2025, Vol. 49
文章信息
- 王昕, 刘畅, 葛香云, 邢荣娥, 刘松, 李克成. 2025.
- WANG Xin, LIU Chang, GE Xiangyun, XING Ronge, LIU Song, LI Kecheng. 2025.
- 栉孔扇贝内脏多糖的提取分离与生物活性研究
- Extraction, isolation, and bioactivity of visceral polysaccharides from Chlamys farreri
- 海洋科学, 49(6): 98-111
- Marine Sciences, 49(6): 98-111.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250224001
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文章历史
- 收稿日期：2025-02-24
- 修回日期：2025-05-05
2. 青岛海洋科技中心 海洋药物与生物制品功能实验室, 山东 青岛 266000;
3. 青岛农业大学, 山东 青岛 266237
2. Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266000, China;
3. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266237, China
中国是海水养殖大国, 其养殖结构以贝类为主, 约占海水养殖总产量的70%[1]。根据2022年的全国渔业统计数据, 贝类总产量达到1 588.56万吨, 年产量位居世界第一[2]。扇贝属于软体动物科, 主要由贝壳、贝柱(闭壳肌)、裙边和内脏组成[3]。其中, 栉孔扇贝(Chlamys farreri)是中国原产物种, 因其独特的营养价值而备受青睐, 在中国贝类养殖业中扮演着举足轻重的角色[4]。尽管栉孔扇贝有重要的经济价值, 但其利用率尚显不足。在扇贝的工业加工中, 其主要利用部位为闭壳肌, 而占比达30%的内脏则常被视作副产物丢弃。扇贝内脏含有丰富的生物活性物质, 如多糖[5]、脂质[6]、酶[7]、蛋白、肽[8]和类胡萝卜素[9]等, 这些成分在现今的营养科学与医学研究领域中展现出极为显著的价值与潜力。因此, 开展扇贝内脏副产物资源利用研究, 提取、优化并加工其独特的功能成分, 研发新型生物制品, 是促进海洋贝类生物资源可持续利用的重要途径。
在众多营养成分中, 多糖尤其受到研究学者的关注。多糖是一种功能性生物大分子, 在食品科学和医药开发领域具有广泛的应用潜力。已有研究表明, 源自扇贝的多糖类化合物展现出广泛的生物学活性。刘良伟等[10]报道了一种从牡蛎中提取的β-葡聚糖, 通过体外抗氧化活性测试发现此牡蛎多糖具有良好的抗氧化活性; Song等[11]研究发现虾夷扇贝内脏中有一种酸性多糖, 具有良好的抗凝血活性, 且硫酸根更高的组分抗凝血活性更强; 杨燕丽等[12]的研究还证明了翡翠贻贝中提取的多糖能有效降低宫颈癌肿瘤的体积, 上调p53 mRNA丰度, 具有较好的抗肿瘤活性。然而, 目前对于栉孔扇贝内脏副产物中的多糖研究报道较少, 栉孔扇贝内脏多糖的结构和生物学活性尚不明确。本实验采用酶解法从扇贝内脏中获得粗多糖, 通过单因素实验确定最佳反应条件, 并利用离子交换色谱柱和凝胶排阻色谱柱分离纯化得到一种均一多糖, 并对其化学组成、结构特征及其生物学活性进行初步研究, 为扇贝内脏多糖活性物质的开发利用提供理论依据, 也为海洋贝类资源的可持续发展和新型海洋功能食品的研发奠定重要基础。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂栉孔扇贝在山东青岛团岛海鲜市场购入, 内脏团为剥离扇贝柱和扇贝裙边后的剩余部分。
中性蛋白酶(2×105 U/g)、胰蛋白酶(1∶250)、胃蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、ELISA试剂盒、苯酚和DEAE纤维素52由Solarbio公司购入。胎牛血清Gibco由Sigma购入。RAW264.7细胞(ATCC TIB-7, 中国科学院典型培养物保藏中)。还原性辅酶Ⅰ由Macklin购入。1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)由YEASEN购入。Hyclone RPMI 1640培养基由赛默飞世尔科技有限公司购入。其他试剂均为国药分析纯。
1.2 栉孔扇贝内脏多糖的提取 1.2.1 样品的预处理扇贝内脏打碎匀浆, 加入等体积的石油醚, 45 ℃过夜, 脱脂。将反应后的液体离心, 称取最下层沉淀。
1.2.2 提取工艺的优化多糖在动物体内大多以蛋白聚糖的形式存在, 需通过蛋白酶酶解蛋白链从而释放多糖, 本文选取胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和复合蛋白酶酶解, 并设计单因素实验对提取过程中的酶的种类、pH、加酶量、时间、温度进行初步确定, 通过1, 9-二甲基亚甲基蓝法[13]测定多糖含量筛选提取的最适条件。
酶解反应结束后将酶解液通过0.45 μm滤膜抽滤, 加3倍体积的无水乙醇4 ℃醇沉过夜。10 000 r/min离心15 min, 取离心后的沉淀溶于水, 500 Da的透析袋透析。浓缩冻干, 得到栉孔扇贝内脏粗多糖。
1.3 栉孔扇贝内脏多糖的分离纯化 1.3.1 DEAE-52离子交换色谱分离将栉孔扇贝内脏粗多糖配置成0.1 g/mL溶液, 采用DEAE-52离子交换色谱进行分离, 分别以0、0.1、0.2、0.4 mol/L NaCl溶液进行分级梯度洗脱, 洗脱液流速为2.0 mL/min, 收集洗脱组分, 采用苯酚-硫酸法[14]检测收集洗脱组分中的糖含量, 绘制洗脱曲线, 收集不同色谱峰对应的4个多糖组分CFP1~4, 透析后浓缩冻干。
1.3.2 Sephadex G-100凝胶排阻色谱分离将多糖组分CFP4配置成0.1 g/mL溶液, 采用Sephadex G-100凝胶排阻色谱进行分离, 采用去离子水作为洗脱液, 流速0.3 mL/min, 采用苯酚硫酸法检测洗脱液中的多糖组分, 绘制洗脱曲线。
1.4 栉孔扇贝内脏多糖的化学成分与结构分析对多糖的化学成分分析有助于定性及定量其取代基团, 如糖醛酸、硫酸基等, 为进一步研究其结构、活性和综合开发利用提供基础数据和分析方法。
1.4.1 栉孔扇贝内脏多糖的化学成分总糖选用苯酚-硫酸法对多糖的含量进行测定, 以葡萄糖标准溶液为标准品绘制校准曲线。糖醛酸测定选用硫酸-咔唑法[15], 以半乳糖醛酸为标准参照。SO42–含量测定按照离子色谱法[16]进行测定, 以标准硫酸钾为参照。糖胺聚糖含量测定, 选用1, 9-二甲基亚甲基蓝法, 以肝素钠为标准溶液参照。
1.4.2 栉孔扇贝内脏多糖的结构分析多糖分子量测定采用高效液相色谱法(GPC): 色谱柱TSK-gel G4 000; 0.1 mol/L的Na2SO4为流动相; 流速为0.6 mL/min。红外光谱表征采用KBr压片法, 波长扫描范围4 000~400 cm–1。紫外光谱扫描: 配制一定浓度的多糖溶液于200~900 nm进行紫外光谱扫描。
单糖组成测定采用PMP柱前衍生法[17]。
样品水解: 准确配制10 mg/mL样品于安瓿瓶中。加入1 mL 4 mol/L的三氟乙酸, 110 ℃下水解4 h。至室温后调节pH值至5~6。定容至10 mL, 4 ℃保存。
衍生化反应: 0.1 mL样品水解物加0.12 mL 0.5 mol/L的PMP和0.1 mL 0.3 mol/L的NaOH溶液, 70 ℃反应60 min。冷却至室温, 中和pH, 加0.5 mL氯仿萃取, 7 000 r/min离心5 min, 去除有机层重复3次。过滤, 进行液相分析。
高效液相分析条件: 色谱柱ZORBAX SB-AQ, 流动相为磷酸盐缓冲液∶乙腈=83∶17, 流速0.8 mL/min; 柱温30 ℃。
1.5 栉孔扇贝内脏多糖的生物活性研究 1.5.1 抗氧化活性测定(1) 超氧阴离子清除活性测定
对Nishikimi等[18]的方法做了改良。称取0.036 57 g还原型辅酶Ⅰ(NADH)、0.024 53 g氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、0.001 838 g吩嗪硫酸甲酯(PMS)并分别用Tris- HCl缓冲溶液定容至100 mL。再将5 mg/mL的样品糖母液加入Tris-HCl稀释成不同浓度。每管取150 μL糖溶液, 加入50 μL NADH、NBT、PMS。空白组用Tris-HCl代替样品和NADH, 对照组用Tris-HCl代替样品, 摇匀避光反应5 min, 560 nm处检测吸光度, 根据公式(1)计算清除率。
| $ C\left( {\% } \right){\text{ = }}\frac{{{A_{{\text{control}}}} - {A_{{\text{sample}}}}}}{{{A_{{\text{control}}}} - {A_{{\text{blank}}}}}} \times {100\% }, $ | (1) |
式中, C(%)为清除率, A为吸光度。
(2) 还原能力测定
将Yen等[19]的方法改良。配制0.2 mol/L, pH=6.6的磷酸缓冲液PBS、1%铁氰化钾溶液、10%三氯乙酸溶液、0.1%氯化铁溶液和不同浓度的样品糖母液。每管取125 μL糖溶液, 加入125 μL铁氰化钾, 50 ℃反应20 min; 加入250 μL三氯乙酸, 室温避光反应5 min; 加入150 μL三氯化铁, 室温反应30 min。在700 nm处测定其吸光度。吸光度值越大, 还原能力越强。
(3) 羟自由基清除活性测定
取100 μL不同浓度的糖溶液, 加入50 μL EDTA-Fe、100 μL PBS、100 μL番红花(0.036 g定容至100 mL)和100 μL 10% H2O2, 37 ℃水浴30 min。用去离子水代替样品、PBS代替H2O2作对照组, 去离子水代替样品作空白组。每份样品平行操作3次, 在520 nm处测定吸光度[20], 根据公式(2)计算清除率。
| $ C\left( \% \right){\text{ = }}\frac{{{A_{{\text{sample}}}} - {A_{{\text{blank}}}}}}{{{A_{{\text{control}}}} - {A_{{\text{blank}}}}}} \times {100\% }, $ | (2) |
式中, C(%)为清除率, A为吸光度。
(4) DPPH清除活性测定
将Sharma等[21]的方法改良。配制3.55×10–5 g/mL的DPPH-无水乙醇溶液和不同浓度梯度的样品糖母液。取100 μL样品糖溶液, 加入200 μL DPPH溶液, 混合摇匀后置无光环境中反应20 min, 于波长517 nm处测定其吸光度。以去离子水作空白组, 无水乙醇作为对照组, 按公式(3)计算样品糖对DPPH自由基的清除率。
| $ C\left( \% \right){\text{ = }}\left( {{\text{1}} - \frac{{{A_{{\text{sample}}}} - {A_{{\text{control}}}}}}{{{A_{{\text{blank}}}}}}} \right) \times {100\% }, $ | (3) |
式中, C(%)为清除率, A为吸光度。
1.5.2 免疫调节活性将RAW 264.7细胞用RPMI 1640完全培养基(含10% FBS和1%双抗)复苏并传代。加入待测样品及阳性对照LPS, 设置空白组, 每组6个平行, 培养24 h。采用Griess A与Griess B混合法测定NO含量以及MTT含量[22]。根据酶联夹心法ELISA试剂盒说明书操作检测其中细胞因子的含量。
1.6 数据处理与分析采用SPSS 27.0软件包进行统计学评价。数据以3次重复的均值±标准差表示。字母相同的组之间没有显著差异。不同字母表示不同组别的多重比较有显著差异。
2 结果与讨论 2.1 栉孔扇贝内脏粗多糖提取工艺优化不同提取条件对栉孔扇贝内脏多糖的提取效果影响很大, 蛋白酶的种类、酶解时间和酶解温度等因素都会对多糖的提取效率产生影响。因此, 本研究对栉孔扇贝内脏粗多糖的提取工艺进行优化, 探究最适提取条件, 优化的结果如图 1所示。首先, 选取6种不同的蛋白酶进行单独酶解探究不同的蛋白酶对提取工艺的影响, 结果表明, 中性蛋白酶和胰蛋白酶在单独酶解时的效果最好。由于多种酶复合酶解可能发挥协同作用从而比单一酶酶解的效果更好, 因此进一步选取两种酶解效果较好的中性蛋白酶和胰蛋白酶进行复合酶解, 如图 1b所示, 中性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶解效果高于这两种酶单独使用的效果, 因此后续实验采取中性蛋白酶和胰蛋白酶复合方式进行粗多糖的提取。将中性蛋白酶和胰蛋白酶分别以1∶0.25、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例进行酶解, 筛选最佳复合酶比例, 结果如图 1c所示, 当中性蛋白酶和胰蛋白酶比例为1∶2时, 酶解效果最好。之后逐渐提高加酶量, 发现当酶添加量增加至0.60%时栉孔扇贝多糖提取促进效果已无显著性差异(图 1d)。pH条件优化由图 1e所示, 酸性范围栉孔扇贝多糖提取效果相对较差, 中性与碱性范围栉孔扇贝多糖提取效果较好且两种pH环境下多糖的提取效果相差不大, 出于操作简单与成本的考虑, 选用pH=7的用于后续实验。
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| 图 1 栉孔扇贝内脏粗多糖提取工艺优化 Fig. 1 Optimization of the extraction process of crude polysaccharides from Chlamys farreri viscera 注: 数据以3次重复的均值±标准差表示, 字母相同的组之间没有显著差异, 不同字母表示不同组别的多重比较有显著差异 |
酶解时间对多糖的提取效率和纯度有显著影响。酶解时间过短, 酶与底物反应不充分, 蛋白降解不完全, 提取率和纯度较低; 酶解时间过长, 多糖在酶的作用下降解, 提取率下降, 因此需要找到最佳酶解时间保证多糖提取率最大化。将匀浆脱脂后的栉孔扇贝内脏分别以0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h的时间进行酶解, 结果如图 1f所示, 酶解效果逐渐增强, 2 h达到最高, 之后逐渐减弱, 由此可以证明最优酶解时间为2 h。最后进行了最佳酶解温度的选取, 图 1g可见, 酶解温度由20 ℃逐级升至40 ℃时, 栉孔扇贝粗多糖的提取效果逐渐增强, 但超过40 ℃后提取效果减弱。在酶解温度变化初期, 物质分子的运动速率随着温度的升高而增加, 从而扩散速率增加, 所以多糖的提取率上升; 后期随着温度升高到一定程度对酶活力产生影响, 导致提取率下降。因此酶解温度选取40 ℃为宜。
通过上述单因素实验验证, 最终得到的栉孔扇贝内脏多糖提取的工艺最佳条件是中性蛋白酶和胰蛋白酶以1∶2的比例复合酶解, 加酶量0.60%, 40 ℃, 酶解2 h, pH为7。中性蛋白酶与胰蛋白酶的协同作用拓宽了酶解位点, 二者互补显著提高酶解效果, 该工艺较单一酶体系的酶解效果好, 且酶解时间短, 酶解条件温和。
2.2 栉孔扇贝内脏粗多糖的离子交换色谱分离通过DEAE-52离子交换柱分级洗脱得到如图 2所示洗脱曲线。由图 2可见, 0、0.1、0.2、0.4 mol/L的NaCl溶液分别将栉孔扇贝内脏分离成栉孔扇贝内脏多糖1(CFP1)、栉孔扇贝内脏多糖2(CFP2)、栉孔扇贝内脏多糖3(CFP3)和栉孔扇贝内脏多糖4(CFP4) 4个组分。通过高效液相色谱法鉴定分离获得的栉孔扇贝内脏多糖的分子量。结果如图 3所示, 4个组分均呈现不止一个色谱峰, 说明CFP1~4的分子量分布均不均一, 仍包含两种或多种不同分子量的多糖组成, 需进一步纯化。
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| 图 2 栉孔扇贝内脏多糖的DEAE-52离子交换色谱洗脱曲线 Fig. 2 Elution curve of DEAE-52 ion exchange chromatography of Chlamys farreri visceral polysaccharide |
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| 图 3 CFP1、CFP2、CFP3和CFP4的分子量 Fig. 3 Molecular weights of CFP1, CFP2, CFP3, and CFP4 注: Mw为分子量 |
DEAE-52是一种阴离子交换树脂, 其分离主要基于多糖的电荷密度差异。在洗脱过程中, 不同盐浓度的氯化钠通过竞争性置换作用, 使不同电荷密度的多糖依次洗脱。然而, 同一洗脱峰内的多糖可能具有相似的电荷特性, 但分子量分布仍存在差异, 这是因为天然多糖常具有分支结构或不同糖苷键连接方式, 导致同一电荷密度下分子量不均一, 并且硫酸基或糖醛酸的差异可能使电荷密度相近但分子量不同的多糖被同一盐浓度洗脱, 从而导致CFP1~4的分子量分布不均一。
对分离获得的4种扇贝内脏粗多糖的生物活性进行初步的研究和比较。4种多糖组分的抗氧化活性结果如图 4所示, CFP1和CFP4具有更强的超氧阴离子清除活性, 在样品浓度为0.1 mg/mL时, CFP4对超氧阴离子的清除率为66.7%。图 4b为4种多糖组分的还原力测定, 明显可以看出CFP4的还原力效果最好, 并与样品浓度呈正相关, CFP1、CFP2和CFP3还原能力较低, 且没有显著性差异。同时, DPPH清除活性和羟自由基清除活性也表明, CFP4的活性明显好于CFP1~3, 且呈现浓度依赖性(图 4c, 4d)。
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| 图 4 CFP1、CFP2、CFP3和CFP4的抗氧化活性 Fig. 4 Antioxidant activities of CFP1, CFP2, CFP3, and CFP4 注: 数据以3次重复的均值±标准差表示, 字母相同的组之间没有显著差异, 不同字母表示不同组别的多重比较有显著差异 |
进一步采用小鼠巨噬细胞RAW264.7对4种粗多糖组分的细胞毒性和免疫调节活性进行了研究。图 5a为通过MTT法测得的相应浓度下这4种多糖组分的存活率, 均超过80%, 说明此浓度下的多糖对细胞无毒。图 5b是4种组分刺激RAW264.7巨噬细胞的NO含量, 4种多糖组分都显示出良好的免疫调节效果, 其中CFP4活性最佳, 30 μg/mL的CFP4对细胞的刺激效果就与LPS相似, 表明其具有较强的免疫调节活性。
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| 图 5 CFP1、CFP2、CFP3和CFP4对小鼠巨噬细胞RAW264.7的免疫调节活性 Fig. 5 Effect of CFP1, CFP2, CFP3, and CFP4 on the immunostimulatory activity of RAW264.7 mouse macrophages 注: 数据以3次重复的均值±标准差表示, 字母相同的组之间没有显著差异, 不同字母表示不同组别的多重比较有显著差异 |
综合以上结果, 相对于其他3个组分CFP1~3, CFP4表现出最佳的抗氧化活性和免疫调节活性, 因此后续选取CFP4进一步分离纯化。
2.3 栉孔扇贝内脏多糖CFP4的分离纯化与生物活性研究 2.3.1 栉孔扇贝内脏多糖CFP4的凝胶排阻色谱分离将CFP4使用凝胶排阻色谱Sephadex G-100层析柱进一步纯化, 结果如图 6所示, 按照不同分子量分布, Sephadex G-100将CFP4分为栉孔扇贝内脏多糖4-G1(CFP4-G1)、栉孔扇贝内脏多糖4-G2(CFP4-G2)和栉孔扇贝内脏多糖4-G3(CFP4-G3)3个组分。
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| 图 6 栉孔扇贝内脏多糖CFP4的SephadexG-100凝胶排阻色谱洗脱曲线 Fig. 6 Elution curve of Chlamys farreri visceral polysaccharide CFP4 using a SephadexG-100 column |
通过高效液相色谱法鉴定栉孔扇贝内脏多糖的纯度。结果如图 7所示, CFP4-G1和CFP4-G2的分子量都不均一, 且分子量较大, 分别为335 630 Da和55 080 Da, 这是因为CFP4中高分子量组分可能超出Sephadex G-100层析柱的排阻极限, 导致混合洗脱, 从而分子量分布不均一; 但是CFP4-G3的液相谱图为一个对称的色谱峰, 在Sephadex G-100分离范围内, 分子量分布均一, 平均分子量为4 935 Da, 具有较好的应用开发潜力。因此, 选取均一性多糖组分CFP4-G3进一步研究, 对其理化性质和生物活性进行研究。
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| 图 7 高效液相凝胶排阻色谱测定CFP4-G1、CFP4-G2和CFP4-G3的分子量 Fig. 7 Molecular weights of CFP4-G1 (a), CFP4-G2 (b), and CFP4-G3 (c) 注: Mw为分子量 |
CFP4-G3的化学成分分析见表 1。CFP4-G3的总糖质量分数为29.82%, 糖醛酸质量分数为4.081%左右, SO42–质量分数为4.333 5%, 糖胺聚糖质量分数为38.21%。CFP4-G3的总糖质量分数略高于徐美玲[23]纯化的鲍鱼内脏多糖(24.5%), 但其含量仍然较低。值得注意的是, 苯酚-硫酸法测定的总糖是一个相对值, 通常都是以葡萄糖作为标准品建立校准曲线, 但不同单糖标准品与苯酚-硫酸的显色范围不同, 尤其葡萄糖和氨基葡萄糖其显色范围相差上百倍[24], 因此, 对于含有氨基葡萄糖的扇贝内脏多糖等杂多糖来说, 采用苯酚-硫酸法以葡萄糖作为标准品测得的总糖会相对偏低。
| 总糖/% | 糖醛酸/% | 糖胺聚糖/% | SO42–/% | |
| CFP4-G3 | 29.82 | 4.081 | 38.21 | 4.335 |
与已有报道的软体动物来源多糖相比, CFP4-G3的糖醛酸与宋荪阳等[25]在扇贝性腺中提取的4%的糖醛酸结果相近。CFP4-G3的SO42–质量分数为4.335%, 而徐美玲[23]测得的虾夷扇贝内脏多糖的SO42–质量分数为5.1%, 栾君笑[26]报道的扇贝裙边SO42–质量分数为6%。本研究获得的均一性扇贝内脏多糖CFP4-G3硫酸根总体略低于以往报道的其他扇贝多糖的硫酸根, 较低的硫酸化程度可减少多糖分子间的静电排斥力, 增强水溶性, 提高溶解性与生物利用度。另外, CFP4-G3的糖胺聚糖质量分数为38.21%, 远高于孟东等[27]提取的蜗牛糖胺聚糖的质量分数, 其质量分数只有16%左右。但低于戴梓茹等[28]测得的近江牡蛎49%的糖胺聚糖质量分数。
红外光谱能够给出多糖糖环及糖类部分特征官能团的结构信息。根据图 8a可以看出CFP4-G3在3 298 cm–1附近有较宽的吸收峰, 对应O-H和N-H的伸缩振动。2 923 cm–1处为C-H的伸缩振动, 存在-CH2-[29]。1 553 cm–1、1 637 cm–1处出现酰胺基的C=O伸缩振动[30]。COOH中O-H的变角振动出现在1 402 cm–1处说明有糖醛酸存在[31]。1 230 cm–1为S=O伸缩振动, 在1 039 cm–1附近的吸收峰归属于吡喃环上C-O的伸缩振动[11]。在844 cm–1附近的吸收峰是C-O-S的轴向配位的伸缩振动[32], 红外光谱分析表明, CFP4-G3是一种典型的氨基多糖结构。进一步选用紫外光谱CFP4-G3进行分析, 结果如图 8b所示, 紫外扫描在260 nm和280 nm处未见明显吸收峰, 说明CFP4-G3中不含有核酸及蛋白质杂质。
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| 图 8 CFP4-G3的红外光谱表征(a)和紫外光谱分析(b) Fig. 8 FTIR spectral analysis of CFP4-G3 (a) and UV spectral analysis of CFP4-G3 (b) |
通过PMP柱前衍生高效液相色谱进一步测定CFP4-G3的单糖组成与比例, 得到的结果如图 9及表 2所示。CFP4-G3的单糖组成较为复杂, 主要由甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸及半乳糖醛组成。CFP4-G3含有动物多糖特有的氨基糖, 其单糖组成与高缘等[3]对栉孔扇贝不同部位多糖测得的单糖组成成分相似, 并且与Song等[11]研究的虾夷扇贝内脏多糖中的单糖组成成分也相对一致。CFP4-G3单糖组成以氨基葡萄糖为主, 推测CFP4-G3可能是含有中性糖侧链的糖胺聚糖, 同时也注意到CFP4-G3十分复杂, 可能是源于内脏作为代谢活跃组织, 其多糖合成可能涉及多条酶促途径, 并且其分泌的多糖可能通过单糖组合的复杂性来实现功能适配。复杂的单糖结构增强了结构多样性, 也可能带来更为丰富的生物活性。
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| 图 9 CFP4-G3的单糖组成测定 Fig. 9 Monosaccharide composition of CFP4-G3 |
| 样品 | 甘露糖 | 氨基葡萄糖 | 鼠李糖 | 葡萄糖醛酸 | 半乳糖醛酸 | 氨基半乳糖 | 葡萄糖 | 半乳糖 | 木糖 | 阿拉伯糖 | 岩藻糖 |
| CFP4-G3 | 1.000 | 1.877 | 0.979 4 | 0.715 1 | 0.946 5 | 0.702 3 | 1.667 | 1.128 | 0.840 9 | 0.711 0 | 0.983 3 |
CFP4-G3的抗氧化活性测定结果如图 10所示, CFP4-G3保持较强的是对超氧阴离子清除能力(图 10a), 在样品浓度0.05 mg/mL时的清除率已经达到60%。还原力是衡量抗氧化剂活性的重要指标之一。还原力较强的物质能有效给出电子, 清除自由基, 减少氧化损伤。因此, 还原力强的抗氧化剂通常抗氧化活性更高。如图 10b所示, CFP4-G3具有较强的还原能力, 在样品浓度0.8 mg/mL时, 其OD值达到了1.2, 高于已有报道的海湾扇贝多糖的还原力(海湾扇贝多糖浓度需要5 mg/mL才能达到1.2的OD值)[33]。栉孔扇贝内脏多糖表现出较强的还原性, 能够破坏机体内的自由基反应链, 从而起到抗氧化的作用。
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| 图 10 CFP1、CFP2、CFP3和CFP4的抗氧化活性 Fig. 10 Antioxidant activities of CFP1, CFP2, CFP3, and CFP4 注: 数据以三次重复的均值±标准差表示, 字母相同的组之间没有显著差异, 不同字母表示不同组别的多重比较有显著差异 |
DPPH检测是一种常用的用于评估抗氧化活性强度的检测方法。抗氧化剂能够与DPPH自由基捐赠或共享电子, 稳定DPPH自由基, 从而减少DPPH的吸收度。图 10c是CFP4-G3对DPPH清除能力的测定结果。在样品浓度0.2 mg/mL时CFP4-G3的清除率已经达到80%, 远高于刘雨博等[34]报道的虾夷扇贝多糖的DPPH清除活性, 其提取的虾夷扇贝多糖需要8 mg/mL的浓度才能达到80%。由此可见栉孔扇贝多糖CFP4-G3具有很强的DPPH清除活性。
羟基自由基是氧化性最强和对生物体危害最大的自由基, 几乎能与生物体的各种细胞成分发生反应, 包括糖、蛋白质、氨基酸和脂质。CFP4-G3羟自由基清除能力如图 10d所示, 在样品浓度为2 mg/mL时, 羟自由基清除率达到98.4%, 高于虾夷扇贝裙边多糖的羟自由基清除活性。栾君笑[26]制备的虾夷扇贝裙边糖浓度为10 mg/mL时, 羟自由基的清除率才达到最大值90.68%。
综合上述分析, 栉孔扇贝内脏多糖具有非常强的抗氧化性。多糖的抗氧化活性与其分子结构紧密相关, 如糖的种类、支链的数量、糖之间的连接类型以及是否含有如硫酸基或氨基等结构特征。多糖的结构解析结果表明, 栉孔扇贝内脏多糖CFP4-G3是一种极为复杂的多糖。但本研究对其结构的研究还不透彻, 推测栉孔扇贝内脏多糖有较多的分支结构, 结构复杂性高, 可能提供更多的活性位点与自由基反应, 进而显示出更强的抗氧化活性。
进一步采用小鼠巨噬细胞体外模型对CFP4-G3的细胞毒性和免疫调节活性进行研究。如图 11a所示, CFP4-G3在测定浓度1~25 μg/mL下细胞无毒, 可用于后续实验。NO是一种高反应性自由基, 也是调节免疫反应的重要信号分子, 如图 11b所示, CFP4-G3能够显著促进小鼠巨噬细胞NO的释放, 在浓度为7.5 μg/mL时NO表达量与阳性对照LPS没有显著性差异, 表明CFP4-G3具有较高的免疫刺激活性。TNF-α和IL-6也是免疫系统中两种重要细胞因子, 在宿主防御和免疫反应中起着至关重要的作用[35], 我们的研究结果表明, CFP4-G3也能够显著促进TNF-α和IL-6两种细胞因子的产生(图 11c和d), 且都表现出良好的浓度依赖性, 表明CFP4-G3可以通过刺激细胞因子的分泌调节机体免疫反应。
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| 图 11 CFP4-G3对小鼠巨噬细胞RAW264.7的免疫调节活性 Fig. 11 Effect of CFP4-G3 on the immunostimulatory activity of RAW264.7 mouse macrophages 注: 数据以3次重复的均值±标准差表示, 字母相同的组之间没有显著差异, 不同字母表示不同组别的多重比较有显著差异 |
天然活性多糖能够被机体免疫细胞表面的TLR2/ TLR4、Dectin-1、MR等模式识别受体识别, 进而触发胞内的NF-κB、PI3K/Akt、MAPK等多种经典的免疫调节信号通路[36], 诱导巨噬细胞NO、TNF-α和IL-6等免疫因子的释放, 激发机体的固有免疫反应[37]。CFP4-G3能够显著促进小鼠巨噬细胞TNF-α和IL-6的释放, 且呈现呈现剂量依赖性, 可能与巨噬细胞表面的模式识别受体结合有关。CFP4-G3单糖组成复杂, 含有丰富的活性位点, 如硫酸基、氨基、羧基等均可能促进其与模式识别受体的相互作用, 其具体的受体识别与免疫调控机制有待进一步深入研究。
近年来, 常见的贝类研究多集中在肌肉组织, 而内脏等副产物利用率较低, 本研究以栉孔扇贝内脏副产物作为原料, 采用复合酶解与分离纯化策略获得了一种低分子量活性多糖, 并且发现栉孔扇贝来源多糖结构多样且复杂, 分离纯化的均一多糖CFP4-G3由11种单糖组成, 结构复杂性远超近江牡蛎(4种)和青蛤多糖(5种)[38], 可能形成多重活性位点, 并展现出较强的抗氧化和免疫调节活性, 这些结果为扇贝内脏副产物在功能食品领域的进一步应用开发奠定理论基础。后续将进一步聚焦CFP4-G3的精细结构与免疫调控机制研究, 推动新型天然糖胺聚糖的发现以及扇贝多糖在生物医药领域的应用开发。
3 结论本文以栉孔扇贝副产物资源的综合利用为切入点, 栉孔扇贝内脏副产物为原料, 通过单因素实验建立粗多糖粗多糖最适制备条件。进一步通过DEAE-52离子柱以及Sephadex G-100凝胶柱分离纯化, 得到均一多糖CFP4-G3。其平均分子量为4 935 Da, 糖醛酸为4.081%, 硫酸根为4.335%, 总糖为29.82%, 糖胺聚糖含量38.21%。其红外吸收光谱、紫外光谱及核磁结果表明其符合氨基多糖的特征, 并且不含蛋白质以及核酸。其单糖组成较为复杂, 包括甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和岩藻糖, 推测其可能为一种带有支链结构的糖胺聚糖。同时, 生物活性研究表明CFP4-G3具有较强的抗氧活性及免疫调节活性, 可进一步开发用于功能食品或生物医药领域。
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