2025, Vol. 49
文章信息
- 刘万, 张晓臣, 赵春暖, 张浩瑜, 杨李俊淞, 韩怡静, 高雁, 王晓通. 2025.
- LIU Wan, ZHANG Xiaochen, ZHAO Chunnuan, ZHANG Haoyu, YANG Lijunsong, HAN Yijing, GAO Yan, WANG Xiaotong. 2025.
- microRNA-183-5p通过调控MITF基因影响长牡蛎黑色素形成
- Regulation of melanin formation in Crassostrea gigas by microRNA-183-5p via MITF gene
- 海洋科学, 49(7): 63-72
- Marine Sciences, 49(7): 63-72.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250225001
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文章历史
- 收稿日期：2025-02-25
- 修回日期：2025-04-10
2. 烟台市海洋经济研究院, 山东 烟台 264003
2. Yaitai Marine Economic Research Institute, Yantai 264003, China
长牡蛎(Crassostrea gigas)又名太平洋牡蛎, 俗名生蚝、海蛎子, 属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、牡蛎目(Ostreoida)、牡蛎科(Ostreidae), 并具体归类于巨牡蛎属(Crassostrea)[1]。长牡蛎作为一种全球性分布的双壳贝类, 是中国重要的贝类养殖品种, 具有较高的经济价值[2]。长牡蛎凭借其丰富的优质特性构成了贝类种质资源中不可或缺的一个部分[3-4]。软体动物的外壳主要由外套膜的外褶皱产生, 各种类型的色素从边缘外套膜分泌出来, 然后融入外壳的外表面层[5-6]。其中, 长牡蛎具有各类优质性状, 是贝类种质资源中至关重要的组成部分[3]。贝壳的颜色主要是由于生物色素的存在, 其中黑色素是形成壳色的关键成分[7]。黑色素是一种天然色素, 广泛存在于动植物中[8], 并且具有色素沉着、自由基清除和辐射防护等作用[9]。在贝类研究中, 如HAN等[10]发现在长牡蛎外壳及外套膜组织中富含大量的黑色素。LI等[11]发现黑色素由外套膜产生并影响贝壳颜色。郝世鑫等[12]在紫贻贝(Mytilus edulis)贝壳中成功提取黑色素。王晓娜等[13]在栉江珧(Atrina pectinata)和旗江珧(Atrina vexillum)贝壳中成功提取黑色素。这一发现为后续深入研究长牡蛎黑色素的合成机制、功能特性以及其在长牡蛎生长、防御等生理过程中的作用, 奠定了坚实的物质基础。与此同时, 牡蛎作为贝类研究的模式生物, 研究其所含的色素具有广泛的生物学意义。
microRNA(miRNA)是一类长度约为19~25 nt的非编码调控单链小分子RNA, 在生命活动中扮演着至关重要的角色, 通过调控基因表达来发挥作用。作为后生动物中基因表达的关键调控因子, miRNAs通过2种主要机制来调节目标基因的表达: 一是促进mRNA的降解, 二是抑制mRNA的翻译过程[14-15]。研究报道了miRNA在多种生物过程中发挥着关键作用, 涉及生长发育[16]、细胞增殖[17]、细胞凋亡及免疫调节[18-19]等。miRNA对黑色素合成的调控已成为生物体色素沉着领域的研究热点。目前, 已在多种生物体中开展miRNA对黑色素调节作用的研究, 主要集中在生物体的体表和毛发颜色。例如, miR-221-3p可能通过调控靶基因并抑制其表达, 进而减少黑色素细胞中的黑色素含量, 从而影响湘猪肤色的形成[20]。miR-8直接作用于发育中的表皮, 可能通过调控新的靶基因来调节色素沉着的空间模式, 其缺失会导致雌性果蝇腹部背面色素沉着减少[21]。miR-206沉默导致MC1R表达上调以及黑色素细胞增殖和迁移能力增强, 从而对锦鲤皮肤颜色的分化和色素沉着起到调控作用[22]。还有研究表明, miR-138-5p和miR-722可能在调控色素沉着过程中起重要作用, 从而对红罗非鱼皮肤颜色分化产生影响[23]。因此, miRNA在色素沉积中的作用不容忽视。miR-183-5p是miRNA-183/96/182簇中的一员, 该簇具有高度保守性, 位于人类染色体7q的基因间区域[24]。miR-183-5p是一种重要的调控因子, 主要在黑色素细胞中发挥核心作用, 能够通过抑制黑色素合成相关基因的表达, 进而影响黑色素的形成过程[25-26]。尽管对双壳贝类miR-183-5p的研究很少, 但由于其具有高度保守的特性, 通过参考其他物种的相关研究, 能够为贝类miR-183-5p研究的顺利开展提供基础。
小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-associated transcription factor, MITF)是黑色素细胞发育和黑色素合成的关键调控因子[27-28]。MITF通过转录调控3个主要的色素合成酶: 酪氨酸酶(Tyrosinase, Tyr)、酪氨酸酶相关蛋白1(Tyrosinase related protein1, Tyrp1)和酪氨酸酶相关蛋白2(Tyrosinase related protein 2, Tyrp2), 从而对色素沉着过程起到关键作用[29]。MITF于1942年首次在辐射诱导的小鼠(Mus musculus)中被发现[30]。目前, 越来越多的研究表明, MITF在动物体色和毛发中的黑色素合成过程中发挥着调节作用, 并且与贝类壳色的形成有着密切的联系。在脊椎动物中, 羊驼(Vicugna pacos)白色被毛皮肤组织中MITF基因表达量显著低于棕色被毛皮肤组织[31]。白绒乌鸡(Gallus gallus domesticus)中MITF基因高表达可能有助于体内黑色素的形成[32]。在双壳贝类中, 紫色贻贝(Mytilus edulis)中MITF的表达高于白色贻贝, 表明MITF在黑色素合成和贝壳着色中起重要作用[33]。MITF可能还参与长牡蛎贝壳形成早期黑色素的产生过程, 并且有可能调控酪氨酸酶Tyr2基因, 进而参与外套膜和贝壳中黑色素的形成[34]。此外, 随着测序技术和验证实验的发展, 关于miRNA与靶基因相互作用的研究方法已较为成熟。多种miRNA被证明通过与靶基因3′端非编码区(3′UTR)结合, 从而调控黑色素的合成。miR-137通过调控TYR基因的表达, 从而影响菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)贝壳颜色的形成[35]。miR-15b通过调控TYR的表达, 从而影响三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)珍珠层颜色的形成[36]。与此同时, miRNA是调控生物性状的重要分子, 以往研究多集中于其靶基因的筛选、验证和功能等方面, 而具体的分子调控机制却不清楚。因此, 本研究从分子功能解析的角度初步探究miRNA调控长牡蛎黑色素形成的分子机制。基于此, 本研究假设miR-183-5p可能通过靶向MITF基因来调节长牡蛎黑色素的形成, 为贝类黑色素的形成机制解析提供新的研究方向, 亦可为软体动物特色性状解析研究提供理论参考。此外, 本研究虽证实MITF是miR-183-5p的靶基因, 但鉴于黑色素合成的复杂调控网络, miR-183-5p是否通过其他靶基因参与该过程仍有待深入探索。
1 材料与方法 1.1 样品采集与制备实验中使用的长牡蛎购自山东烟台一个当地养殖场。选取黑白条纹相间的个体。在实验开始之前, 将长牡蛎放在循环海水(温度20 ℃左右、盐度25 ± 0.5、溶解氧大于5.0 mg/L)中暂养1周。挑选5只活性较好的个体, 在无菌条件下, 分别取黑色外套膜和白色外套膜组织样品, 迅速放入液氮冷冻, 并在–80 ℃保存备用。
1.2 总RNA提取和第一链cDNA合成使用RNAiso plus试剂从太平洋牡蛎的各个组织中提取总RNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量, 并使用Nanodrop ND 2000分光光度计检测其RNA浓度。然后使用Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒(Accurate Biotechnology, China)进行第一链cDNA合成。上述所有步骤均严格依据说明书的指导进行操作。
1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)按照SYBR®Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒进行操作。使用上述合成的cDNA作为模板。根据XU等[37]的研究证明miR-183-5p序列。miR-183-5p和色素相关基因分别以U6和β-actin作为内参基因。本研究使用Primer 5软件进行引物设计, 利用软件功能规避引物二聚体形成、排除非特异性结合位点, 保证引物特异性。随后对样本进行扩增, 并通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。若电泳结果呈现单一目标条带, 则可初步证明扩增产物特异性达标。最后, 运用qRT-PCR技术观察扩增曲线是否呈单一峰形, 进一步验证扩增产物特异性。qRT-PCR引物序列(表 1)。条件设定: 预变性95 ℃ 30 s, 后95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s进行40个循环, 然后进行溶解曲线分析95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s。每个样本设定3个重复, 利用2 –ΔΔCT的方法来计算数值。
| 引物名称 | 引物序列 | 应用 |
| miR-183-5p-R | AATGGCACTGGTAGAATTCACGG | qRT-PCR |
| miR-183-5p-F | GTGCGTGTCGTGGAGTC | qRT-PCR |
| Tyr6-F | TTAAGCAGGAGAAGACTCGC | qRT-PCR |
| Tyr6-R | GAAGATGGGATCAAACCAAG | qRT-PCR |
| Tyr8-F | TGGCGTCCATAACTACATCG | qRT-PCR |
| Tyr8-R | CTGAAAGCAACCCACAGAAG | qRT-PCR |
| Typ-F | AGATGGCGTTTGTGATGTC | qRT-PCR |
| Typ-R | CAGGTATGAACTGGTCCCG | qRT-PCR |
| Typ1-F | AAACAGACCTATGGACCTTTACGA | qRT-PCR |
| Typ1-R | GTTGGTAGCACAGGAAGGCATA | qRT-PCR |
| Typ2-F | GACTACTGACAGCGAGATGATGG | qRT-PCR |
| Typ2-R | GAATCTTCCAAAGGGTCCAGTC | qRT-PCR |
| Typ3-F | GTAAGGACAGGTTTCTGTGGCAA | qRT-PCR |
| Typ3-R | GGCATCTCGTCTGGGTAATCG | qRT-PCR |
| U6-F | ATTGGAACGATACAGAGAAGATT | qRT-PCR |
| U6-R | ATTTGCGTGTCATCCTTGC | qRT-PCR |
| β-actin-F | GTGCTACGTTGCCCTGGACTT | qRT-PCR |
| β-actin-R | TCGCTCGTTGCCAATGGTGAT | qRT-PCR |
通过RNAhybrid网站(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)预测miR-183-5p的靶基因。根据预测结果, 筛选出miR-183-5p的潜在靶点: ΔG ≤ –15 kcal/mol作为miR-183-5p的靶基因。
1.5 miR-183-5p体内过表达和抑制实验miR-183-5p模拟物、miR-183-5p抑制剂和阴性对照由吉玛公司(上海, 中国)合成。所有长牡蛎在实验开始前在循环海水中暂养7 d。实验分为miR-183-5p模拟物组、miR-183-5p抑制剂组以及阴性对照组, 且每组有6只。使用5%硫酸镁进行麻醉后注射10 μg到闭壳肌中。每4 d注射1次, 共注射8 d。注射完成后, 对外套膜组织取样并提取总RNA, 用于后续实验。
1.6 细胞培养及转染目前, 由于没有已知的软体动物细胞系可用于质粒转染, 因此, 使用人的HEK-293T细胞[38]。HEK-293T细胞在温度为37 ℃且含有5% CO2的培养箱中进行培养[39]。构建了pmirGLO-MITF-WT质粒和pmirGLO-MITF-MUT质粒[40]。当细胞数量约占培养皿的80% ~ 90%时既可进行细胞传代或质粒转染。使用Lipofectamine 2000试剂(美仑生物, 中国)根据制造商的说明书将质粒转染。
1.7 双荧光素酶报告基因测定将HEK-293T细胞接种到24孔培养板中, 细胞密度约为80%~90%时即可进行转染。然后, 将pmirGLO-MITF-WT+miR-183-5p模拟物/阴性对照和pmirGLO-MITF-MUT+miR-183-5p模拟物/阴性对照分别转染到HKE-293T细胞中。转染48 h后, 使用Dual-Glo®荧光素酶检测系统试剂盒(Promega, USA)检测荧光素酶活性。
1.8 马松丰塔纳黑色素染色取处理后的外套膜组织块置于4%多聚甲醛中固定, 常规脱水, 浸蜡, 包埋, 切片。根据制造商的说明书, 使用马松丰塔纳染色试剂盒(索莱宝, 中国)进行黑色素染色。将样品切片(6 mm厚)入Fontana氨银溶液, 于56 ℃温箱避光染色40 min, 经蒸馏水多次浸洗后, 再放入海波溶液染色3 min, 最后用中性红染液复染2 min。最后, 在显微镜(Nikon Corporation, CI-L, Japan)下观察组织样品。
1.9 统计分析使用SPSS软件(IBM, Chicago, IL, USA)对文中所有数据进行t检验, 分析其显著性差异。计量资料以“均值±标准差(x±s)”来表示。P＜0.05的差异具有统计学意义。
2 实验结果 2.1 miR-183-5p在黑色和白色外套膜的表达情况对黑白纹壳牡蛎的观察发现, 壳上黑色和白色部位的分布与外套膜上的分布具有高度的相关性。贝壳上放射性分布的黑色和白色部位与外套膜的放射状分布呈一一对应关系[图 1(a)]。分别提取长牡蛎外套膜组织的黑色部位和白色部位的总RNA, 并将其反转录得到的cDNA作为模板。将U6作为内参基因, 通过qRT-PCR实验分析miR-183-5p在黑色和白色外套膜中表达的差异性。结果如图 1(b)所示, miR-183-5p在黑色和白色外套膜中均有表达, 但白色外套膜的表达水平显著高于黑色外套膜的表达水平, 且白色外套膜中miR-183-5p的相对表达量是黑色外套膜中的4.4倍。
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| 图 1 miR-183-5p表达量检测 Fig. 1 miR-183-5p expression assay 注: **表示P＜0.01 |
为探讨miR-183-5p对MITF基因的潜在调控作用, 通过RNAhybrid网站预测二者之间的结合位点。结果表明, 长牡蛎体内的miR-183-5p均与MITF基因3′UTR区域存在部分结合位点(图 2)。经预测, miRNA序列与MITF基因3′UTR区域结合的自由能为–21.4 kcal/mol(图 2), 小于–15 kcal/mol, 表明miR-183-5p与MITF之间具有潜在的相互作用。
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| 图 2 miR-183-5p与MITF基因3′UTR的结合位点预测 Fig. 2 Predicted binding sites of miR-183-5p to the 3′UTR of MITF |
为了验证miR-183-5p对黑色素合成的影响, 将miR-183-5p模拟物、miR-183-5p抑制剂及阴性对照试剂注射到闭壳肌中。通过qRT-PCR检测3组外套膜中黑色素形成的差异表达。U6作为内参基因。如图 3所示, 与对照组相比, miR-183-5p模拟物组表达量显著升高, 且较对照组升高了1.295倍(P < 0.05)。而miR-183-5p抑制剂组表达量则比对照组降低了0.531倍(P < 0.01)。这一结果证明了miR-183-5p对长牡蛎黑色素合成具有正向调控作用。
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| 图 3 qRT-PCR检测注射miR-183-5p模拟物和抑制剂后外套膜中miR-183-5p的表达情况 Fig. 3 qRT-PCR-based detection of the relative expression levels of miR-183-5p in the mantle after the injection of miR-183-5p mimics and inhibitors 注: Negative control: 阴性对照组; miR-183-5p mimics: miR-183-5p模拟物组; miR-183-5p inhibitors: miR-183-5p抑制剂组, *P＜0.05, **P＜0.01 |
为了证明miR-183-5p对MITF有负调控作用, 作者使用含有MITF 3′UTR的荧光素酶报告载体进行双荧光素酶报告基因实验。首先, 我们在pmirGLO双荧光素酶报告载体中构建了MITF 3′UTR野生型或突变型质粒, 并将其miR-183-5p模拟物和阴性对照转染到HEK-293T细胞, 48 h后检测荧光素酶活性。结果如图 4所示, miR-183-5p模拟物可明显降低pmirGLO-MITF-WT的荧光素酶活性, 但pmirGLO-MITF-MUT的荧光素酶活性无显著性变化。综上表明, miR-183-5p与MITF具有靶向负调控关系。
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| 图 4 双荧光素酶报告基因检测实验 Fig. 4 Dual luciferase reporter gene detection assay 注: *P＜0.05 |
马松丰塔纳黑色素染色结果清晰地呈现出了不同的状态。当与阴性对照组进行比较时, 可以明显地观察到, miR-183-5p模拟物组中棕色颗粒的数量相对较少。在显微镜下, 该组的样本中, 棕色颗粒稀疏分布, 与阴性对照组形成了较为鲜明的对比。而与之相反的是, miR-183-5p抑制剂组的样本中棕色颗粒则较多(图 5, 红色箭头所示)。
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| 图 5 长牡蛎外套膜组织的马松丰塔纳黑色素染色 Fig. 5 Masson–Fontana melanin staining of the mantle tissue of C. gigas 注: A: 阴性对照组; B: miR-183-5p模拟物组; C: miR-183-5p抑制剂组; D–F: 分别是A、B和C中黑框区域的放大视图, 红色箭头指示黑色素颗粒 |
为了进一步验证miR-183-5p对黑色素形成的影响, 进行miR-183-5p过表达和抑制实验。我们选取了与黑色素产生相关基因Tyr6、Tyr8和酪氨酶酸样蛋白(Typ)。同时, 还选取了参与酪氨酸通路与黑色素有关的基因酪氨酸酶样蛋白1(Typ1)、酪氨酸酶样蛋白2(Typ2)和酪氨酸酶样蛋白3(Typ3)。通过qRT-PCR检测各个基因在外套膜组织中的表达。结果如图 6所示, miR-183-5p模拟物组Tyr6、Tyr8、Typ、Typ1、Typ2及Typ3基因表达较阴性对照均显著降低(P＜0.05), 其表达量分别下降了0.366倍、0.213倍、0.590倍、0.505倍、0.241倍和0.265倍。而miR-183-5p抑制剂组Tyr6、Tyr8、Typ、Typ1、Typ2及Typ3基因表达则显著升高(P＜0.01), 其表达量分别上升了2.245倍、1.403倍、1.350倍、1.715倍、1.609倍和1.915倍。
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| 图 6 注射miR-183-5p模拟物和抑制剂后外套膜中与黑色素相关基因的表达情况 Fig. 6 Expression of melanin formation–related genes in the mantle after the injection of miR-183-5p mimics and inhibitors 注: *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001 |
miRNA广泛存在于各类生物体内, 其主要以降解靶基因mRNA或者抑制靶基因蛋白质翻译的形式, 来实现转录后抑制调控[41]。miRNA在黑色素合成、基因表达、生长发育、细胞增殖和调亡等方面起着至关重要的作用[16]。其中, miRNA对黑色素合成的调控主要集中在生物体的体表和毛发颜色[42]。有研究表明, miR-137的表达可导致小鼠皮肤颜色从黑色到棕色的变化[43]。miR-9-5p参与调节菲律宾蛤仔贝壳颜色的形成[44]。此外, miR-183被认为在小鼠中对与黑色素合成具有重要调节作用。这项研究结果表明, miR-183过表达被证明能够调控黑色素生成, 从而影响其皮肤颜色变化[45]。本研究通过向长牡蛎体内注射miR-183-5p模拟物和抑制剂, 检测到miR-183-5p模拟物组表达量显著高于阴性对照组, 而miR-183-5p抑制剂组表达量显著低于阴性对照组。此外, 对长牡蛎黑色和白色外套膜组织的检测结果表明, miR-183-5p在白色外套膜中的表达量显著高于黑色外套膜中的表达。因此, 我们发现miR-183-5p表达量的变化与黑色素合成量呈现反向关联, 揭示了miR-183-5p在长牡蛎黑色素合成过程中发挥负调控作用。这一发现为理解贝类色素形成机制提供了新的理论依据。
为了深入地探究miR-183-5p的调控机制, 对其靶基因进行了预测。结果发现, miR-183-5p可能靶向调控MITF基因。由于MITF作为黑色素生成过程的关键调节因子起着重要作用, 且一些研究已经对可能影响MITF表达以及进而调节黑色素生成酶的mRNA水平的miRNA进行了研究[46]。CHEN等[47]研究发现, miR-4504通过靶向调控MITF参与三角帆蚌珍珠层颜色的形成。XU等[48]研究发现, miR-2a和miR-133可能通过负调控MITF参与菲律宾蛤仔黑色素形成。DU等[45]研究同样证明, miR-183调节MITF的表达, 对小鼠黑色素瘤细胞有影响, 说明miR-183确实可以通过调控MITF表达来影响黑色素生成。另外, miRNA与其他靶基因也存在靶向调控作用。例如, miR-380-3p通过靶向Sox6调控羊驼黑色素细胞的黑色素生成[49]。miR-21a-5p通过靶向Sox5增强MITF的表达, 从而调控小鼠黑色素细胞黑色素合成[50]。miR-206通过靶向MC1R参与锦鲤皮肤色素的形成[22]。故本研究通过双荧光素酶报告基因检测及黑色素染色等进一步探究miR-183-5p对长牡蛎色素合成的具体调控机制。研究结果发现, miR-183-5p能够靶向作用于MITF基因并抑制其表达。这一成果进一步表明miRNA参与黑色素生成和皮肤色素沉着。
miRNA是高度保守性的非编码RNA。它不仅能够与靶基因结合, 而且可以通过调控MITF及其下游基因的表达, 从而影响色素沉着表型。ZHANG等[51]发现, miR-508-3p通过靶向MITF, 下调其mRNA和蛋白水平, 进而降低TYR、TYRP1等黑色素生成相关基因的表达, 减少黑色素生成。在其他贝类中也有研究证明, miR-2d通过与MITF的3′UTR区域结合, 抑制MITF的表达。MITF表达量的变化会影响其下游基因(如TYR)的表达, 进而影响黑色素的合成[52]。miR-4504通过调控MITF及其下游基因TYR的表达从而影响珍珠层颜色的形成[47]。故本研究通过检测黑色素相关基因Tyr6、Tyr8、Typ、Typ1、Typ2及Typ3基因表达进一步验证miR-183-5p对黑色素合成的影响。结果显示, miR-183-5p过表达抑制了Tyr6、Tyr8、Typ、Typ1、Typ2及Typ3基因的表达, 从而抑制黑色素的产生。综上表明, miR-183-5p与其他研究一样都发挥负调控作用。这一研究初步阐明miRNA在贝类黑色素合成中的调控作用, 并且有助于深入了解贝类黑色素形成的分子机制, 为揭示贝类色素沉着提供了理论依据。
综上所述, miR-183-5p通过负调控MITF参与了长牡蛎黑色素的形成, 从而进一步揭示了miR-183-5p的作用机制。基于本研究结果假设: miR-183-5p可能在贝类适应环境颜色变化的进化过程中, 通过调控黑色素合成发挥关键作用。在长期进化过程中, miR-183-5p表达变化可能驱动了贝类外壳颜色的多样化, 以适应不同的生态环境。对miR-183-5p功能的深入研究, 不仅有助于阐明miRNA在贝类黑色素合成调控中的作用具有重要的参考价值, 也为深入研究贝类色素沉着的分子机制提供了可能。
4 结论本研究通过系统性的功能验证实验, 证实miR-183-5p能够通过调控靶基因MITF的表达, 在长牡蛎黑色素的形成过程中发挥负调控作用。这一研究不仅加深了对软体动物色素沉着分子机制的理解, 也为长牡蛎的选择性育种提供了理论依据和实践指导, 有助于推动牡蛎养殖业的发展, 提高养殖效益。未来可进一步深入探究这些miRNA的调控机制, 以及它们与其他基因和环境因素的相互作用, 更好地实现对软体动物性状的精准调控和优化育种。
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