达系统中无法稳定表达的问题, 我们共采用两种策略进行优化。首先, 采取使用多个阳性单克隆共同表达的策略, 即将转化后的抗生素筛选阳性菌落全部刮取, 制备成细胞悬液, 然后接种到10 L 2YT-Amp培养基中培养, 22 ℃条件下诱导EF73周质空间表达。按照材料与方法1.3中步骤进行纯化, 结果如图 3a所示。通过SuperdexTM 75 10/300 GL对样品进行尺寸排阻层析, EF73在14~15 mL时开始被洗脱, 洗脱峰对称, 且在洗脱体积16.22 mL时达到最大瞬时洗脱浓度。SDS-PAGE电泳结果显示, 洗脱样品条带单一、无明显杂质, 分子量约为15 kDa, 与预期结果一致。该方法在多次实验中重复得到相同的纯化结果, 表明多克隆表达策略能够实现EF73在大肠杆菌周质空间的稳定表达。利用公式(2)对EF73表达产量进行计算, 已知对应洗脱体积范围内的FPLC UV280吸收峰积分面积(S)为397.6, EF73蛋白产量为每升培养基0.13 mg。
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| 图 3 采用多克隆表达策略在周质空间和胞质内表达EF73 Fig. 3 Polyclonal strategy applied for the periplasmic and cytoplasmic expression of EF73 注: 图中黄色阴影区域表示对应洗脱体积范围内的UV280吸光值积分面积(S), 红色竖直箭头指示UV280吸光值达到峰值时对应的洗脱体积位置; SDS-PAGE泳道M为蛋白分子量标准, 红色水平箭头指示FPLC洗脱峰对应的目标蛋白条带位置, Frac表示收集的相应洗脱体积的蛋白样品 |
其次, 为了扩展EF73在大肠杆菌表达系统中的表达途径, 我们构建了胞质内表达载体pET-32a- TrxA-EF73(图 3b)。该载体配备T7强启动子和C端His标签, 并在EF73的N端添加了促溶标签TrxA (硫氧还蛋白A), 以防止EF73在胞质内发生聚集, 提高其胞质内可溶性表达水平[48]。此外, TrxA与EF73之间还添加了人类鼻病毒3C蛋白酶(human rhinovirus 3C protease, HRV 3C)酶切位点, 便于后续在特定实验中移除TrxA, 获得单独的EF73。将pET-32a-TrxA-EF73质粒转化到大肠杆菌SHuffle® T7感受态细胞中, 按照材料与方法中1.4实验方法, 利用多克隆表达策略进行表达和纯化, SHuffle® T7菌株有助于含有非经典二硫键的蛋白质在胞质内正确折叠和表达。FPLC和免疫印迹结果如图 3c所示, TrxA-EF73在洗脱体积8~9 mL时开始被洗脱, 洗脱峰峰形较对称, 洗脱体积为9.86 mL时达到最大瞬时洗脱浓度。洗脱样品中, 目标蛋白条带位于25~35 kDa之间, 与预期的TrxA-EF73-6×His分子量一致(TrxA-EF73-6× His的理论分子量为28 kDa)。10 mL洗脱体积对应的洗脱样品中在55 kDa左右还出现了一条灰度值较低的条带, 可能是由于该样品浓度过高导致部分TrxA-EF73形成了二聚体。利用公式(2)对纯化结果进行量化分析, 已知对应洗脱体积范围内的FPLC UV280吸收峰积分面积(S)为1 265, AKTA UV280检测系统的光程长度(l)为0.2 cm, 大肠杆菌培养体积(V)12 L, TrxA-EF73的预测分子量(MW)为27 928 g·mol–1, 预测摩尔消光系数(ε)为34 295 L·mol–1·cm–1, 通过变形公式(2)进行计算, 所收集样品对应的TrxA-EF73蛋白总产量为5.15 mg, EF73产量约为每升培养基0.20 mg。重复实验结果表明, 胞质内多克隆表达策略能够有效实现EF73的稳定表达(数据未展示)。
3 讨论尽管目前单域抗体能够通过多种重组表达系统实现表达与制备, 如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、无细胞蛋白质合成系统等。但考虑到不同表达系统的可及性、表达效率及成本等因素, 可及性强、生产效率高且成本低的大肠杆菌表达系统仍然是单域抗体重组表达的主流选择。大肠杆菌表达系统工程化改造成熟, 拥有多种适配载体和菌株, 能够满足单域抗体的不同表达需求。例如, 含有T7强启动子的载体能够提高单域抗体的转录水平, N端信号肽则能将单域抗体引导至相对氧化的周质空间以促进其正确折叠。此外, 针对胞质内表达需求, 已开发出WK6、SHuffle® T7等能够提供相对氧化胞质环境的工程菌株, 用于辅助含有二硫键的单域抗体正确折叠和形成二硫键。此外, 常见的融合标签TrxA、GST、MBP、SUMO等不仅可以增强单域抗体的蛋白溶解性[47], 部分还具有分子伴侣功能, 有助于单域抗体正确折叠。
然而, 在大肠杆菌中表达单域抗体也存在一定局限性。首先周质空间作为最常用的表达位点, 其体积仅占菌体总体积的20%~40%[49], 限制了蛋白表达总量。其次, 单域抗体表达速率远高于折叠速率时, 未能正确折叠的蛋白容易聚集形成包涵体, 从而导致单域抗体的可溶性表达量偏低。此外, 单域抗体容易出现表达水平不稳定, 不同批次间表达产量波动幅度大的情况等, 具体原因目前尚不明确。密码子使用偏好性也可能影响单域抗体表达水平。不同物种拥有不同的密码子使用偏好性, 单域抗体来源于骆驼科动物和软骨鱼, 可能存在无法适应大肠杆菌密码子系统导致翻译效率降低的问题, 进而影响其表达水平[50]。EF73的密码子适应指数(CAI)为0.52(CAI是指编码区同义密码子与最佳密码子使用频率的相符程度, 取值在0~1之间, 可以用来评估外源基因密码子对宿主表达系统的匹配水平, CAI越高, 则提示外源基因在宿主内的表达水平可能越高), 说明编码EF73的密码子与大肠杆菌中的偏好密码子系统适配性偏差。然而本研究并没有针对EF73的基因序列进行密码子优化, 这可能是本实验中EF73在大肠杆菌内表达水平不高的原因之一。因此, 密码子优化也可以作为提高单域抗体在大肠杆菌中表达水平的优化策略。此外, 在不进行密码子优化的情况下, 也可使用具有密码子偏向性的大肠杆菌菌株解决密码子适配性问题, 例如, Rosetta(DE3)菌株内部自带的质粒可以为大肠杆菌中的罕见密码子提供tRNA, 从而提高外源蛋白的翻译效率, 有望增强单域抗体表达水平。
本研究构建了单域抗体大肠杆菌周质空间表达载体, 通过小体积表达摸索出Ⅱ型VNAR EF73的最佳诱导温度, 随后在大体积(2 L)培养条件下成功实现高效表达。然而EF73出现了批次间表达不稳定的情况, 为解决该问题, 通过采用多克隆表达策略, 即刮取转化后固体培养基上所有抗生素筛选阳性单克隆, 共同接种到培养基中培养, 成功在10 L培养体积下实现了EF73的有效表达, 并且实验具有可重复性, 这说明多克隆表达策略能够显著提升表达稳定性。值得注意的是, 首次单克隆表达在周质空间中可获得每升培养基0.69 mg的EF73蛋白, 此后无论是重新构建单克隆表达体系, 或转化新的感受态细胞, 其表达产量均大幅下降, 甚至无表达。而采用多克隆表达策略, 分别在周质空间与胞质内表达中获得了每升培养基0.13 mg和0.20 mg的EF73蛋白, 尽管产量仍低于首次单克隆表达, 但实现了表达的稳定性和可重复性。造成首次高产量表达无法复现的原因尚不明确, 推测可能与单克隆本身活性或状态有关, 而多克隆表达策略在一定程度上规避了单克隆表达不稳定性所带来的风险。
4 结论本研究针对鲨鱼源单域抗体VNAR在研究过程中出现的表达不稳定的问题展开研究, 使用pET系列质粒分别在BL21(DE3)和SHuffle® T7菌株内构建了Ⅱ型VNAR EF73的大肠杆菌周质空间表达体系和胞质内表达体系; 通过对表达条件中诱导温度和表达克隆数目的优化, 最终在大肠杆菌周质空间和胞质内实现了EF73的稳定表达, 为单域抗体在大肠杆菌中可能出现的表达不稳定难题提供了可借鉴的表达策略, 解决了鲨鱼源单域抗体研究中的抗体稳定供应问题。
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