2025, Vol. 49
文章信息
- 王旭雷, 郑阵兵, 郇丽, 顾文辉, 牛建峰, 王立军, 解修俊, 张宝玉, 王广策. 2025.
- WANG Xulei, ZHENG Zhenbing, HUAN Li, GU Wenhui, NIU Jianfeng, WANG Lijun, XIE Xiujun, ZHANG Baoyu, WANG Guangce. 2025.
- 我国南海紫杉状海门冬(Asparagopsis taxiformis)的物种鉴定及其溴仿合成关键酶基因克隆
- Species identification and cloning of the haloperoxidases coding genes of Asparagopsis taxiformis from the South China Sea
- 海洋科学, 49(8): 34-43
- Marine Sciences, 49(8): 34-43.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250430004
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文章历史
- 收稿日期：2025-04-30
- 修回日期：2025-06-10
2. 青岛海洋科技中心 海洋生物与生物技术功能实验室, 山东 青岛 266000;
3. 中国科学院海洋研究所 水产品种创制与高效养殖全国重点实验室, 山东 青岛 266000
2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266000, China;
3. State Key Laboratory of Breeding Biotechnology and Sustainable Aquaculture, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266000, China
紫杉状海门冬(Asparagopsis taxiformis (Delile) Trevisan)是一种海产大型底栖红藻, 隶属于红藻门(Rhodophyta)真红藻纲(Florideophyceae)柏桉藻目(Bonnemaisoniales)柏桉藻科(Bonnemaisoniaceae)海门冬属(Asparagopsis Montagne)[1]。同红藻门其他大多数目科相比, 柏桉藻目海藻下属的分类单元和物种多样性并不丰富。柏桉藻目只有1个科柏桉藻科, 柏桉藻科有6属25种, 其中海门冬属仅有3种[2]。海门冬属拉丁学名“Asparagopsis”词义为“类似天门冬(高等植物百合科的一属)”, 因而该属中文名称根据其拉丁词义意译而来[3]。
海门冬属海藻的生活史较为复杂, 异型世代交替, 包括大型的配子体、小型的孢子体和果孢子体三相世代, 其中果孢子体寄生在雌配子体上。这种生活史类型既有真红藻纲红藻典型的“三相世代”特征, 也有红毛菜纲部分红藻“异型世代交替”的特征, 因而具有一定的独特性。由于其较为独特和复杂的生活史特征, 基于经典形态分类学研究方法的海门冬属海藻物种划分几经变更, 产生了诸如“Polysiphonia hildenbrandii Bornet”、“Falkenbergia rufolanosa (Harvey) F.Schmitz”和“Falkenbergia hillebrandii (Bornet) Falkenberg”等多个同物异名。Feldmann等[4]通过培养刺海门冬(Asparagopsis armata Harvey)发现F. rufolanosa实际为刺海门冬生活史的一个阶段。后续相关研究也相继证明了这一点, 因此Falkenbergia属被认定为海门冬属的同物异名[5]。
海门冬属海藻的主要形态特征包括: (1)藻体(配子体)紫红色, 由匍匐枝和直立枝组成, 直立枝圆柱状或稍扁压, 上部分枝密, 呈画笔状或狐尾状; (2)藻体内部构造为单轴型, 髓部由薄壁细胞构成, 有腺细胞; (3)孢子体小型, 丝状, 由1个中轴细胞和3个围轴细胞组成, 互生辐射分枝, 四分孢子囊十字形分裂; (4)囊果球形或倒卵形, 有囊柄, 精子囊棍棒状, 生于小枝末端[1, 6]。根据以上特征, 全球范围内共描述了3个海门冬属物种, 分别是刺海门冬、紫杉状海门冬和斯氏海门冬(新拟名)(Asparagopsis svedelii W.R.Taylor)。Taylor [7]基于加拉帕戈斯群岛的海藻样本, 首次描述了斯氏海门冬的形态特征, 但后续并没有进一步报道, 因而斯氏海门冬的分类地位也受到质疑。目前认为产于加拉帕戈斯群岛的物种为紫杉状海门冬, 且被认为是入侵物种, 但尚未进行分子鉴定[8]。近年来, 海门冬属海藻在国际上备受关注, 已有多位学者对海门冬属海藻最新研究进展进行了综述, 其主要原因在于该属物种能够作为牛羊等反刍动物的饲料添加剂高效抑制甲烷排放, 对畜牧业可持续发展和缓解全球气候变化具有重大意义[8-11]。已有研究表明, 海门冬中抑制甲烷排放的主要物质是溴仿, 该物质在海门冬中的详细合成路径仍不十分清晰。随着紫杉状海门冬基因组测序的完成[12-13], 与溴仿合成相关的关键酶已被鉴定, 不同海区来源的海门冬中这些酶的编码基因序列也已被克隆, 且序列存在差异。目前, 海门冬属海藻相关研究集中在物种鉴定和谱系地理学、生物入侵、化学成分和生理生化、生活史和繁殖、卤代化合物合成路径解析和人工养殖等方面, 并取得了系列进展[8]。
根据经典形态学研究, 我国记述了紫杉状海门冬一个物种[1]。该物种是一种经济海藻, 可将采集的新鲜紫杉状海门冬海藻浸泡于淡水中除去苦味后和肉烧食[14]。曾呈奎等[3]也将紫杉状海门冬列入《中国经济海藻志》名录。然而, 作为一种具有重要经济价值和市场前景的新兴海藻养殖对象, 海门冬属海藻相关研究主要由国外学者完成, 国内却鲜见相关研究报道, 这显然与“我国第一海藻养殖大国”的称号相悖。因此, 为加快我国海门冬属海藻基础生物学研究, 提高公众对我国海门冬属海藻的科学认知, 本文初步采集了产于我国南海的海门冬属海藻样品, 开展了形态鉴定和分子系统学分析, 并基于我国样本对海门冬属海藻溴仿合成关键酶基因进行了克隆和比较分析。相关研究结果为深入开展我国紫杉状海门冬研究和资源化利用提供了基础数据。
1 材料与方法 1.1 样本采集与处理样品由王旭雷和何林文于2024年5月采集于海南省文昌市椰林湾(110°52′15″E, 19°31′24″N), 记录采集样本的生境并拍照, 采集的样本放在有一半海水的1 L采集瓶里, 使用报纸将冰袋包裹2~3层, 并和样品瓶一同装入泡沫箱, 24 h内运回实验室。使用灭菌海水将样本冲洗干净, 选择藻体完整且具有繁殖结构的个体制作腊叶标本并编号。选取藻体的主枝、囊果等不同结构用于制作冰冻切片的样品, 同时取0.2 g左右的藻体组织用以提取DNA。
1.2 物种鉴定 1.2.1 形态学研究取外观较为典型的成熟样本放置于直径9 cm的培养皿中, 置于胶片观察灯上(WD-9406型, 中国), 使用照相机(佳能, Powershot D20, 日本)拍照。在解剖镜(尼康, SMZ1500, 日本)下观察藻体外部形态细节并拍照。用刀片切取藻体主轴中段、囊果等部位, 使用包埋剂(樱花, 日本)包埋后, 液氮速冻定型。使用冰冻切片机(Thermo Fisher, CryoStar NX50, 美国)制备冰冻切片, 包埋和切片方法参考王广策等[15]发明专利。将切片放于荧光倒置显微镜(Nikon, Eclipse Ti, 日本)下观察并拍照。
1.2.2 cox2-3基因间隔序列扩增与分子系统发育分析每号样本取约100 mg材料研磨, 使用商品化DNA提取试剂盒E.Z.N.A. Plant DNA Kit(Omega, 美国)提取DNA。以提取DNA为模板, cox2-3基因间隔序列为扩增目的基因, 使用热循环仪(TaKaRa Bio Inc., TP600, 日本)进行聚合酶链式反应(PCR)扩增, 所用引物组合为cox2: 5′-GTACCWTCTTTDRGRRKDAAATGTGATGC-3′, cox3: 5′-GGATCTACWAGATGRAAWGGATGTC-3′[16]。扩增程序如下: 94 ℃ 4 min; 93 ℃ 1 min、45 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min, 5个循环; 93 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s, 30个循环; 72 ℃ 5 min[16]。PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序, 测序成功的序列用于后续的分子系统发育分析。从美国国立生物技术信息中心数据库(NCBI)下载所需参考序列, 与cox2-3基因间隔序列一同进行系统发育分析: 使用MEGA X的ClustalW算法进行多序列联配[17], 根据密码子顺序使用PartitionFinder v2.0[18-19]分隔序列, 根据密码子位点分别计算最优进化模型; 使用RaxML v8.0.0[20]构建最大似然树, 选用GTR+G进化模型, 非参数bootstrap方法设定1 000次重复。序列间的遗传距离在MEGA X中使用Kimura two-parameter模型计算。
1.3 溴仿合成关键酶编码基因克隆和分析以本研究提取的紫杉状海门冬DNA为模板, 根据紫杉状海门冬基因组参考序列[12]设计引物(表 1), 扩增4个溴仿合成关键酶编码基因。PCR扩增条件如下: 98 ℃ 15 s, 54 ℃ 15 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化, 将目的条带使用胶回收试剂盒进行回收, 获得纯化的PCR产物。取4 μL PCR产物和1 μL PMD19-T载体混合, 加入5 μL Solution Ⅰ, 置于16 ℃恒温条件下连接30 min。将连接体系中加入到30 μL的DH5α感受态细胞中, 按照说明书步骤进行转化和涂布平板。将平板置于37 ℃培养箱中进行培养12 h, 挑取单菌落进行测序, 测序成功的序列用于后续比对分析。全球不同地理株系的4个溴仿合成关键酶氨基酸序列在The MEME Suite (https://meme-suite.org/) 网站进行蛋白基序分析。
| 引物名称 | 序列信息5′-3′ |
| Mbb1-F | CGCATAGACAATCCAACATC |
| Mbb1-R | CAGCAAGAACCGCCAATA |
| Mbb2-F | TCCGTCCATAATCAATCCAA |
| Mbb2-R | CCTCCAAGCAATAGTCACA |
| Mbb3-F | AGTTGAGGCGGAGTGGAATG |
| Mbb3-R | ATTTCGGCTATCTGGGAGCG |
| Mbb4-F | ACTGATGATAGCCTGCCAGC |
| Mbb4-R | AGAGCTGTATGCCAGGATGC |
| 注: Mbb源于海洋溴仿生物合成基因座英文首字母缩写(marine bromoform biosynthesis locus, 简称mbb基因座) | |
本研究调查采集的样本包括大型的配子体和小型的丝状孢子体(图 1&2)。配子体藻体直立丛生(图 1a), 紫红色, 直立枝圆柱形, 高度约5~12 cm, 主轴宽1~2 mm, 质软, 直立枝下部常裸露, 上部密被画笔状或狐尾状短枝, 短枝上再生1~2回细密小枝(图 1b&c)。藻体主轴内部构造由皮层和髓层组成, 最外层为较小的长椭圆形皮层细胞, (28~49)×(12~30) μm, 含有叶绿体, 向内为5~6层个体较大、无色的薄壁细胞, (67~152)×(45~ 108) μm, 髓部中央为一较大的空腔(图 1e)。髓层细胞之间常见一些含有内容物的球形细胞, 直径13~17 μm, 可能为腺细胞(图 1f)。囊果球形或倒卵形(图 1g), 具柄(图 1h), 较为均匀地散生于藻体分枝上, 直径0.9~ 1.3 mm, 平均为1.1 mm。横切面观, 成熟囊果中央由小而密集的产孢丝细胞组成, 产孢丝细胞向四周发散, 顶端形成梨形的果孢子, (34~84)×(15~35) μm, 囊果外围由薄壁细胞组成4~5层囊果被(图 1i)。
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| 图 1 紫杉状海门冬配子体形态特征与繁殖结构 Fig. 1 Morphological characteristics and reproductive structures of Asparagopsis taxiformis 注: (a) 紫杉状海门冬生态图; (b) 紫杉状海门冬外部形态, 比例尺=1 cm, 标本号WC183-1; (c) 小枝形态, 比例尺=200 μm; (d) 放大后的小枝形态, 箭头示球形体, 比例尺=25 μm; (e) 藻体主轴横切面观, M: 髓部、C: 皮层, 比例尺=200 μm; (f) 放大后的皮层和髓层, 箭头示腺细胞, 比例尺=25 μm; (g) 成熟的雌配子体, 箭头示囊果, 比例尺=2 mm; (h) 放大后的囊果, 箭头示囊果柄, 比例尺=200 μm; (i) 囊果纵切面观, 箭头示果孢子, 比例尺=50 μm |
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| 图 2 紫杉状海门冬孢子体形态特征 Fig. 2 Morphological characteristics of the sporophytes of Asparagopsis taxiformis 注: (a) 孢子体生态图; (b) 孢子体形态, 比例尺=100 μm, 标本号WC183-3; (c) 放大后的孢子体形态, 比例尺=50 μm; (d) 蓝色荧光激发下的孢子体形态, 比例尺=50 μm |
小型的孢子体紫红色, 外观呈绒球状, 附着在珊瑚石或附生在其他大型海藻藻体上(图 2a)。藻体丝状, 由1个中轴细胞和3个围轴细胞组成(图 2b&c), 分枝不规则, 错综盘结, 每个围轴细胞含有1个球形体(图 2c和d), 直径6~16 μm, 平均为10 μm。
通过研究藻体的外部形态、内部构造和繁殖结构等特征, 结合紫杉状海门冬形态描述比较分析, 本研究所采集的样本符合紫杉状海门冬的鉴定特征, 该物种与其他海域产紫杉状海门冬部分形态特征比较详见表 2。
| 样本名称 | 样本产地 | 囊果直径/mm | 果孢子大小/(长×宽, μm) | 球形体直径/μm | 丝状体宽度/μm | 顶细胞长度/μm | 数据来源 |
| 本研究样本 | 海南岛 | 1.1±0.1 | (54.1±11.6)×(25.0±6.1) | 10.2±2.9 | 42.3±4.4 | 8.7±1.3 | |
| L1 | 夏威夷群岛 | 0.7±0.2 | (50.7±11.1)×(21.1±3.3) | 3.4±0.5 | 19.7±4.3 | 6.9±0.6 | [22] |
| L2 | 夏威夷群岛 | 0.8±0.2 | (74.1±10.7)×(23.9±4.3) | 7.4±1.5 | 37.5±3.1 | 11.7±2.0 | [22] |
| ML2 | 地中海 | 0.7±0.2 | (125.0±22.5)×(48.9±9.0) | 3.3±0.6 | 23.2±5.4 | 6.4±0.4 | [22] |
| L3 | 地中海 | 1.1±0.3 | (75.2±9.9)×(33.4±4.2) | 8.2±2.0 | 46.6±10.0 | 17.2±3.5 | [22] |
| L4 | 夏威夷群岛 | NA | NA | 5.9±1.4 | 38.3±7.6 | 13.3±2.1 | [22] |
| 注: NA表示缺乏数据 | |||||||
本研究扩增了4号样本4条cox2-3基因间隔序列, 其中标本号WC183-1和WC183-2号样本为配子体, WC183-3和WC183-4为孢子体。前三号样本序列完全相同, 标号为WC183-4的样本与其他3号样本具有1个碱基的差异。基于本研究新扩增序列, 结合25条从NCBI下载的全球其他海域紫杉状海门冬相关序列进行分析, 构建了序列长度为306个碱基(nt)的数据集, 其中保守位点276 nt, 变异位点30 nt。基于该数据集构建的最大似然树揭示了全球紫杉状海门冬的L1-L6共6个支系(图 3), 其中每个支系内部平均遗传距离均小于1%(表 3)。我国南海产的紫杉状海门冬与产于夏威夷和哥斯达黎加的2个样本亲缘关系最近, 其遗传距离为0.4%~0.8%, 并和产于南非、斯里兰卡、泰国、以色列和毛里求斯的样本组成L4支系(图 3)。L4支系和L3支系亲缘关系较近, 二者平均遗传距离为3.1%, 均小于和其他支系的遗传距离(表 3), 且形成一个较大的系群, 且支持度为100%(图 3)。我国台湾省也有L2支系, 且和产于意大利、韩国、日本、夏威夷、法国和大西洋北部的亚速尔群岛的样本序列完全一致, 共同组成了L2支系(图 3)。L2和L4两个支系间的平均遗传距离为4.4%, 大于L3和L4之间的3.1%的遗传距离(表 3)。
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| 图 3 基于全球紫杉状海门冬cox2-3基因间隔序列构建的最大似然树及支系遗传距离比较分析 Fig. 3 Maximum Likelihood (ML) tree based on the cox2-3 spacer and mean pairwise distances of intra- and between-lineages 注: 图中红色粗体代表本研究新扩增序列, 色框代表不同系群, 仅显示最大似然分析Bootstrap值≥80的节点数值 |
| 支系名称 | 支系内平均遗传距离 | 支系间平均遗传距离 | |||||
| L4 | L1 | L2 | L3 | L5 | L6 | ||
| L4 | 0.9% | ||||||
| L1 | 0.8% | 4% | |||||
| L2 | 0 | 4.4% | 1.2% | ||||
| L3 | 0.6% | 3.1% | 5.2% | 5.3% | |||
| L5 | 0.4% | 5.3% | 2.6% | 2.2% | 5.5% | ||
| L6 | 0 | 5.1% | 2.4% | 2% | 5.3% | 1.4% | |
以分布在我国南海海域的紫杉状海门冬(L4支系)为样本, 设计引物分别扩增mbb1、mbb2、mbb3和mbb4基因, 并与已公布的3个产地(澳大利亚、美国关岛和美国加利福尼亚州)的紫杉状海门冬基因组参考序列(下载于NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/?taxon=260499)中对应基因做比对分析, 结果表明4个基因的编码区与上述三者均有所差异, 相似度如表 4所示。对应的编码蛋白通过MEME进行蛋白基序组成分析, 发现来源于我国南海海域的样品虽然基因序列和蛋白序列与参考基因组有所不同, 但蛋白基序组成并无显著差异, 与来源于美国加利福尼亚的样品蛋白基序组成一致(图 4), 说明基因序列的差异并没有对蛋白功能域造成影响。
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| 图 4 全球不同地理株系的4个溴仿合成关键酶氨基酸序列蛋白基序分析 Fig. 4 Analysis of conserved protein motifs in the amino acid sequences of four key enzymes responsible for bromoform synthesis in diverse global strains |
目前, 国际上接受的海门冬属海藻物种有3个, 其中斯氏海门冬有且仅见于一次报道[21-23]。因此, 由于该物种缺少样本和文献资料, 本文不作进一步讨论。另外两个物种紫杉状海门冬和刺海门冬已见于大量报道[21-23]。二者具有较为显著的形态和生态差异特征, 其中刺海门冬分枝较短且具有鱼叉状枝, 而紫杉状海门冬分枝较长且缺乏鱼叉状枝, 刺海门冬一般分布在温带海域, 而紫杉状海门冬主要分布在热带和亚热带海域[24]。分子系统学研究结果也进一步证实了紫杉状海门冬和刺海门冬的分类学地位[8]。然而, 海门冬属海藻多样性及地理分布研究仍不均衡, 如印度-太平洋海域, 尤其是南中国海海域, 缺乏分子系统学研究, 因而无法判定该海域的物种属于何种支系, 从而影响该种海藻资源的基础生物学研究和资源开发利用。本研究对产于我国南海的海门冬属海藻开展了详细的形态学描述, 并基于分子系统发育分析证实了产于我国海南省的紫杉状海门冬属于L4支系, 比较分析了该种群和全球其他支系的亲缘关系, 并开展了该种群的溴仿合成关键酶基因克隆和比较分析。
海门冬属海藻被认为是全球100种最严重的入侵物种之一, 威胁地中海及欧洲海域生物多样性[25]。因此, 国际同行在海门冬属海藻物种鉴定和谱系地理学研究方面开展了大量研究。初期的分子系统学研究就揭示了紫杉状海门冬不同地理种群的遗传分化[21, 26]。Andreakis等[24]通过比较分析LSU、RuBisCo spacer、cox2-3 spacer等不同基因或DNA序列, 发现cox2-3 spacer变异率远远高于LSU和RuBisCo spacer, 进而通过cox2-3 spacer序列分析阐明了紫杉状海门冬较为精细的系统地理分布模式, 并划分为4个不同支系。Dijoux等[27]通过联合分析LSU、RuBisCo spacer和cox2-3 spacer基因, 发现了紫杉状海门冬第5个支系L5。现有数据表明L5支系分布具有局限性, 仅分布在南太平洋和澳大利亚西海岸。Andreakis等[28]基于cox2-3 spacer基因分析了大量澳大利亚样本, 提出了紫杉状海门冬的第6个支系L6, 并证明了L6支系和L5支系具有较近的亲缘关系。本研究使用cox2-3 spacer比较分析了我国南海紫杉状海门冬样本和全球其他海域的样本之间的系统发育关系, 证明本研究样本隶属于L4支系, 和产于夏威夷和哥斯达黎加的样本非常相近。同时还表明我国台湾存在L2支系。另外, 日本西部沿海多个地方有紫杉状海门冬分布, 且均为L2支系[29]。应当注意的是, 本次研究使用的样本仅是对我国南海的紫杉状海门冬初步调查采集, 未来有必要进一步开展系统的调查采集和谱系地理学研究, 以阐明我国紫杉状海门冬种群的多样性特征。
紫杉状海门冬不同支系的鉴定和划分具有重要的生物学意义。Clark等[30]基于COI基因和化学成分分析研究了分布于夏威夷群岛的紫杉状海门冬种群, 发现基于COI基因分析结果, 夏威夷种群分为L1、L2和L4三个支系; 代谢产物分析结果表明L4支系可显著区分于L1和L2支系, 同时还鉴定出溴碘乙酸甲酯、三溴乙酸甲酯和二溴丙酮等L4支系特有的化合物。原产于澳大利亚和新西兰的刺海门冬具有较强的入侵特性, 已在地中海和欧洲沿岸大量繁殖。紫杉状海门冬的L2和L4支系也表现出一定的入侵性。例如, 入侵地中海的紫杉状海门冬主要为L2支系, 在该海域也被称为ML2支系[8], 该支系在澳大利亚海域也已报道[28]; L4支系最早于20世纪90年代在夏威夷发现[31], 后出现在澳大利亚热带海域[28], 近期在以色列地中海海域首次发现[32]。根据DNA序列分析和地理分布情况, 全球的紫杉状海门冬种群大致3组: 第1组为具有全球广布性特点的L2和L3支系, 属于典型的由于人类活动而形成的现今分布格局; 第2组为区域性分布的L5和L6支系, 主要在澳大利亚、新喀里多尼亚、豪勋爵岛、克马德克群岛和法属波利尼西亚等南太平洋海域; 第3组为L1和L4支系, 为介于第1组和第2组之间的中间类型, 分布较为广泛, 且随着人类活动其分布范围有扩大趋势[8]。
基于分子标记而划分的紫杉状海门冬不同支系, 实质上则代表了该物种的多系性, 即可能存在未描述的新物种[23]。然而, 新物种的描述不仅需要分子数据支撑, 也需要形态学尤其是繁殖结构的发育、性状演化等方面的证据[33]。目前, 紫杉状海门冬的6个不同支系究竟是同一物种的遗传变异还是隶属于不同物种仍存有争议[23]。为了能够在形态上鉴别紫杉状海门冬的不同支系, Zanolla等[22]测量分析了大量孢子体和配子体的形态特征, 发现并探讨了几点发现: (1)顶端细胞宽度、轴细胞长度和宽度以及细胞壁厚度可辅助鉴别刺海门冬和紫杉状海门冬的体孢子体; (2)紫杉状海门冬的L1、L2和L4支系可依据孢子体的球形体直径和顶端细胞长度进行鉴别; (3)地中海海域同时存在的ML2和L3支系, 可以从丝状体的球形体直径、顶细胞长度和宽度、细胞壁厚度、轴细胞之间的距离、丝状体宽度、轴细胞大小等指标进行区分。本研究同样测量了我国南海紫杉状海门冬配子体的囊果直径和果孢子大小, 并采集了丝状孢子体宽度、顶端细胞长度和球形体直径数据。通过比较分析发现, 本研究样本的囊果直径和L3支系(L4缺乏数据)相近, 但果孢子大小明显小于L3支系。丝状孢子体的宽度和L3支系相近, 球形体直径均大于各支系, 顶细胞长度不及L3和L4支系。从以上数据可以看出同一支系的不同种群的不同指标具有差异化特征, 不同支系的样本也有相近的指标特征, 这似乎并没有明显的规律。本研究采集的数据均源自野外采集的样本, 根据经验, 室内培养的样本其形态指标会有明显变化, 如球形体直径。因此, 这些形态特征的可靠性有待进一步验证。同时, 我们认为解决紫杉状海门冬物种多样性问题有必要基于形态性状进化和系统基因组学联合分析。关键形态性状的演化过程和丰富的基因组信息有望为该类群的科学划分提供充分的证据, 如红藻门江蓠类群的系统发育关系及分类系统修订[34]。
以分布在我国南海海域的紫杉状海门冬(L4支系)为样本, 本文通过设计引物克隆了4个溴仿合成关键酶编码基因, 并与其他海域产紫杉状海门溴仿合成关键酶编码基因相似度进行了比较分析。Thapa等[12]以美国关岛和加利福尼亚沿岸采集的紫杉状海门冬样品进行了基因组测序, 鉴定了紫杉状海门冬溴仿合成关键酶-卤素过氧化物酶和能够产生活性氧自由基的NAD(P)H氧化酶。其中卤素过氧化物酶由3个基因编码3个不同的酶, NAD(P)H氧化酶由一个基因编码。四个基因相邻分布组成“海洋溴仿合成基因座(Mbb locus)”, 按顺序分别命名为mbb1, mbb2, mbb3和mbb4。Patwary等[35]以澳大利亚的阳光海岸的紫杉状海门冬为材料, 又完成了较高质量的基因组参考序列测定。然而, 由已知的不同海域分布的紫杉状海门冬基因组信息可知, 编码溴仿合成关键酶的基因序列并不完全相同。PAP2(type 2 phosphatidic acid phosphatase family)是钒依赖卤素过氧化物酶的保守结构域, 其中有9个氨基酸位点是与钒结合的活性位点[36]。我国南海产的L4支系样本mbb1基因的SNP位点有3个位于PAP2结构域内, 但均没有位于9个活性位点上。蛋白基序组成分析显示, 与美国加利福尼亚和澳大利亚来源的样品相比, 我国南海L4支系样本海门冬溴仿合成关键酶的结构域并无显著差异, 但以上4个基因中存在的SNP相应的氨基酸的差异对其酶活性和功能是否有影响, 以及影响大小还需要进一步研究。
4 结论本研究详细描述了我国南海产紫杉状海门冬的配子体和孢子体形态特征, 证明了我国南海产紫杉状海门冬种群为L4支系, 以我国L4支系样本扩增的溴仿合成关键酶基因表现出一定的独特性。本研究结果为深入开展我国紫杉状海门冬相关研究及资源开发利用提供了基础数据。
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